技术领域：
本发明涉及中药地笋有效部位及其制备方法；本发明还涉以所说部位为有 效成分的药物组合物；本发明还涉及所说有效部位在制备药物，特别是在制备抗 氧化和抗肿瘤及其相关药物中的应用。
背景技术：
地笋(Rhezoma Lycopi)始载于《嘉祐本草》，为唇形科植物毛叶地瓜儿苗 Lycopus lucidus Turcz.var.hirtus Regel.的地下根茎，其味甘，性辛、温。具有活血、 益气、消水的功能。用于治疗吐血，衄血，产后腹痛带下等症。
其地上部分为中药泽兰，是一种常用活血化瘀中药，主要活性成分为酚酸、 黄酮类化合物。临床用于治疗心脑血管疾病，疗效显著。现代药理学研究表明： 泽兰具有改善微循环、利胆保肝、抗菌等作用。
随着人类生活水平的提高，心血管疾病已成为当今世界上威胁人类健康的 最严重疾病之一，其发病率和死亡率已超过肿瘤性疾病而跃居第一。因此，预防 和治疗心血管疾病和肿瘤药物的研究，日益成为医药界的研究热点。近年来的研 究发现，心血管、肿瘤等多种疾病的产生和发展与体内多余自由基对组织细胞的 损伤有密切关系。
目前，对于地笋的研究报道较少。药理活性研究结果表明，地笋醇提物和水 提物均未出现明显的小鼠急性毒性；地笋醇提物具有解痉、抗炎、抗应激能力、 降低红细胞压积作用；地笋水提物具有抗炎、抗应激能力、升高红细胞压积作用。 化学成分研究显示，地笋含有丰富的淀粉、蛋白质、矿物质、糖类以及三萜酸类。 迄今为止，尚未见到有关地笋有效部位及其制备方法和抗氧化、抗肿瘤作用方面 的报道。
本发明的目的之一，是提供一种地笋抗氧化有效部位及其制备方法。
本发明的目的之二，是提供一种地笋抗肿瘤有效部位及其制备方法。
本发明的目的之三，是提供一种以所说部位为有效成分的药物组合物。
本发明的目的之四，是提供所说有效部位在制备抗氧化、抗肿瘤及相关药物 中的应用。
发明内容：
本发明利用高通量方法，筛选地笋各萃取部位的抗氧化及抗肿瘤活性，确定 了具有抗氧化和抗肿瘤活性的地笋有效部位及其制备方法。
本发明所说地笋提取物有效部位，选自用正己烷提取地笋得到的正己烷部 位以及用乙酸乙酯和正丁醇萃取得到的乙酸乙酯部位和正丁醇部位之一及其组 合。
乙酸乙酯部位(RLE-E)和正丁醇部位(RLE-B)主要含有酚酸类和黄酮类 成分，具有抗氧化作用，其中乙酸乙酯部位经过HPLC和LC-MS鉴定含有迷迭 香酸、咖啡酸、原儿茶醛、原儿茶酸；正己烷部位(RLE-H)与乙酸乙酯部位 (RLE-E)具有治疗肿瘤的作用，其中正己烷部位(RLE-H)主要含有脂肪酸、 三萜酸、萜类等成分。
本发明的活性部位可以经过提取、浓缩、系列萃取得到，其制备方法可以采 用以下步骤：
1)以毛叶地瓜儿苗根茎为原料，正己烷回流提取，滤液回收溶剂得正己烷 部位(RLE-H)；残渣用乙醇回流提取，滤液回收溶剂，得浸膏(RLE)；
2)将浸膏用水分散，依次采用不同极性溶剂萃取，得到各相关部位。
本发明还提供了以所说方法制备的各活性部位的药物组合物。所说药物组合 物是以本发明的活性部位为有效成分，与药学上可接受的载体所组成的。本发明 的药物组合物以适合药用的制剂形式存在，这些制剂形式可以是片剂、糖衣片剂、 薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊 剂、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、 溶液剂、注射剂、粉针剂、冻干粉针剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、 滴剂、滴丸剂、贴剂等。
