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1、10申请公布号CN104151432A43申请公布日20141119CN104151432A21申请号201310178116X22申请日20130514C07K19/00200601C12N15/62200601A61K38/17200601A61P35/0020060171申请人中国医学科学院医药生物技术研究所地址100050北京市崇文区天坛西里1号72发明人刘文娟甄永苏刘秀均李毅张胜华74专利代理机构北京瑞恒信达知识产权代理事务所普通合伙11382代理人李渤张伟54发明名称一种抗肿瘤融合蛋白、其编码基因和用途57摘要本发明提供一种抗肿瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构EG。
2、FR特异性靶向寡肽连接肽1力达霉素辅基蛋白连接肽2促吞噬肽N；其中，所述EGFR特异性靶向寡肽具有SEQIDNO1所示的氨基酸序列，所述力达霉素辅基蛋白具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列，所述促吞噬肽具有SEQIDNO3所示的氨基酸序列，并且N13。该融合蛋白为靶向EGFR且含有LDP和TUFTSIN的新型蛋白，不仅保留TUFTSIN的促吞噬作用，而且具有靶向性，在动物体内具有良好的抗肿瘤效果。本发明还提供了该融合蛋白的编码基因、与力达霉素发色团组装的强化融合蛋白以及它们的制药用途。51INTCL权利要求书1页说明书11页序列表9页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利。
3、要求书1页说明书11页序列表9页附图6页10申请公布号CN104151432ACN104151432A1/1页21一种抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构EGFR特异性靶向寡肽连接肽1力达霉素辅基蛋白连接肽2促吞噬肽N；其中，所述EGFR特异性靶向寡肽具有SEQIDNO1所示的氨基酸序列，所述力达霉素辅基蛋白具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列，所述促吞噬肽具有SEQIDNO3所示的氨基酸序列；并且，N13。2根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽1为GGGGS2；所述连接肽2为GGGGS2。3根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，N1，所述。
4、融合蛋白具有SEQIDNO4所示的氨基酸序列；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO4或SEQIDNO5所示。4根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，N2，所述融合蛋白具有SEQIDNO13所示的氨基酸序列；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO13所示。5根据权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白的编码基因。6根据权利要求5所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因具有SEQIDNO6所示的核苷酸序列；优选地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO6或SEQIDNO7所示。7一种抗肿瘤强化融合蛋白，其特征在于，所述强化融合蛋白为根据权利要求1至4中任一项所述的融合蛋。
5、白与力达霉素发色团组装而成。8根据权利要求7所述的强化融合蛋白，其特征在于，所述强化融合蛋白通过包括以下步骤的方法组装而成将根据权利要求1或2所述的融合蛋白与力达霉素发色团以13的分子比混合，于4下避光缓慢晃动反应1216个小时。9一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述药物以根据权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白和/或根据权利要求7或8所述的强化融合蛋白为活性成分。10根据权利要求9所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防鳞癌、肺癌或乳腺癌，优选鳞癌。11根据权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求7或8所述的强化融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。12根据权利要求11所。
