经肺的疟疾疫苗
交叉参考相关申请
本申请要求2004年5月7日提交的美国临时申请60/569,211的优 先权。
背景技术
本发明属于接种疫苗对抗如疟疾的疾病的方法和组合物的领域， 因迄今的接种疫苗的策略尚不够成功，存在对廉价且易于施用所疫苗 的需要。
如疟疾和肺结核的疾病是第三世界国家的主要疾病。例如，疟疾 在南美、非洲、和亚洲南部的大部地区是主要的健康问题。有24亿人 口处于危险之中，并且每年新增病例3亿至5亿，每年死亡110万， 多数是儿童。如氯喹和马拉隆(Malarone)的药物太过昂贵，难以实现 患者的依从性，并且很多株系已产生了对其的耐药性。
1960年代和1970年代期间，早期的临床研究显示，用减活的疟原 虫进行试验性疫苗接种，能有效免疫患者以对抗其后的疟疾感染。因 为基于活性，失活或灭活疟原虫的疫苗目前在经济或技术上不可行， 很多疫苗的研究集中在鉴别能启动保护性免疫反应的疟原虫的特异性 成分或抗原上。在寄生虫的生物学、人类免疫反应、以及临床前和临 床评价方面，科学家在尝试开发疟疾疫苗上遇到了艰难的阻碍。尽管 有四种不同种系的原生寄生虫导致人类疟疾，但多数疫苗的作用是针 对恶性疟，因恶性疟的严重性。
同种但从不同地理位置分离的寄生虫可有遗传和免疫独特性，因 此能对抗一种地理分离的寄生虫的疫苗可能不能对抗另一种寄生虫。 另外，疟原虫有复杂的生命周期，具有多重独特的发展阶段，产生可 能的数千种能作为免疫反应靶点的不同抗原。最后，因为保护作用看 来需要抗体介导和细胞介导的免疫反应，鉴定刺激免疫反应性的所有 方面的给药系统和制剂代表着巨大的技术挑战。
孢子体疫苗能对抗蚊子注入人体的感染类型。但如果有一个单孢 子体能逃脱人体的免疫防御，它将最终导致疾病的全面爆发。裂殖体 (红内期，blood-stage)疫苗，除了防卫该可能性，还能预防或消除已 感染的人体的症状。配子体(有性阶段)疫苗不能保护人体被预防性 接种，但当配子体连同针对疫苗所产生的抗体一旦被蚊子吸入，其可 以通过抑制配子体的进一步发育而干扰传播循环。虽然孢子体疫苗能 用于保护旅人或其他仅仅暂时接触的人，但最适用于世界疟疾区的疫 苗最好是将数种寄生虫类型与也许来自两或三个种的抗原相结合的 “鸡尾酒”疫苗。
从寄生虫的不同发育阶段鉴定了许多候选疫苗抗原(见图1)，一 些已发展至初步临床评价的关头。研究人员主要集中于寄生虫表面表 达、和/或参与寄生虫发育或疾病的一些关键方面的候选疫苗抗原。例 如，环子孢子(CS)蛋白是孢子期的优势表面抗原，据信在初始感染 期与肝细胞(人类肝脏细胞)表面的受体相互作用。
已鉴定了数种参与裂殖体与人类血红细胞结合或参与细胞侵袭过 程的抗原。一种裂殖体表面蛋白(MSP-1)被多次发现在啮齿动物和猴 子的疟疾模型中引发保护性免疫。抑制寄生虫生长的某些关键步骤将 形成疫苗的良好策略。其他研究已在感染的血红细胞表面鉴定了一种 寄生虫源性分子(PfEMP1)，介导其与内皮细胞以及其他红细胞的结合。 但是，寄生虫通过定期改变这种表面蛋白的结构，发展了阻止免疫系 统袭击感染的红细胞的途径，已知该过程为抗原变异。近期恶性疟原 虫基因组的研究揭示了在致感染期间的不同时间，恶性疟原虫表达的 变异基因的两个重要家族，已知为“var”(包括PfEMP1)和“rif”。 更好理解抗原变异可帮助科学家鉴定干扰寄生虫发育的新策略。
研究人员还调查了与严重疟疾疾病有关的免疫机制。例如，近期 研究指出，妇女首次妊娠期间，疟原虫感染的红细胞与胎盘内细胞表 面发现的分子的结合和疟疾有关的不良后果有关，并可为预防该病理 情况的疫苗研制提供基础。大多数基于孢子体抗原的一些候选疫苗进 行了临床试验。CS抗原和乙型肝炎表面抗原结合制成的疫苗，在小型 临床试验中显示出充分的保护功效，从而证实可用于在感染地区的进 一步试验。只有一种基于裂殖体和孢子体两个阶段的抗原的候选疫苗， Spf66接受了大范围的试验。其在南美的早期临床试验中显示有效，但 随后在非洲和东南亚的试验结果不如人意。