本发明进一步提供了各活性部位在制备治疗和/或预防氧化或肿瘤药物中的 应用。本发明为此进行了相关试验，其中抗氧化活性试验以清除超氧阴离子自由 基能力、还原Fe3+能力及抑制脂质过氧化能力为活性指标；抗肿瘤活性试验以抑 制HepG2和HL-60细胞增殖能力为活性指标。实验结果表明，乙酸乙酯部位和 正丁醇部位具有明显的体外清除超氧阴离子自由基的能力(RLE-E IC50＝38.30±5.52；RLE-B IC50＝27.91±5.36)、还原Fe3+能力(样品浓度为50μg/mL 时，RLE-E OD＝0.6443±0.0810；RLE-B OD＝0.3078±0.0576)及抗大鼠肝微粒 体脂质过氧化活性(RLE-E IC50＝45.95±3.97；RLE-B IC50＝52.97±1.01)，具有 抗氧化作用，可用于制备抗氧化药物；正己烷部位(RLE-H)在体外细胞毒实验 中，可抑制HepG2的增殖(IC50＝156.57±5.41)；乙酸乙酯部位(RLE-E)在体外 细胞毒实验中可抑制HL-60的增殖(IC50＝121.93±2.02)，具有细胞毒作用，可用 于制备抗肿瘤药物。
具体实施方式：
下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式 限制本发明。
实施例1：
有效部位的制备方法：
取毛叶地瓜儿苗(Lycopus lucidus Turcz.var.hirtus Regel.)根茎120g，用正 己烷回流提取两次，第一次600mL提取2小时，第二次400mL提取1小时，过 滤，合并滤液，回收正己烷，得正己烷部位(RLE-H)；残渣分别用70％和50％ 乙醇回流提取两次，第一次1200mL提取2小时，第二次960mL提取1.5小时， 过滤，合并滤液，回收乙醇，得浸膏(RLE)；将浸膏用150mL水溶解后，依次 用乙酸乙酯(150mL/次*5次)，正丁醇(150mL/次*5次)萃取，分别回收溶剂， 得到乙酸乙酯部位(RLE-E)、正丁醇部位(RLE-B)和水部位(RLE-W)。
实施例2：
清除超氧阴离子活性试验：
采用鲁米诺(Sigma公司)增强化学发光法测定PMS/NADH(还原型辅酶I) 体系生成的超氧阴离子。实验反应总体积为100μL，反应体系中包括：NADH (73μmol/L)，PMS(硫酸甲酯酚嗪)(15μmol/L)，luminol(100μmol/L)， 硼砂/盐酸缓冲液(0.05M，pH 8.91)及不同浓度的样品。将待测样品及各反应 试剂加入BMG不透明96孔板(Hitachi公司)，反应由PMS引发，反应液振荡 混匀后立即上Topcount化学发光测定仪(Hitachi公司)检测发光强度值(count per second，CPS)，测定温度19.1℃，每孔测定3秒钟。样品对超氧阴离子的清 除率按下式计算：
清除率(％)＝(CPS空白-CPS样品)/CPS空白×100％，(表1)
其中：CPS空白-空白对照组化学发光强度值；CPS样品-加样品组化学发 光强度值。
实施例3：
还原Fe3+能力测定：
待测样品还原能力的测定根据文献(Suzuki YJ，Tsuchiya M，Packer L..Free Radic Res Commun.1991，15(5)：255-263.)方法进行改进。以去离子水分别配制2 mM的FeCl3和邻菲罗林(北京化学试剂公司)溶液，于实验前将二者按1∶1体 积比混合。混合液加入96孔细胞培养板，90μl/孔，然后加入不同浓度的待测样 品10μl/孔，阳性对照组加入维生素C(Vit C，Sigma公司)，空白对照组以去离 子水代替待测样品。振荡混匀后于室温下静置30分钟，用Zenyth 200rt可见/紫 外全波长分光光度计(Anthos Co.Austria)测定各孔吸光度值，测定波长516nm (表1)。
实施例4：
抑制脂质过氧化实验：
①大鼠肝微粒体的提取：Wistar大鼠，雄性，体重200±20g(购自中国医 学科学院动物研究所)，禁食不禁水过夜，断头处死。用冷的TMS缓冲液(Tris-HCl0.05mmol/L，蔗糖0.2mmol/L，MgCl2溶液3mmol/L，pH 7.4)经肝门静脉冲洗 肝脏，至肝脏颜色变为土黄色。迅速取出肝脏剔除筋膜并剪碎，于冰浴下用玻璃 匀浆器制成肝匀浆(5mL TMS/g肝脏)。匀浆1000g，4℃离心5min，取上清 1.2×104g，4℃离心20分钟，再将上清1.05×105g，4℃离心60分钟，沉淀即为肝 微粒体。将其重悬于TMS缓冲液中，用Lowry法进行微粒体蛋白定量，并稀释 至蛋白含量为15g/L。肝微粒体储存于-20℃冰箱备用。