6、述的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防鳞癌、肺癌或乳腺癌，优选鳞癌。权利要求书CN104151432A1/11页3一种抗肿瘤融合蛋白、其编码基因和用途技术领域0001本发明属于药用蛋白技术领域。具体而言，本发明涉及一种抗肿瘤融合蛋白、其编码基因、以该融合蛋白为活性成分的药物以及其制药用途。背景技术0002表皮生长因子受体（EGFR）异常表达是多种上皮来源的肿瘤细胞的重要特性，因此EGFR已成为肿瘤靶向性治疗的理想靶点。但是，抗EGFR的抗体分子量大、免疫原性强，难以穿透到实体肿瘤的内部，而EGFR的小分子酪氨酸抑制剂虽然组织扩散和穿透力强、低免疫原性，但是一般和细胞毒药物一起使用。。
7、0003促吞噬肽（TUFTSIN）由NAJJAR等人于1970年在美国TUFTS大学首次发现，并因此而得名。它是一种促进巨噬细胞吞噬作用的人体自然存在的活性物质，位于IGG重链FC段CH2区域残基289292部分，分子量为500KD。吞噬细胞、巨噬细胞和单核细胞等免疫细胞的细胞膜上都含有TUFTSIN的特异性受体，当该特异性受体与TUFTSIN结合后，这些细胞即可发挥其吞噬、杀菌和抗肿瘤及其它活性作用。动物体内实验证明，移植了白血病细胞的动物在注射TUFTSIN后，其移植性肿瘤的发生延迟，发生率降低，并且实验动物的寿命得到延长。此外，TUFTSIN脂质体药物载体能够增强抗肿瘤药物的抑制肿瘤细胞。
8、增殖的作用。进一步研究还指出，TUFTSIN及其同系物具有选择性的抗肿瘤活性，并且可能通过抑制DNA拓扑异构酶的活性发挥其抗肿瘤的作用。并且，在临床检测中发现，TUFTSIN可以促进白细胞肿瘤细胞吞噬，且如将其标记微颗粒的表面可以用来抗炎症治疗。然而遗憾的是，促吞噬肽（TUFTSIN）分子活性功能基团还存在争议其活性基团主要为氮端的赖氨酸NH2及碳端的COOH，到底是那个基团起主要的活性作用还未研究清楚。因此将促吞噬肽（TUFTSIN）作为效应分子时，为了保护这两个基团或修饰这两个基团，主要采用了化学合成促吞噬肽（TUFTSIN）化合物的方式。但是，在化学合成时，副产物太多，主产物不易获得和纯。
9、化，并且难大量生产。此外，已知促吞噬肽（TUFTSIN）分子的分子量太小，对肿瘤细胞没有结合能力，动物实验大量使用时有一定的毒性。0004力达霉素（LDM）是由1个辅基蛋白（LIDAMYCINAPOPROTEIN，LDP）和1个发色团（ACTIVEENEDIYNECHROMOPHORE，AE）组成的一种烯二炔类抗肿瘤抗生素，可以作为弹头药物。其中，发色团是活性部分，含有一个九元环烯二炔核心结构，分子量为843DA；辅基蛋白起保护发色团的作用，由110个氨基酸组成，分子量为10506DA，并且这两个部分可以拆分。研究发现，LDP本身在体内具有中等程度的抗肿瘤作用，并且由于其具有独特的分子结构，可。
10、以作为开发新型抗肿瘤药物的支架载体。0005基于上述现有技术状况，可以考虑以力达霉素辅基蛋白为支架载体，构建具有EGFR特异性的、基于促吞噬肽的抗肿瘤融合蛋白。发明内容0006基于上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种以LDP为支架具有靶向EGFR的说明书CN104151432A2/11页4促吞噬肽的融合蛋白，该融合蛋白为具有抗肿瘤作用的小分子药用蛋白。0007本发明的另一个目的是提供该融合蛋白的编码基因。0008由于力达霉素具有可拆分和组装的特性，本发明还提供一种与发色团组装的强化融合蛋白。0009本发明的还一个目的是提供以上述融合蛋白为活性成分的药物以及上述融合蛋白的制药用途。0010本。
11、发明通过以下技术方案实现上述目的0011迄今为止，在国外文献报道的相关促吞噬肽（TUFTSIN）化合物抗肿瘤的研究中，促吞噬肽（TUFTSIN）化合物都是通过化学合成获得的。其原因在于，促吞噬肽（TUFTSIN）分子量太小，无法通过基因工程的方法构建载体和表达。这给促吞噬肽的应用带来了一定的困难。对此，本发明人通过基因工程技术构建了以LDP为支架具有靶向EGFR的促吞噬肽融合蛋白（本文命名为ETTUFTSIN或ETTUFTSINTUFTSIN）重组载体，将其转化到工程菌BL21STARTMDE3中表达，并经纯化获得了一种多功能的具有抗肿瘤作用的小分子药用蛋白。其中，除表达的蛋白含促吞噬肽之外，。