1997年NIAID、世界卫生组织和来自全世界的其他组织和个人发 起了“疟疾多边行动”(MIM，Multilateral Initiative on Malaria)。NIH 的Fogarty国际中心目前协调该计划。通过合作和协作，该行动的参与 者希望改进和扩大对非洲疟疾的研究。目前只有一种疟疾疫苗处于临 床试验中，使用了葛兰素史克公司(Glaxo Smith Kline)开发的佐剂， 并与世界卫生组织和国家卫生研究所(National Institutes of Health)合 作。这种疫苗结合了一种带有称为FMP-1的蛋白抗原的专用佐剂。
因此，本发明的目的是提供如疟疾的疾病的可选疫苗。
本发明的另一个目的是提供一种不要求多剂量、提供持续的免疫、 并诱导更完全(体液以及细胞)免疫的疫苗。
发明内容
本发明开发了用于递送的颗粒组合物，优选经肺部，能提供抗原 如疟疾抗原的缓释，优选DNA和/或肽类和/或蛋白抗原。在优选实施 例中，聚集的纳米颗粒在1-5微米粒径的空气动力学范围，飞入肺的深 处。由于聚集的颗粒在体内分解，MSP-1和AMA-1蛋白被释放入血， 刺激体液免疫反应。0.1微米范围的单个颗粒被表达AMA-1和MSP-1 质粒DNA编码蛋白的抗原呈递细胞(APC)所吞噬，从而启动完全免 疫所必需的细胞免疫反应。
附图简述
图1是疟疾多阶段生命周期中各种靶点的示意图。
图2是抗原如何从纳米颗粒表面缓释，引起体液和细胞免疫过程 的示意图。
具体实施方式
I. 递送制剂
颗粒
已开发了递送抗原的颗粒制剂，如疟疾抗原。正如Genentech于 1997年在PISCRBM中所公开的，颗粒递送能明显增强保护。颗粒的 大小和电荷均能影响免疫原性。例如，已知颗粒引起免疫反应，且易 于掌握。纳米颗粒诱导提高的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)反应。
通过抗原与颗粒表面结合，得到最大反应。颗粒也能完全用抗原 材料制备，或者抗原材料也能包囊在颗粒内。纳米颗粒特别是形成结 构聚集体的那些颗粒为优选的。可利用大量制备微米颗粒和纳米颗粒 的方法，或只用抗原(如肽类，蛋白质，核酸，小分子)、抗原加佐 剂，或用抗原加脂质、蛋白质、氨基酸、糖类或聚合物。在优选的实 施方案中，将抗原材料(蛋白质、肽、核酸和/或小分子)的纳米颗粒 制成聚合体，所述聚合体带有外壳或基质，包含的材料包括聚合物、 脂质、糖类、氨基酸，并还可包括抗原材料。抗原材料的组合也能用 在纳米颗粒或颗粒内。
可通过不同的方法利用不同的聚合物(包括蛋白质、多糖、以及 生物可降解聚合物例如多羟基酸如聚(丙交酯-co-乙交酯)、聚羟基脂 肪酸酯、聚原酸酯、和聚酸酐)、非生物降解材料如二氧化硅和聚苯 乙烯、脂质和/或要传送的抗原来制备微米颗粒或纳米颗粒。
a. 溶剂挥发法。在此方法中，聚合物溶于挥发性有机溶剂，如二 氯甲烷。将抗原剂(或可溶或以精细颗粒分散)加入溶液中，并将混 合物悬浮在含有表面活性剂如聚(乙烯醇)的水性溶液中。搅动形成 的乳状液，直至大部分有机溶剂挥发，留下固体微球体。搅动后，聚 合物中有机溶剂挥发，形成的微球体用水清洗，并在冷冻干燥机中干 燥过夜。用这种方法能得到大小(1-1000微米)和形态不同的微球体。 该方法用于相对稳定的聚合物如聚酯和聚苯乙烯。
b. 热熔微囊法。在此方法中，首先熔化聚合物，然后与筛选至小 于50微米的药物固体颗粒混合。将混合物悬浮在不易混合的溶剂(如 硅油)中，并且持续搅动，加热至超过聚合物熔点5℃。一旦乳剂稳定， 将其冷却至聚合物颗粒凝固。形成的微球用石油醚倾析法清洗，得到 自由流动的粉末。用该法得到大小在1-1000微米之间的微球。该方法 制备的球体外表面通常平滑紧致。该程序用于制备聚酯和聚酸酐形成 的微球。但是，此方法限于分子量在1,000-50,000之间的聚合物。
