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1、10申请公布号CN104152429A43申请公布日20141119CN104152429A21申请号201310178561622申请日20130515CGMCCNO746720130412C12N9/56200601C12N1/20200601C12R1/12520060171申请人亚宝药业集团股份有限公司地址044600山西省运城市芮城县富民路43号72发明人戴东升王星星杨仁佳安俊郑慧周鹏姚振芳王斐陈婧禹玉洪任武贤54发明名称纳豆激酶高产枯草芽孢杆菌株的筛选及液态发酵的方法57摘要本发明涉及生物技术领域中一种纳豆激酶高产枯草芽孢杆菌株筛选及液态发酵的方法。该发明筛选出一株纳豆激酶高产菌株。
2、YBNK1，经广东省微生物分析检测中心检测为枯草芽孢杆菌，检测报告编号为粤微检2012ZD0175。经液态发酵配方及发酵工艺优化，所得平均纳豆激酶活性为每毫升2000尿激酶活性以上。为纳豆激酶产业化生产奠定了基础。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书4页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图3页10申请公布号CN104152429ACN104152429A1/1页21一种用于纳豆激酶液态发酵的发酵培养基，其包括大豆蛋白胨，可溶性淀粉，NA2HPO412H2O，KH2PO4，CACL2，MGSO47H2O。2根据权利要求1所述的发酵培养。
3、基，其包括大豆蛋白胨1025，可溶性淀粉204，NA2HPO412H2O0405，KH2PO4015025，CACL2001003，MGSO47H2O005007。3一种纳豆激酶液态发酵的方法，包括以下步聚取保存于固体培养基上的菌种，接种在种子培养基中PH优选为6872，恒温培养优选1014小时，之后接种到如权利要求1或2中的发酵培养基中进行发酵。4根据权利要求3所述的方法，其中接种量为210，优选24。5根据权利要求3所述的方法，其中所述的菌种是经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，保藏号为7467。6根据权利要求3所述的方法，其中所述发酵是在发酵罐中进行。7根据权利要。
4、求6所述的方法，其中搅拌速度随着发酵时间的延长而增大，优选搅拌速度从300RPM提高到700RPM，更优选从320RPM提高到700RPM。8根据权利要求6或7所述的方法，发酵罐装液量为5070，接种量为24，通气量为0508VVM，培养PH为6971以氨水和乙酸调节PH，温度为3537，整个发酵周期为2832小时。9一种枯草芽孢杆菌，该菌株经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，保藏号为7467。权利要求书CN104152429A1/4页3纳豆激酶高产枯草芽孢杆菌株的筛选及液态发酵的方法技术领域0001本发明涉及生物技术领域中一种纳豆激酶高产枯草芽孢杆菌株筛选及液态发酵的。
5、方法。背景技术0002今后30年，我国老年人口将越来越多，老年人的身体健康问题越来越受到人们的关注和重视。心脑血管栓塞性疾病是危害老年人健康最严重而又常见的疾病之一。目前，血栓症已逐渐成为死亡率最高的疾病之一，而溶解血栓是治疗这一类疾病的一种重要手段。因此，对溶栓药物的研究已被广为重视。当前作为第一代溶栓药物链激酶SK、尿激酶UK在临床上广为应用，但它们均为激活人体内血液中血纤维酶原，从而降解纤维蛋白，容易引起全身性纤溶激活并伴有出血倾向。同时SK还具有抗原性并有过敏性反应。而作为第二代纤溶药物的TPA尽管对纤维蛋白有很高的选择性，但临床上为了取得较好的溶栓效果而应用大剂量100MG从而部分失。