12、关于EGFR靶向性则选取了与EGFR受体结合的EGF重要结构C环，其上22个氨基酸残基作为导向分子，由此形成的小分子也更容易穿透组织，到达实体肿瘤的更深部。此外，因力达霉素具有可拆分和组装的特性，本发明人还成功组装了一种新的双弹头强化融合蛋白（本文命名为ETTUFTSINAE）。体内体外试验证实，经抗肿瘤作用得到进一步加强。0012因此，一方面，本发明提供一种抗肿瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构0013EGFR特异性靶向寡肽连接肽1力达霉素辅基蛋白连接肽2促吞噬肽N；0014其中，所述EGFR特异性靶向寡肽具有SEQIDNO1所示的氨基酸序列，共22个氨基酸；所述力达霉素辅基。
13、蛋白具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列，共110个氨基酸；所述促吞噬肽具有SEQIDNO3所示的氨基酸序列，共4个氨基酸；并且，N13。0015在该融合蛋白中，连接EGFR特异性靶向寡肽与力达霉素辅基蛋白的连接肽1与连接力达霉素辅基蛋白与促吞噬肽的连接肽2可以相同或不同。优选地，所述连接肽1为GGGGS2，所述连接肽2为GGGGS2。选择GGGGS2作为连接肽的原因在于，一方面利于在工程菌如大肠杆菌中表达；另一方面，连接肽太短，刚性大，不利于蛋白分子伸展，容易造成蛋白分子构想相互遮掩，影响蛋白功能，并且力达辅基蛋白（LDP）支架分子共110个氨基酸，具有螺旋和折叠，结构复杂，分子量比较大，因。
14、此，选用GGGGS2。0016优选地，N1，所述融合蛋白具有SEQIDNO4所示的氨基酸序列；0017进一步优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO4所示或SEQIDNO5。0018SEQIDNO4为本发明提供的一个具体融合蛋白的氨基酸序列，共156个氨基酸。从氨基端至羧基端，该融合蛋白包括EGFR特异性靶向寡肽（EC），共22个氨基酸；连接肽1，为GGGGS2柔性肽，共10个氨基酸；力达霉素辅基蛋白（LDP），共110个氨基酸；连接肽2，为GGGGS2柔性肽，共10个氨基酸；促吞噬肽（TUFTSIN，TF），共4个氨基酸。0019SEQIDNO5为本发明提供的一个具体融合蛋白的氨基酸。
15、序列，共166个氨基酸。相比于SEQIDNO4，该融合蛋白在EGFR特异性靶向寡肽之前具有MET和ALA，在促吞噬肽的C端具有LEU和GLU以及HIS6标签。说明书CN104151432A3/11页50020或者，N2，所述融合蛋白具有SEQIDNO13所示的氨基酸序列；0021优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO13所示。0022SEQIDNO13为本发明提供的一个具体融合蛋白的氨基酸序列，共160个氨基酸。相比于SEQIDNO4，该融合蛋白在羧基端具有连续的2个促吞噬肽。0023另一方面，本发明提供上述融合蛋白的编码基因。0024优选地，所述编码基因具有SEQIDNO6所示的核。
16、苷酸序列；0025优选地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO6或SEQIDNO7所示。0026再一方面，本发明提供一种抗肿瘤强化融合蛋白，所述强化融合蛋白为本发明的上述融合蛋白与力达霉素发色团组装而成。0027根据本发明的具体实施方式，所述强化融合蛋白通过包括以下步骤的方法组装而成将本发明提供的上述融合蛋白与力达霉素发色团以13的分子比混合，于4下避光缓慢晃动反应1216个小时。反应接受后，去除多余发色团，得到组装成功的强化融合蛋白。具体而言，所述强化融合蛋白通过包括以下步骤的方法组装而成取高活性的力达霉素纯品，经C4柱分离活性发色团，流动相为水乙腈三氟乙酸（7822005，体积比），监。
17、测350NM处的吸光值，以收集发色团；将本发明提供的上述融合蛋白与力达霉素发色团以13的分子比混合，置于摇床上缓慢晃动，4下避光反应1216小时；将二者的混合液经SEPHADEXG75柱除去未包装上的发色团，HPLC（C4300A柱）检测350NM处的吸光值，观察发色团与融合蛋白是否组装成功。0028另一方面，本发明还提供一种抗肿瘤药物，所述药物以本发明提供的上述融合蛋白和/或强化融合蛋白为活性成分。优选地，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防鳞癌、肺癌或乳腺癌，优选鳞癌。0029又一方面，本发明还提供上述融合蛋白或强化融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。优选地，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防鳞癌、肺癌或。