c. 溶剂清除法。该方法主要被设计用于聚酸酐。在该方法中，将 药物分散或溶解于溶液中，所述溶液是将选择的聚合物溶于挥发性有 机溶剂如二氯甲烷中。通过搅动有机油(如硅油)悬浮混合物，形成 乳剂。与溶剂挥发法不同，该方法能用高熔点和不同分子量的聚合物 制作微球。此步骤能获得范围在1-300微米之间的微球。用此技术产生 的球体外部形态高度依赖于所用的聚合物类型。
d. 脂质颗粒。与治疗、预防或诊断药剂结合的颗粒，如抗原，同 所带电荷与药剂电荷相反的带电脂质结合。给药之前联结处的电荷相 反。在优选实施方案中，给药前，药剂和脂质结合时的电荷，是在肺 的pH下药剂和脂质拥有的电荷。在与脂质结合前，颗粒的整体净电荷 可通过调整药剂溶液的pH进行调整。例如，pH约7.4时，胰岛素的整 体净电荷为负的。因此，给药前，胰岛素和正电荷脂质能在此pH下结 合，来制备药剂与带电脂质结合的颗粒，其中带电脂质的电荷与药剂 电荷相反。但是，溶液中的胰岛素电荷也可以被调整，通过把溶液的 pH调整至低于胰岛素的pI(pI＝5.5)，使得具有的整体净电荷为正值。 这样，例如，当胰岛素在pH约为4的溶液中时，其将具有的总体净电 荷为正。带正电荷的胰岛素能与带负电荷的脂质结合，例如，1，2-二硬 脂酰-sn-丙三基-3-[磷酸-ho-rac-(1-甘油醇)](DSPG)。很多药剂，特别是 蛋白质，均可在与带电脂质结合前，实现药剂电荷的调整。例如，通 过喷雾干燥蛋白质等电点(PI)之上或之下的进料液，可以调节蛋白质 的电荷。通过喷雾干燥分子pKa之上或之下的进料液，也能实现小分 子电荷的调节。
颗粒可进一步包含与药剂和脂质不同的羧酸或羧酸基团。羧酸包 括其盐以及不少于两种的羧酸和/或其盐的组合物。优选实施例中，羧 酸是亲水羧酸或其盐。优选柠檬酸和柠檬酸盐，诸如，例如柠檬酸钠。 也可使用羧酸和/或其盐的组合物或混合物。可用多价盐或其离子成分， 如二价盐。实施例包括碱土金属的盐，如，例如，氯化钙。本发明的 颗粒还能包括盐和/或其离子成分的混合物或组合物。颗粒可进一步包 含氨基酸。在优选实施方案中，氨基酸是疏水性的。
颗粒可以制成适于吸入的烘干粉末形式。颗粒的振实密度(tap density)可小于0.4g/cm3，优选小于0.1g/cm3。此外，颗粒的中位几何直 径可从约5微米至约30微米。在另一个实施方案中，颗粒的空气动力 学直径从约1至约5微米。
颗粒可以设计成缓释形式。缓释形式提供了所给予的生物活性药 剂在肺中的存留延长，并延长了局部环境或系统循环中存在治疗水平 的药剂的时间量。“缓释”，作为本文所用的术语，指生物活性药剂 的释放时的药剂有效水平的释放周期长于给药前没有与带相反电荷的 脂质结合的相同生物活性药剂的释放周期。另外，缓释还指降低了给 药后前两个小时可见的典型的药剂突释，特别是在第一个小时，通常 称作初始突释。优选实施例中，缓释除了在降低突释以外，还以延长 释放周期为特征。例如，胰岛素的缓释显示此为给药后升高的浓度水 平达到至少4小时的释放，如约6小时或更长。
整体净电荷为负的药剂可以和整体净电荷为正的脂质结合。整体 净电荷为正的药剂和整体净电荷为负的脂质结合，优选在肺pH的范围 下，能与整体净电荷为负的脂质如1，2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-[磷酸 -rac-(1-甘油醇)](DPPG)结合。“肺pH范围”，作为本文所用的术 语，指患者肺中可出现的pH范围。人类中，该范围通常从约6.4至约 7.0，如从6.4至约6.7。呼吸道内液体(ALF)的pH值由R.A.Parent 在“Comparative Biology of the Normal Lung”，CRC Press，(1991)中报告， 范围从6.44至6.74)。