6、去了对纤维蛋白的选择性，因此依旧会导致出血等副作用，并且具有纤维蛋白特异性差、体内半衰期短、生产成本高、需大剂量连续用药等缺点。鉴于此，开发新型溶栓药物已成为重要的研究热点之一。目前，纳豆激酶NK作为来自于食品、高效安全并可直接由消化道吸收、起到溶解纤维蛋白作用的纤溶酶，具有安全性好，体内作用时间长，药效时间长等优点。正在成为当今溶栓药研究的焦点。0003当今影响纳豆激酶产业化的最主要原因是，生产成本高，生产周期长。因此筛选出一株高产纳豆激酶的菌株，以及建立一种合适的发酵工艺，对纳豆激酶的产业化具有重要意义。发明内容0004本发明提供一种用于纳豆激酶液态发酵的发酵培养基，其包括大豆蛋白胨，可溶。
7、性淀粉，NA2HPO412H2O，KH2PO4，CACL2，MGSO47H2O。0005根据本发明，所述发酵培养基包括大豆蛋白胨1025，可溶性淀粉204，NA2HPO412H2O0405，KH2PO4015025，CACL2001003，MGSO47H2O005007。0006本发明还提供一种纳豆激酶液态发酵的方法，其特征在于，所述方法包括以下步聚00071取保存于固体培养基上的菌种优选半环，接种在种子培养基中PH优选为6872，00082恒温培养优选1014小时，之后接种到所述发酵培养基中进行发酵。0009根据本发明，步骤1在已消毒的超净工作台上进行。0010根据本发明，其中接种到发酵培养。
8、基中的接种量为210，优选24。0011根据本发明，步骤1所述接种在种子培养基中的操作条件优选的温度为3437，优选的转速为160300RPM。0012根据本发明，步骤2中的发酵为液态发酵，优选上述液态发酵可以在摇瓶中发说明书CN104152429A2/4页4酵，也可以在发酵罐中发酵，例如5L的发酵罐。0013根据本发明，在摇瓶中发酵，培养基PH优选为6971，温度优选3318，160RPM恒温培养4854小时。0014根据本发明，在发酵罐中发酵，采取随着发酵罐的溶解氧DO的变化而提高发酵罐搅拌子的转速，即随着发酵时间的延长而调大搅拌速度，优选搅拌速度从300RPM提高到700RPM，更优选从。
9、320RPM提高到700RPM。0015根据本发明，在发酵罐中发酵，发酵罐装液量为5070，接种量为24，通气量为0508VVM，培养PH为6971以氨水和乙酸调节PH，温度为3537，整个发酵周期为2832小时。0016根据本发明，所述种子培养基为营养肉汤培养基，包括蛋白胨10，牛肉膏05，NACL05，PH值70，或者在其中加入一些缓冲液成份。0017本发明还提供一种高产纳豆激酶的芽孢枯草杆菌株YBNK1，经广东省微生物分析检测中心鉴定为枯草芽孢杆菌，检测报告编号为粤微检2012ZD0175。0018上述菌株经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，地址北京市朝阳区北辰西。
10、路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2013年04月12日，保藏号为CGMCCNO7467，确定为枯草芽孢杆菌，BACILLUSSUBTILIS。0019本发明还提供了一种所述高产菌株的筛选方法通过划线反复纯化及紫外诱变，从市售纳豆中纯化出8株纳豆菌，选择经纤维平板检测活性最强的菌株YBNK1。0020该技术方案的优点0021本技术方案所用的纳豆菌种经发酵罐液态发酵后，所得纳豆激酶活性达到每毫升18002100尿激酶单位。经过多批次发酵试验，本技术方案具有操作简单，原料易得，发酵周期短，酶活高，满足产业化生产的要求。附图说明0022图1为不同时间点纳豆激酶在两种碳源SDSPAGE检测。