18、乳腺癌，优选鳞癌。0030综上，本发明应用基因工程的方法提供了一种新型的具有特异性、靶向性的融合蛋白。该融合蛋白为靶向EGFR（表皮生长因子受体）、且含有LDP和TUFTSIN的新型蛋白。该融合蛋白不仅保留TUFTSIN的促吞噬作用，而且具有靶向性，在动物体内具有良好的抗肿瘤效果。此外，由于该融合蛋白含有LDP作为支架，可以组装抗肿瘤抗生素力达霉素的烯二炔发色团AE，从而进一步提高了抗肿瘤疗效。并且实验证明，与现有融合蛋白相比，本发明的融合蛋白具有抑瘤效果更佳的优点。附图说明0031以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中0032图1示出了重组表达质粒PET30ETTUFTSIN的构建。。
19、0033图2示出了重组菌表达产物ETTUFTSIN融合蛋白的检测结果。其中0034图2A为ETTUFTSIN融合蛋白定位分析的电泳图谱，1蛋白分子量标准，2IPTG诱导全菌组分，3上清组分，4周质腔组分，5细胞质可溶组分，6包涵体组分；0035图2B为ETTUFTSIN融合蛋白纯化后的SDSPAGE和WESTERNBLOT结果，1蛋白分子量标准，2、3纯化ETTUFTSIN蛋白，4、5ETTUFTSIN融合蛋白WESTERNBLOT结果；0036图2C为HLPC检测ETTUFTSIN融合蛋白的纯度结果。说明书CN104151432A4/11页60037图3示出了ETTUFTSIN融合蛋白体外结。
20、合能力的分析结果。其中0038图3A和3B为不同肿瘤细胞及J774A1中EGFR表达量的WESTERNBLOT检测结果；0039图3C为A431细胞中ETTUFTSIN融合蛋白ELISA免疫活性分析结果；0040图3D为J774A1细胞中ETTUFTSIN融合蛋白ELISA免疫活性分析结果。0041图4示出了细胞免疫荧光检测ETTUFTSIN融合蛋白与肿瘤细胞结合结果（TRITC标记羊抗鼠IGG染色）。其中，图4A为A431细胞，图4B为A549细胞，图4C为MCF7细胞，图4D为SKBR3细胞。0042图5示出了细胞免疫荧光分析融合蛋白ETTUFTSIN和蛋白LDP分别与A431细胞的结合活。
21、性结果。其中0043图5A5C为融合蛋白ETTUFTSIN作用于A431细胞5A，细胞核DAPI着色图片；5B，细胞膜着色图片；5C，细胞核和细胞膜着色图片；0044图5D5F为蛋白LDP作用于A431细胞5D，细胞核DAPI着色图片；5E，细胞膜着色图片；5F，细胞核和细胞膜着色图片。0045图6示出了ETTUFTSIN融合蛋白的体外吞噬活性分析结果。其中0046图6A为ETTUFTSIN融合蛋白作用于J774A1细胞；0047图6B为LDP蛋白作用于J774A1细胞；0048图6C为采用流式细胞仪分析融合蛋白ETTUFTSIN和蛋白LDP促小鼠巨噬细胞J774A1的吞噬活性结果。0049图。
22、7示出了融合蛋白ETTUFTSIN和LDP、TUFTSIN对肿瘤细胞的抑制率比较结果。0050图8示出了高效液相色谱法鉴定的强化融合蛋白ETTUFTSINAE的分子组装结果。其中1、3杂蛋白吸收峰；2融合蛋白吸收峰；4发色团吸收峰。具体实施方式0051以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。0052下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。0053实施例1重组表达载体PET30ETTUFTSIN的构建0054本实施例中使用的重组质粒PE。
23、L含有EGFR寡肽配体EC基因和LDP基因，构建方法及其图谱参见郭晓芳，“靶向表皮生长因子受体的寡肽与力达霉素强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性”，癌症，2009，28（6）561568。大肠杆菌感受态DH5为北京全式金生物科技公司产品，PET30A为NOVAGEN公司699093的产品，PCR引物由英维杰基上海公司合成。0055构建重组载体PET30ETTUFTSIN需要3条引物0056E1（SEQIDNO8）5GCCATATGAAATACCTGCTGCCGACC3（下划线为NDEI酶切位点）0057P2（SEQIDNO9）5GCCGAAGGTCAGAGCCACGTG30058T2（SEQID。