“带电脂质”作为本文所用的术语，指能具有整体净电荷的脂质。 脂质的电荷可为正或负。脂质和活性药剂结合时，可选择所带电荷与 活性药剂电荷相反的脂质。在优选实施例中，带电脂质是带电磷脂。 优选该磷脂为肺内源性的或一旦给药就能被代谢成肺内源性的磷脂。 可以用带电脂质组合物。结合时，带电脂质组合物的整体净电荷也与 生物活性药剂相反。
带电磷脂可以是负电荷脂质，如1，2-二酰基-sn-丙三基-3-[磷酸 -rac-(1-甘油醇)]和1，2-二酰基-sn-甘油醇-3-磷酸酯。负电荷磷脂的具体 例子包括，但不仅限于，1.2-二硬酯酰-sn-丙三基-3-[磷酸-rac-(1-甘油醇)] (DSPG)，1.2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-[磷酸-rac-(1-甘油醇)](DMPG)， 1.2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸-rac-(1-甘油醇)](DPPG)，1.2-二月桂 酰-sn-丙三基-3-[磷酸-rac-(1-甘油醇)](DLPG)，1.2-二油酰-sn-丙三基 -3-[磷酸-rac-(1-甘油醇)](DOPG)，1.2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷酸 (DMPA)，1.2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸(DPPA)，1.2-二油酰-sn- 丙三基-3-磷酸酯(DOPA)，1.2-二硬酯酰-sn-丙三基-3-磷酸酯(DSPA)， 和1.2-二月桂酰-sn-丙三基-3-磷酸酯(DLPA)。
带电脂质可以是正电荷脂质，如1，2-二酰基-sn-丙三基-3-烷基磷酸 胆碱和1，2-二酰基-sn-丙三基-3-烷基磷酸链烷醇胺。该类型正电荷磷脂 的具体例子包括，但不仅限于，1，2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-乙基磷酸胆 碱(DPePC)，1.2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-乙基磷酸胆碱(DMePC)， 1.2-二硬酯酰-sn-丙三基-3-乙基磷酸胆碱(DSePC)，1.2-二月桂酰-sn- 丙三基-3-乙基磷酸胆碱(DLePC)，1.2-二油酰-sn-丙三基-3-乙基磷酸 胆碱(DOePC)，1，2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-乙基乙醇胺(DPePE)， 1.2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-乙基磷酸乙醇胺(DMePE)，1.2-二硬酯 酰-sn-丙三基-3-乙基磷酸乙醇胺(DSePE)，1.2-二月桂酰-sn-丙三基-3- 乙基磷酸乙醇胺(DLePE)，和1.2-二油酰-sn-丙三基-3-乙基磷酸乙醇 胺(DOePE)。其他适用的带电脂质包括在1995年11月14日授权给 Horrobin等的美国专利No.5,466,841以及分别在1997年12月16日和 1999年5月11日授权给Heath的美国专利No.5,689,721和5,902,802 中描述的那些脂质。
颗粒能以喷雾干燥法制备。例如，喷雾干燥混合物，本文也称作 “进料液”或“进料混合物”，包括生物活性药剂以及结合后与活性 药剂电荷相反的一或多种带电脂质，被进料入喷雾干燥机。例如，使 用蛋白质活性药剂时，药剂可溶解于高于或低于等电点(pI)的缓冲系统 中。具体而言，例如胰岛素可以溶解于水性缓冲系统(如，柠檬酸盐， 磷酸盐，醋酸盐等)或0.01N HCl中。然后产生的溶液pH可以用适当 的碱溶液(如，1N NaOH)调节至所需的值。在一个优选实施方案中， pH可调至约7.4。在此pH下，胰岛素分子带净负电荷(pI＝5.5)。在另 一种实施方案中，pH可调至约pH4.0。在此pH下，胰岛素分子带净正 电荷(pI＝5.5)。通常，阳离子磷脂溶于有机溶剂或溶剂组合。然后混合 两种溶液，并对产生的溶液喷雾干燥。