②Fe2+-半胱氨酸反应系统诱导肝微粒体脂质过氧化：TMS稀释肝微粒体 至蛋白浓度为1500μg/mL，在96孔板检测样品抗脂质过氧化活性。反应液总体 积100μL(肝微粒体50μL；FeSO4 20μL；半胱氨酸(1mmol/L，Sigma)20μL， 不同被试物质10μL，空白对照加等体积生理盐水)，混匀后，37℃孵育30分钟， 然后加入100μL；TBA反应液(硫代巴比妥酸)，封板膜封96孔板后60℃水浴 加热30分钟，在Zenyth200st分光光度计上测定各孔吸光度值，测定波长532nm。 按照下面的公式计算样品对硫酸亚铁/半胱氨酸诱导的肝微粒体脂质过氧化反应 的抑制活性：
抑制率(％)＝(A空白-A样品)/A空白×100％(表1)
其中：A空白：空白的吸光度值；A样品：样品的吸光度值。
实施例5：
抗肿瘤活性试验：
取人肝癌细胞株(HepG2)和人急性早幼粒白血病细胞株(HL-60)(购自美 国ATCC)，以含10％胎牛血清(Hyclone公司)的RPMI-1640完全培养基(Sigma 公司)，在37℃，饱和湿度，含体积分数为5％CO2、95％空气的二氧化碳培养 箱中常规培养，2-3天传代一次。取对数生长期细胞，以0.125％胰酶(Sigma 公司)消化后，PBS(磷酸盐缓冲液)(0.05mol/L，pH 7.4)洗涤2次，完全培 养基重新悬浮，显微镜下细胞计数板计数并调整细胞浓度为1×105/mL，铺96孔 细胞培养板，100μL/孔，培养过夜，使细胞贴壁。加入待测样品，10μL/孔，空白 孔加10μL生理盐水，培养48小时。弃去上清，PBS洗涤细胞2次，加入含0.04％ 四氮唑溴MTT(Amresco公司)的培养基，100μL/孔，再培养4小时。弃去上清， 加DMSO 100μL/孔，振荡10分钟使生成物formazan(甲瓒)充分溶解，在 Zenyth200st酶标仪上测定各孔吸光度值，测定波长570nm。肿瘤细胞增殖抑制活 性率按照下式计算：
抑制率(％)＝(A空白-A样品)/A空白×100％(表1)
计算50％细胞杀伤时的药物浓度(IC50)，IC50采用加权直线回归法进行处理。
表1 地笋及不同极性部位抗氧化和抗肿瘤活性筛选 浓度 μg/mL RLE RLE-H RLE-E RLE-B RLE-W 超氧阴离子 清除率％ 脂质过氧化 抑制率％ 还原Fe3+能力 OD值 HepG2 抑制率％ HL-60 抑制率％ 100 IC50 100 IC50 25 50 100 IC50 100 IC50 78.34 16.51±2.76 16.92 - 0.1358±0.0310 0.2400±0.0391 35.52 196.1±3.68 18.90 ＞200 41.07 - 13.22 - 0.0913±0.0082 0.0930±0.0200 44.42 156.57±5.41 38.40 ＞200 79.18 38.30±5.52 67.14 45.95±3.97 0.4483±0.0983** 0.6443±0.0810** 28.34 ＞200 52.19 121.93±2.02 80.78 27.91±5.36 58.12 52.97±1.01 0.2023±0.0233** 0.3078±0.0576** 10.78 ＞200 14.81 ＞200 25.57 - 22.53 - 0.1113±0.0048 0.1723±0.0697 8.73 ＞200 11.49 ＞200
注：**P＜0.01 vs control.，IC50±s，n＝3
结果表明：采用本发明制备工艺得到的乙酸乙酯部位(RLE-E)和正丁醇部位(RLE-B)具有显著的抗氧化活性；正己烷部位(RLE-H) 和乙酸乙酯部位(RLE-E)具有抗肿瘤活性。