24、NO10）5GCCTCGAGACGCGGCTTGGTTGAACCGCCTCCACC说明书CN104151432A5/11页7TGAACCGCCTCCACCGCCGAAGGTCAGAGCCAC3（下划线为XHOI酶切位点）0059以重组质粒PEL为模板，采用引物E1和P2进行常规PCR反应94预变性3分钟，然后94变性30秒，56退火30秒，72延伸45秒，进行30个循环的扩增反应，最后72延伸10分钟。反应体系含00600061产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用OMEGA公司凝胶回收试剂盒回收501BP的基因片段，该基因片段带有信号肽，命名为ECLDP（SEQIDNO11）。0062以ECLDP为模。
25、板，引物E1和T2进行PCR反应，采用的PCR反应条件为94预变性3分钟，然后94变性50秒，55退火50秒，72延伸50秒，进行30个循环的扩增反应，最后72延伸8分钟。反应体系含006300640065将得到的基因片段命名为ETTUFTSIN基因（SEQIDNO7）。0066ETTUFTSIN基因包括4部分，从5端到3端依次为NDEI酶切位点（6BP）、PELB信号肽的编码序列（69BP）、EC的编码序列（66BP）、柔性肽GGGGS2的编码序列（30BP）、LDP的编码序列（330BP）、柔性肽GGGGS2的编码序列（30BP）、TUFTSIN的编码序列（12BP）、XHOI酶切位点（6。
26、BP），共549BP。其中PELB信号肽的作用是促使融合蛋白在细菌的周质腔中表达，之后将被周质腔中的信号肽酶切除，只保留末端的丙氨酸和甲硫氨酸。0067分别用NDEI和XHOI双酶切ETTUFTSIN基因和PET30A（）载体，然后连接，得到重组表达载体，命名为PET30ETTUFTSIN，并转化至大肠杆菌DH5，挑选出阳性克隆进行测序，质粒构建流程见图1。结果表明，酶切结果和测序结果与预期完全一致。0068在得到的重组质粒PET30ETTUFTSIN中，在促吞噬肽编码序列的3末端有XHOI酶切位点，并且PET30A（）载体含有组氨酸标签（6个氨基酸，HISTAG标签），使得该重组质粒PET3。
27、0ETTUFTSIN在表达融合蛋白时使蛋白含有HISTAG标签，以便于纯化和鉴定。0069实施例2融合蛋白ETTUFTSIN在大肠杆菌中的表达和纯化0070本发明使用的大肠杆菌菌株BL21STARTMDE3是NOVAGEN公司的产品。说明书CN104151432A6/11页80071将实施例1中构建的重组表达载体PET30ETTUFTSIN转化至大肠杆菌BL21中，挑取阳性单克隆接种LB培养基（卡那霉素50G/ML），37下过夜培养。送去测序，选取测序和酶切结果正确的阳性菌株80下保存。0072将该阳性单克隆接种5MLLB培养基，37下过夜培养，当OD1020时，加入1MMOL/LIPTG，诱。
28、导8H，按照PET系统操作手册（NOVAGEN公司）对培养液上清液、周质腔、细胞质可溶以及不可溶组分进行分析。融合蛋白ETTUFTSIN分子量大小为163KD。发现，经12SDSPAGE电泳分析，ETTUFTSIN蛋白主要定位于周质腔中（图2A），分子量大小与预期相符。对影响蛋白表达产量的各个条件进行了优化，最终确定表达条件为温度37、菌体起始密度A60010、IPTG浓度为01MMOL/L、诱导时间为8H。0073融合蛋白是可溶性的，不需经过复性，可经过高渗、低渗处理后释放出来，并且融合蛋白ETTUFTSIN在碳末端带有HISTAG标签，因此采用GE公司的HISTAG5ML的镍柱，按试剂盒说。
29、明书进行NI2亲和色谱纯化。用不同浓度的咪唑将蛋白提纯，咪唑的浓度分别为20MM、50MM、70MM、100MM和250MM，250MM咪唑洗下的蛋白经12SDSPAGE电泳分析鉴定为目的蛋白ETTUFTSIN（图2B），分子量大小与预期相符。HPLC检测其纯度达到了902（图2C），产量为每升发酵液大概获得6MG的活性蛋白。0074得到的融合蛋白ETTUFTSIN的氨基酸序列如SEQIDNO5所示。0075实施例3融合蛋白ETTUFTSIN体外细胞结合活性测定0076实验（一）0077将对数生长期的人皮肤鳞癌细胞A431和小鼠巨噬细胞J774A1用预冷的PBS洗涤2次，用胰酶消化细胞，再用P。
30、BS洗涤2次，加入适量细胞裂解液（北京宝赛生物技术公司），冰上裂解10分钟。之后于4，10,000RPM下离心30分钟，收集上清液。0078用BCA试剂盒进行融合蛋白ETTUFTSIN定量，取100G蛋白与适量5上样缓冲液混合，沸水浴中变性5分钟，80保存备用。0079WESTERNBLOT检测肿瘤细胞EGFR的表达水平，结果显示A431为EGFR高表达细胞株，而J774A1检测不到EGFR的表达（图3A）。0080相同的方法处理人皮肤鳞癌细胞A431、小鼠巨噬细胞J774A1、人肺癌细胞A549、人肺癌细胞H460、人乳腺癌细胞MCF7和SKBR3，用BCA试剂盒进行融合蛋白ETTUFTSI。