对于小分子活性药剂，药剂可溶于超过或低于可离子化基团pKa 的缓冲系统中。例如，硫酸沙丁胺醇或硫酸雌酚酮，例如，可以溶于 水性缓冲系统(如，柠檬酸盐，磷酸盐，醋酸盐等)或用于冲洗的无 菌水中。然后产生的溶液的pH用适当的酸或碱溶液调至所需的值。如 果pH调至约pH3至约pH8的范围，硫酸雌酚酮每个分子具有一个负 电荷，而硫酸沙丁胺醇每个分子将具有一个正电荷。因此，电荷的相 互作用可以通过选择恰当的磷脂来设计。典型地，负电荷或正电荷磷 脂溶于有机溶剂或溶剂的组合，然后混合这两种溶液，并对所产生的 混合物喷雾干燥。
可存在于混合物中喷雾干燥的适当有机溶剂包括，但不仅限于， 醇类例如，乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、丁醇等。其他有机溶剂包括， 但不仅限于，全氟化碳、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、甲基-叔 丁基醚等。可存在于进料混合物中的水性溶剂包括水和缓冲液。有机 和水性溶剂二者均能存在于被进料到喷雾干燥器中的喷雾干燥混合物 中。在一个实施方案中，乙醇水溶剂优选乙醇∶水的比率范围从约50∶50 至约90∶10。混合物可为酸性或碱性pH。可任选包括pH缓冲液。优选 pH的范围从约为3至约10。
溶剂或可用于混合物中喷雾干燥的溶剂总量通常超过重量的 99％。存在于喷雾干燥的混合物中的固体量(药物，带电脂质和其它成 分)一般小于约重量的1.0％。优选混合物中喷雾干燥的固体量范围从 约重量的0.05％至约0.5％。喷雾干燥过程中用包括有机和水性溶剂的 混合物，使得亲水和疏水成份可以组合，而不需要形成脂质体或其他 结构或复合物以促进颗粒内这些成分的组合的溶解。
适用的喷雾干燥技术描述于，例如，K.Masters的“Spray Drying Handbook”，John Wiley&Sons，New York，1984。通常，在喷雾干燥期 间，来自如热空气或氮气的热气体的热用于把通过对持续进料液进行 喷雾形成的微滴中的溶剂蒸发掉。其它的喷雾干燥技术对于本领域技 术人员是公知的。在优选实施方案中，采用了双流体雾化技术。另一 个实施方案中，采用了旋转雾化。适用的采用旋转雾化的喷雾干燥器 的实例包括Mobile Minor喷雾干燥器，由丹麦Niro制造。热气体可以 是，例如，空气、氮气或氩气。另一种适用的采用双流体雾化的喷雾 干燥器的范例包括SD-06喷雾干燥器，由美国LabPlant制造。
优选采用入口温度在约90摄氏度至约400摄氏度之间、并且出口 温度在约40摄氏度至约130摄氏度之间进行喷雾干燥得到颗粒。喷雾 干燥的颗粒可以制成具有粗糙的表面质地，以减少颗粒凝聚并改善粉 末的流动性。喷雾干燥颗粒可以制成具有通过干粉吸入器提高烟雾化， 并通向口腔、喉咙和吸入器的较低位置的特征。
e. 水凝胶微球。通过传统的离子凝胶化技术制造凝胶型聚合物制 成的微球，如藻酸盐。聚合物首先溶于水性溶剂，与硫酸钡或一些生 物活性药剂混合，然后通过微球生成器压出，有些情况下用氮气流分 裂小滴。缓慢搅动(大约100-179RPM)的离子硬化浴置于压出器下方， 俘获生成的微滴。微球留在浴中孵育二十或三十分钟，以便有充分的 时间进行凝胶化。微球颗粒的大小通过使用不同尺寸的压出器，或者 改变氮气或聚合物溶液的流速加以控制。壳聚糖微球的制备是把聚合 物溶解在酸溶液中，并与三聚磷酸交联进行的。羧甲基纤维素(CMC) 微球的制备是将聚合物溶解在酸溶液中，用铅离子沉淀微球进行的。 在负电荷聚合物(如藻酸盐，CMC)的情况下，分子量不同的正电荷 配体(如聚赖氨酸，聚乙烯亚胺)能以离子态连接。