11、结果。0023图2为纳豆激酶溶圈法检测菌种在两种碳源培养基中活性检测结果DF可溶性淀粉；PT葡萄糖。0024图3为种龄为9/10/11纳豆激酶在4葡萄糖和4可溶性淀粉的发酵培养基中表达0025SDSPAGE检测结果DF可溶性淀粉；PTT葡萄糖。0026图4为种龄为9/10/11纳豆激酶在4葡萄糖的发酵培养基中溶圈法活性检测结果DF可溶性淀粉；PTT葡萄糖。0027图5为种龄为9/10/11纳豆激酶在4可溶性淀粉的发酵培养基中溶圈法活性检测结果DF可溶性淀粉；PTT葡萄糖。具体实施方式0028斜面培养基的配方蛋白胨10，牛肉膏05，NACL05，琼脂2，PH值70。0029发酵培养基蛋白胨10，。
12、可溶性淀粉20，NA2HPO412H2O04，KH2PO4015，CACL2001，MGSO47H2O005。说明书CN104152429A3/4页50030种子培养基蛋白胨10，牛肉膏10，NACL10，PH值70，121下灭菌20MIN。0031实施例1高产菌株的筛选00321在已消毒的超净工作台中，取高纯度纳豆素胶囊，溶于已灭菌的10ML种子培养基中，待其充分溶解后，取200L接种到30ML/250ML三角瓶中；00332160RPM，35恒温振荡培养；00343培养10H后，在已灭菌的超净工作台中，取100L菌液，涂平板；0035倒置平板，35恒温培养；0036435恒温培养24H，挑。
13、取长势良好的单菌落，接种到已灭菌30ML/250ML三角瓶种子培养基中；00375以3V/V接种量接种到已灭菌的30ML/250ML三角瓶发酵培养基中；0038635，160RPM恒温振荡培养，在不同的时间点取样，检测纳豆激酶表达情况。0039实施例2纳豆激酶高产菌株在不同碳源中表达的情况00401在已消毒的超净工作台中，取上述筛选的纳豆菌高产菌株，接种到已灭菌的30ML/250ML三角瓶种子培养集中；0041235，160RPM，培养8H后，以3接种量分别接种到已灭菌的碳源为葡萄糖、可溶性淀粉的发酵培养基中；0042335，160RPM恒温振荡培养；00434每隔一段时间取样，待用。0044。
14、结果如下0045由图1、图2可知纳豆激酶在以淀粉为碳源的发酵培养基中，标准曲线为Y02724X14852R20983，最大活性为693U/ML，此时的碳源是可溶性淀粉。0046实施例3纳豆激酶高产菌株不同种龄菌种在4可溶性淀粉基础发酵培养基中表达情况00471在已消毒的超净工作台中，取上述筛选的纳豆菌高产菌株，接种到已灭菌的30ML/250ML三角瓶种子培养基中；0048235，160RPM，培养9H，10H，11H后，以3接种量分别接种到已灭菌的碳源为4可溶性淀粉和4葡萄糖的发酵培养基中；0049335，160RPM恒温振荡培养；00504每隔一段时间取样，待用。0051由图3、图4、图5可。
15、知，种龄为10H，在表达后48H活性能接近2000U/ML，并且进一步说明以可溶性淀粉作为碳源比以葡萄糖作为碳源更有利于纳豆激酶的表达。0052实施例4纳豆激酶500ML摇瓶试验0053取保存于斜面培养基上的YBNK1菌种，接种于30毫升种子培养基中。37恒温160200RPM培养12小时，以3接种量V/V接入装有60ML发酵培养基的500ML三角瓶中，160RPM恒温培养4854小时。平均酶活达每毫升2000尿激酶单位。0054实施例5纳豆激酶在5L发酵罐中的表达情况0055取保存于斜面培养基上的YBNK1菌种，接种于30毫升种子培养基中。37恒温160200RPM培养12小时。5L发酵罐中装入3L发酵培养基，121灭菌20分钟，搅拌转速说明书CN104152429A4/4页6为300RPM，通气量为05VVM，发酵罐温度降至37时，用氨水调PH为70，然后以3V/V接种量，将菌种接种到发酵培养基中，发酵周期为2832小时，其中搅拌速度随着发酵时间的延长而增大，从初始搅拌速度为300RPM增加到700RPM。所得纳豆激酶的平均活性为每毫升2000尿激酶单位。说明书CN104152429A1/3页7图1图2说明书附图CN104152429A2/3页8图3图4说明书附图CN104152429A3/3页9图5说明书附图CN104152429A。