31、N定量，取20G蛋白与适量5上样缓冲液混合，沸水浴中变性5分钟，80保存备用。0081WESTERNBLOT检测肿瘤细胞EGFR的表达水平，结果显示A431为EGFR高表达细胞株，而A549中表达EGFR，MCF7和SKBR3表达EGFR较少，J774A1和H460不表达EGFR（图3B）。0082以酶联免疫吸附分析方法（ELISA）检测融合蛋白的免疫原性。将A431和J774A1细胞于96孔板每孔接种1104个细胞，37下培养24小时后用PBS洗3次，加入4预冷的005戊二醛（100L/孔），于4固定细胞30分钟。固定好的细胞用PBS洗3次后，用3BSA溶液于4下封闭过夜，然后用PBST缓冲。
32、液（PBS中含有005的TWEEN20）洗3次。将融合蛋白ETTUFTSIN倍比稀释加入到96孔板中，每个浓度设3个平行孔，37下温育2小时。用PBST洗3次后，加入抗HISTAG单克隆抗体（12500稀释），37下温育2小时。用PBST洗板3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IGG抗体（12500稀释），37下温育2小时。用PBST洗板5次，加入TMB底物反应液（北京天根公司）（100L/孔），室温避光说明书CN104151432A7/11页9反应1030分钟。以2MOL/L的硫酸每孔100L终止反应，立即在酶标仪上测定450NM处的吸光值。结果表明，融合蛋白ETTUFTSIN对A431细胞。
33、的反应均呈阳性（图3C），J774A1细胞表面具有TUFTSIN的专一受体，ETTUFTSIN对其的反应也呈阳性（图3D）。0083实验（二）0084采用细胞免疫荧光法分析融合蛋白ETTUFTSIN与EGFR不同表达的A431、A549、SKBR3和SW1990细胞的结合活性。0085将这四种肿瘤细胞以5104个细胞/孔的密度接种到六孔板中，37下培养24小时后用PBS洗3次，加入70甲醇于置于0下固定20分钟，PBS洗3次。加入融合蛋白ETTUFTSIN（100M/孔），于室温下孵育2小时或于4下过夜，然后PBS洗3次。加入11000稀释的抗HISTAG抗体，室温下反应2小时，PBS洗3次。。
34、加入150稀释的TRITC标记羊抗鼠IGG（中杉金桥公司），室温下避光反应1小时，PBS洗3次。加入1100稀释的DAPI（1MG/ML），室温下避光反应15分钟。PBS洗3次后于荧光显微镜下观察并照相。结果如图所示，在这四种细胞细胞膜上均可观察到红色荧光，只是荧光强度不同，表明ETTUFTSIN蛋白可以与表达EGFR受体的肿瘤细胞的细胞膜结合（图4）。0086实验（三）0087细胞免疫荧光法分析比较融合蛋白ETTUFTSIN和蛋白LDP分别与A431细胞（EGFR高表达）结合能力的差异。结果表明，融合蛋白ETTUFTSIN可以与A431细胞膜上的受体结合（图5A、5B和5C），而LDP蛋白不。
35、能与A431细胞细胞膜上的EGFR受体结合（图5D、5E和5F）。0088实施例4融合蛋白ETTUFTSIN体外吞噬实验0089将J774A1以5104个细胞/孔接种于24孔组织培养板，37下过夜培养。PBS洗3遍，无血清培养基培养2H。取三个孔，每孔都加入25MFITC标记的BSA，然后一个为对照孔（BSA），另外两孔分别加入LDP和ETTUFTSIN（10M/孔），37下培养2H，于显微镜下观察并照相。结果显示，融合蛋白ETTUFTSIN作用过的细胞（图6A），与LDP作用过的细胞相比（图6B），吞噬作用增强。0090取对数生长期的J774A1细胞以浓度为5105个细胞/孔接种24孔组织培。
36、养板，37下过夜培养。用PBS洗涤细胞3次，温孵2小时。取三个孔，每孔都加入10MFITC标记的BSA，然后一个为对照孔（只含有FITC标记的BSA），另外两孔分别加入LDP（20M/孔）和ETTUFTSIN（20M/孔），每孔分别重复三次。37下反应2小时以上加入1ML用PBS配制的台盼蓝溶液（120G/ML）淬灭荧光5分钟。PBS洗三遍，用胰酶消化，1,000RPM离心5分钟收集细胞，加入500L反应缓冲液（PBS2FBS），所有的反应管均用200目尼龙网过滤后用流式细胞仪测定荧光强度。计算吞噬倍数利用公式FOLDPHAGOCYTICINDEX（F蛋白F阴性对照）/（FBSAF阴性对照）。。