纳米颗粒可含有0.01％(w/w)至约100％(w/w)的抗原物质(组 合物干重)。所用的蛋白质、肽、核酸或小分子物质的量将根据需要 的效果和释放水平的改变而变化。可以采用抗原物质的组合物。
颗粒，优选纳米颗粒能装入微米大小的结构聚集体中，带有亲脂 性和/或亲水性分子(通常是药学“赋形剂”)的混合物组成的壳或基 质。纳米颗粒能以上述方法形成，并在颗粒表面上或包囊在颗粒内部， 并与核酸和/或肽和/或蛋白质和/或小分子抗原结合作为颗粒体。聚集体 颗粒壳或基质可包括药学赋形剂如脂质、氨基酸、糖类、聚合体，还 可结合核酸和/或肽和/或蛋白质和/或小分子抗原。也可使用抗原物质的 组合物。这些聚合体颗粒可以下述方法形成。
a. 多孔纳米颗粒聚合体颗粒。美国专利申请20040062718描述了 制造用作疫苗的多孔纳米颗粒聚合体颗粒的优选方法。通过制造纳米 颗粒、与纳米颗粒表面结合或包囊在纳米颗粒内部，抗原可与纳米颗 粒结合，或者其可以结合在微米颗粒的壳内，如图2所示，然后引发 体液和细胞免疫。
这些颗粒聚合体，如Edward等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 19， 12001-12005(2002)中的描述，产生较小亚单位颗粒的较大颗粒(称 作Trojan颗粒，因其保持其较小亚单位的独特性质，还同时保持较大 颗粒的关键特性)。药剂可以包囊在亚单位颗粒内或由较小的颗粒聚 合体制成的较大颗粒内。
颗粒，本文也指作粉剂，可以是适于吸入的干粉状。在特定的实 施方案中，颗粒的振实密度小于约0.4g/cm3。振实密度小于约0.4g/cm3的颗粒本文称作“空气动力学轻颗粒”。更优选颗粒的振实密度小于 约0.1g/cm3。空气动力学轻颗粒的优选大小，如体积几何直径中值 (volume median geometric diameter)(VMGD)至少为约5微米。在 一个实施方案中，VGMD从约5微米至约30微米。另一个实施方案中， 颗粒的VGMD从约9微米至约30微米。另一个实施方案中，颗粒的 直径中值、质量直径中值(MMD)、质量包膜直径中值(mass median envelope diameter.MMED)或质量几何直径中值(MMGD)至少为5 微米，例如从约5微米至约30微米。空气动力学轻颗粒优选“质量空 气动力学直径中值”(MMAD)，本文也称作“空气动力学直径”在 约1微米至约5微米之间。在一个实施方案中，MMAD在约1微米至 约3微米直径。另一个实施方案中，MMAD在约3微米至约5微米之 间。
另一个实施方案中，颗粒的包膜质量密度，本文也称作“质量密 度”小于约0.4g/cm3。各向同性的颗粒的包膜质量密度定义为颗粒的质 量除以其可以包装在内的最小球体包膜的体积。
振实密度可通过本领域技术人员已知的仪器测定，如Dual Platform Microprocessor Controlled Tap Density Tester(Vankel，N.C.)或 Geopyc.TM.Instrument(Micrometrics Instrument Corp.，Norcross，Ga. 30093)。振实密度是包膜质量密度的标准量度。可以采用USP Bulk Density and Tapped Density，United States Pharmacopia convention， Rockville，Md.，10.sup.th suppliemnt，4950-4951，1999的方法测定振实 密度。决定低振实密度的特征包括不规则表面质地和多孔结构。
粒径，例如，其VMGD，可用电区敏感仪(electric zone sensing instrument)如Multisizer Iie，(Coulter Electronic，Luton，Beds，England)， 或激光衍射仪(例如Helos，制造商Sympatec，Princeton，N.J.)测量。 测量颗粒直径的其它仪器为本领域所公知。样品中的颗粒大小范围取 决于如颗粒组成和合成方法的因素。可以选择样品中颗粒的大小分布 使其在呼吸道的靶点内有最佳沉积。
颗粒是以适于局部递送到呼吸道选择性区域如深肺或气道上部或 中部的合适材料、表面粗糙度、直径和振实密度来制备。例如，密度 较高或较大的颗粒可用作上气道的递送，或者一个样本中各种大小颗 粒的混合物，条件是同样或不同的治疗药剂可以在一次用药中施用到 肺的不同目标部位。空气动力学直径范围为大约3至大约5微米的颗 粒，优选递送至气道中部或者上部。空气动力学直径范围为大约1至 大约3微米的颗粒优选递送至深肺。
气雾剂的惯性碰撞和重力沉降是正常呼吸情况下在气道和腺泡中 的主要沉积机制。Edwards，D.A.，J.Aerosol Sci.，26：293-317(1995)。两 种沉积机制的重要性随气雾剂质量按比例增加，与颗粒(或包膜)体 积无关。由于气雾剂在肺中沉积的部位由气雾剂质量决定(至少对于 平均空气动力学直径超过约1微米的颗粒)，通过增加颗粒表面不规 则度和颗粒孔隙率来减小振实密度可使较大的颗粒包膜体积递送入肺 内，其他所有的物理参数等同。
可以计算提供肺内最大沉积的空气动力学直径，所述提供肺内最 大沉积以前通过使用直径小于大约5微米的很小颗粒来实现，优选在 大约1至大约3微米之间，然后其经吞噬作用。选择直径较大但够轻 的颗粒(因此特征为“空气动力学轻的”)从而等效递送至肺，但较 大的颗粒不被吞噬。可以通过使用相对于平滑表面的颗粒表面粗糙或 不平滑的颗粒达到改进递送。
通过诸如过滤或离心可以制备或分离颗粒提供具有事先选择的大 小分布的颗粒样品。例如，样品中超过大约30％、50％、70％、或80％ 的颗粒可以有至少为5微米的选择范围内的直径。某个百分比的颗粒 的必须落在其中的事先选择的范围可以是，例如，大约5和大约30微 米之间，或任选在大约5和大约15微米之间。一个优选实施例中，至 少一部分颗粒的直径在大约9和大约11微米之间。任选颗粒样品也能 制成其中至少约90％，或任选约95％或约99％的直径在所选范围之内。 颗粒样品中存在较高比例的空气动力学轻的、直径较大的颗粒提高了 与之结合的治疗或诊断药剂向肺的递送。大直径颗粒通常意味着几何 直径中值至少约为5微米的颗粒。
靶抗原呈递细胞(APC)的优选颗粒的最小直径为400nm，是APC 进行吞噬作用的极限。运输穿过组织和用于吸收的靶细胞的优选颗粒 的最小直径为10nm。最终的制剂可形成适于经肺递送并在室温下稳定 的干粉剂。
抗原剂
抗原剂是在宿主体内引发、促进、抑制或刺激免疫反应的化合物、 天然聚合物、合成聚合物或生物分子。疫苗优选的抗原剂为脂质、糖 脂、多糖、肽、蛋白质、糖蛋白、细胞因子、/或核酸。核酸抗原剂能 编码其他蛋白质抗原、影响细胞代谢的酶、影响细胞信息交流的肽； 它们能促进或干扰细胞机制，或直接刺激宿主的免疫系统。
优选的疟疾蛋白质抗原剂为重组蛋白CSP、AMA-1、MSP-1和 EALVAC-1。对于这些重组蛋白质在疟疾疫苗中的应用已进行了广泛的 研究，并知其可引发人类的免疫反应。
开发基于肽的抗疟疾疫苗的一个主要困难是寄生虫表面抗原呈递 所固有的多态性。个体寄生虫可以同时或在红内期感染的连续波段中 表达相同表面蛋白的多种形式，作为逃避宿主免疫反应的机制。因此， 生命周期不同阶段的多种抗原组成的疫苗可认为比单个阶段的疫苗更 具前景，并提供了本发明的基本原理。或者，可认为免疫系统的多个 分支将需要刺激。