37、如图所示，融合蛋白ETTUFTSIN具有明显的促进吞噬细胞J774A1吞噬的作用（图6C）。0091实施例5CCK8试剂盒检测ETTUFTSIN融合蛋白体外对肿瘤细胞的杀伤活性0092取对数生长期的皮肤鳞癌细胞A431和肺癌细胞A549细胞，以每孔3000个细胞的密度接种于96孔板，37下培养24H后加入不同浓度的融合蛋白ETTUFTSIN或LDPTUFTSIN（采用常规方法获得的LDP与TUFTSIN的融合蛋白，序列为SEQIDNO12）或LDP或TUFTSIN（SIGMA），每浓度设置3个平行孔。孵育24H后，每孔加入20LCCK8溶说明书CN104151432A8/11页10液继续培养1。
38、H。酶标仪测定450NM处的吸光度A450。实验设置无药对照组和无细胞空白组，按下面公式计算细胞的存活率并计算出IC50值0093细胞抑制率100加药组A450值空白组A450值/对照组A450值空白组A450值100。0094结果表明，与LDPTUFTSIN、LDP和TUFTSIN相比，ETTUFTSIN蛋白对A431肿瘤细胞抗增殖作用最明显，100METTUFTSIN蛋白对鳞癌A431细胞的抑制率为67，LDPTUFTSIN为52，而LDP蛋白只有20（图7A）；与力达辅基蛋白相比，ETTUFTSIN蛋白对A549肿瘤细胞抑制率为54，LDPTUFTSIN为50，LDP蛋白只有45（图7B。
39、）。因此ETTUFTSIN蛋白对EGFR高表达A431细胞株抗增殖作用比A549明显；LDPTUFTSIN比力达辅基蛋白的抗肿瘤活性高，而ETTUFTSIN蛋白又比LDPTUFTSIN高。促吞噬肽（TUFTSIN）融合蛋白LDPTUFTSIN和ETTUFTSIN都具有明显的抑制肿瘤细胞A431和A549增殖的作用，但是含促吞噬肽的融合蛋白比不含吞噬肽的LDP效果好，含有靶向分子EC的ETTUFTSIN比没有靶向的融合蛋白LDPTUFTSIN效果好。0095实施例6融合蛋白ETTUFTSIN对人鳞癌A431裸鼠移植瘤的生长抑制作用0096取体重为1822G的雌性BALB/C裸鼠5只，将人鳞癌A4。
40、31细胞接种于裸鼠腋窝皮下，每只接种1107个细胞。待瘤块长至足够大小时，将其在无菌生理盐水中剪成222MM3的小块，用套管针将瘤块分别移植到裸鼠右腋窝皮下，用火胶棉将切口粘住。待瘤块长至100MM3大小时，将裸鼠按照瘤块大小和体重进行分组，使每组瘤块大小平均值为100MM3，且各组体重平均值接近，每组6只裸鼠。当肿瘤体积为100MM3时，将等摩尔的融合蛋白ECLDPHR（参见郭晓芳，CLINCANCERRES20101620852094）、LDPTUFTSIN、LDP和TUFTSIN分别通过尾静脉给药，每只裸鼠注射200L，对照组不做任何处理。第一次给药后的第7天，按照相同的剂量再次给药一次。
41、。实验期间每3天测量一次肿瘤直径和体重，根据公式VAB2/2计算肿瘤体积（A肿瘤长径，B肿瘤短径），绘制肿瘤生长曲线，观察体重变化。实验第30天处死动物，分别称量肿瘤的重量，计算抑瘤率。结果见表1。0097表1融合蛋白ETTUFTSIN对人鳞癌A431的肿瘤生长抑制作用00980099裸鼠A431动物实验结果表明，融合蛋白ETTUFTSIN对鳞癌A431有生长抑制作用。如表1所示，30天时，融合蛋白ETTUFTSIN的剂量在1MOL/KG时，抑瘤率为841。相比之下，LDPTUFTSIN融合蛋白只有763，单独的力达霉素辅基蛋白LDP和TUFTSIN在说明书CN104151432A109/11。
42、页111MOL/KG的情况下抑制率分别为579和663，这说明融合蛋白ETTUFTSIN提高了对鳞癌A431瘤的治疗效果（与LDP组和TUFTSIN组相比，P005）。但是发明人发现，融合蛋白ETTUFTSIN对小鼠的体重也有影响，LDP治疗的小鼠体重减轻了10G，ETTUFTSIN与TUFTSIN治疗的小鼠体重分别降低10G和24G，也就说明ETTUFTSIN在等摩尔剂量的条件下提高了疗效并降低了单独使用TUFTSIN治疗的毒副作用。0100动物实验结果显示与本实验室构建的双靶点融合蛋白ECLDPHR相比，ETTUFTSIN的抑瘤效果更好，我们推测促吞噬肽融合蛋白中的促吞噬肽组分充分发挥其化。
43、学诱导剂的作用，增加了融合蛋白的免疫毒性，更好地抑制肿瘤的生长。0101实施例7融合蛋白ETTUFTSINTUFTSIN对人鳞癌A431裸鼠移植瘤的生长抑制作用0102参考实施例1和2中描述的融合蛋白载体的构建及其表达方法并作适当修改，得到在羧基端具有连续的2个促吞噬肽的融合蛋白ETTUFTSINTUFTSIN，其氨基酸序列为SEQIDNO13。0103按照实施例6中描述的方法进行融合蛋白ETTUFTSINTUFTSIN的抑瘤作用验证实验，不同的是当肿瘤体积为100MM3时，将不同浓度的融合蛋白ETTUFTSINTUFTSIN和融合蛋白ETTUFTSIN分别通过尾静脉给药，每只裸鼠注射200L。
44、，对照组不做任何处理。结果见表2。0104表2融合蛋白ETTUFTSINTUFTSIN对人鳞癌A431的肿瘤生长抑制作用01050106裸鼠A431动物实验结果表明，融合蛋白ETTUFTSINTUFTSIN对鳞癌A431有生长抑制作用。如表2所示，30天时，融合蛋白ETTUFTSINTUFTSIN的剂量在1MOL/KG时，抑瘤率为786。相比之下，ETTUFTSIN融合蛋白为72，这说明两个TUFTSIN在融合蛋白C端相连所起到的抗肿瘤作用与ETTUFTSIN类似，因此推测多个TUFTSIN相连也可以起到类似的抗肿瘤作用。0107实施例8强化融合蛋白ETTUFTSINAE的构建0108融合蛋白。
45、ETTUFTSIN是一种多功能的药用蛋白，在以上的试验已经证明了该蛋白既有体内外靶向性，而且在体外还有促吞噬细胞吞噬作用，并且体内试验也证明其能抑制肿瘤的生长，有较好的疗效。0109融合蛋白ETTUFTSIN包括力达辅基蛋白，而由于力达霉素的特有性质，使该融合蛋白可以与力达霉素（LDM）的活性基团发色团（AE）组装，进一步提高其抗肿瘤活性。取高活性的力达霉素纯品，经C4柱分离活性发色团组分，流动相为水乙腈三氟乙酸说明书CN104151432A1110/11页12（7822005，体积比），监测350NM处的吸光值，以收集发色团组分。将ETTUFTSIN蛋白与发色团以13的分子比混合，置于摇床上。
46、缓慢晃动，4下避光反应1216H，之后将二者的混合液经SEPHADEXG75柱除去多余的发色团组分，至少超滤四次，HPLC（4300A柱）检测350NM处的吸光值，观察发色团与融合蛋白是否组装成功。ETTUFTSIN蛋白与LDM的发色团分子在体外进行组装，HPLC（C4柱）检测结果显示，在350NM（6MIN）处出现特定吸收峰，表明分子组装成功，得到了强化融合蛋白（图8）。0110同理，可制得强化融合蛋白ETTUFTSINTUFTSINAE。0111实施例9MTT法检测强化融合蛋白0112测定强化融合蛋白ETTUFTSINAE对肿瘤细胞的体外抗增殖作用。0113取对数生长期的A431、A549。
47、和SW1990细胞，以每孔4000个细胞的密度接种于96孔板中，37下培养24H后加入不同浓度的ETTUFTSINAE、ETTUFTSIN、丝裂霉素C和力达霉素，每个药物浓度设置3个平行孔，孵育24H后，每孔加入20LMTT溶液（5MG/ML）继续培养2H。吸弃上清，每孔加入150L二甲基亚砜，室温下振荡10MIN，酶标仪测定570NM处的吸光度（A570）。实验设置无药对照组和无细胞空白组，然后用SPSS计算ETTUFTSINAE对肿瘤细胞的IC50值（表3）。结果见表3。0114表3MTT法测定ETTUFTSINAE对不同肿瘤细胞系的生长抑制作用01150116实施例10强化融合蛋白ETT。
48、UFTSINAE对鳞癌A431裸鼠移植瘤的治疗作用。0117试验方法、给药次数与实施例6基本相同，不同的是当肿瘤体积为100MM3时，将不同浓度的强化融合蛋白ETTUFTSINAE和力达霉素（LDM）及融合蛋白ETTUFTSIN分别通过尾静脉给药，每只裸鼠注射200L，对照组不做任何处理。结果见表4。0118表4强化融合蛋白ETTUFTSINAE对人鳞癌A431的肿瘤生长抑制作用0119说明书CN104151432A1211/11页130120如表4所示，强化融合蛋白在ETTUFTSINAE在30天的观察时间内能够显著的抑制和延缓肿瘤A431的生长。强化融合蛋白ETTUFTSINAE能进一步提。
49、高其抗肿瘤的效果，44NMOL/KG与36NMOL/KG两个剂量的强化融合蛋白均能显著抑制或延迟裸鼠移植性肿瘤A431的生长，并且表现出比44NMOL/KG（AE等价剂量）力达霉素（LDM）更强的肿瘤生长抑制作用（表4）。在实验第30天结果显示，两个剂量的ETTUFTSINAE的抑瘤率分别为909和745，均强于力达霉素的651抑瘤率和蛋白ETTUFTSIN的753的抑制率。实验证明，强化融合蛋白ETTUFTSINAE进一步提高了ETTUFTSIN蛋白在小鼠体内的治疗效果。0121以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。说明书CN104151432A131/9页1400010002序列表CN104151432A142/9页150003序列表CN104151432A153/9页160004序列表CN104151432A164/9页170005序列表CN104151432A175/9页180006序列表CN104151432A186/9页190007序列表CN104151432A197/9页200008序列表CN10415。