源自活媒介、灭活的生物体、或重组蛋白质的疫苗的替代品是基 于核酸的疫苗。这些“基因疫苗”包括将编码抗原的DNA或RNA递 送到细胞中，并使其产物可用于MHC I类免疫反应。核酸疫苗以选择 的方式提高了特异性刺激T细胞反应的可能性。肌肉注射编码流感抗 原的裸DNA质粒可以免受流感病毒的感染，并特异性诱导细胞免疫反 应(JJ Donnelly，JB Ulmer，MA Liu.Ann N Y Acad Sci.1995)。这再次 提供了本发明的基本原理。
制剂
在优选实施方案中，颗粒疟疾疫苗的制剂含有肽、蛋白质、小分 子和核酸抗原剂的混合物。具体实施方式包括单独MSP-1、单独 AMA-1、MSP-1与MAP-1质粒DNA联合配制、以及AMA-1与AMA-1 质粒DNA联合配制的聚集体纳米颗粒制剂。其可分开、共同、或相继 给药。制剂负载是颗粒重量的5-50％的抗原，在联合制剂中蛋白质和 DNA的比例相同。这是基于引发免疫所需要的剂量估算。配制成的颗 粒直径大于10nm，聚集体直径小于50μm。
在优选的实施方案中，聚集体纳米颗粒处于直径为1-5微米的空 气动力学范围并飞入肺深处。由于聚集体颗粒在体内降解，MSP-1和 AMA-1蛋白释放入血液刺激体液免疫反应。0.1微米范围的单个颗粒优 先被表达由AMA-1和MSP-1质粒DNA编码的蛋白的APC所吞噬， 从而启动完全免疫所需的细胞免疫反应。
III. 给药方式
颗粒可通过数种途径的任何一种给药，包括注射、口服、和局部 施用至粘膜表面，但优选经肺递送。经肺给药通常可以不需要医疗干 预即可完成(自我给药)，避免了注射疗法相关的疼痛，以及口服疗法 中经常会遇到的，介导生物活性药剂降解的酶和pH的量会显著降低。 另外，肺为药物吸收提供了大的粘膜面积，并且没有药物吸收的首过 肝效应。此外，显示经肺部递送或吸入可达到许多分子，例如，蛋白 质和多糖大分子的高生物利用度。通常，深肺、或肺泡是吸入的生物 活性剂的主要目标，特别对于需要全身递送的药剂。肺还布满免疫系 统的吞噬细胞，并提供了给药后立即将抗原引导至大量免疫细胞的方 式。
“肺部递送”，该术语用于本文指递送至呼吸道。“呼吸道”，此处 的定义，包含上气道，包括口咽和喉部，之后是下气道，包括气管继 而分支为支气管和细支气管(如，终末和呼吸细支气管)。上下气道称 为传导气道。然后终末细支气管分成呼吸细支气管，然后，成为最终 呼吸区，即，腺泡，或深肺。深肺，或腺泡通常是全身给药的吸入治 疗制剂的所需靶标。
在优选实施方式中，颗粒通过干粉吸入器(DPI)给药。也可使用 定量喷雾器(MDI)、喷雾器或滴注技术。能给患者的呼吸道施用颗粒 的各种适于吸入的装置和方法在本领域已公知。例如，适用的吸入器 描述于1976年8月5日授权给Valentini等的美国专利No.4,069,819， 1991年2月26日授权给Valentini等的美国专利No.4,995,385，和1999 年12月7日授权给Patton等的美国专利No.5,997,848。能给患者的呼 吸道施用颗粒的各种合适的吸入装置和方法在本领域已公知。例如， 适用的吸入器描述于授权给Valentini等的美国专利No.4,995,385和 4,069,819，授权给Patton的美国专利No.5,997,848。其它实例包括但不 仅限于，Spinhaler.RTM.(Fisons，Loughborough，U.K.)，Rotahaler. RTM.(Glaxo-Wellcome，Research Triangel Technology Park，North Carolina)，FlowCaps.RTM)(Hovione，Loures，Portugal)，Inhalator.RTM. (Boehringer-Ingelheim，Germany)，和Aerolizer.RTM.(Novartis， Switzerland)，dishaler(Glaxo-Wellcome，RTP，NC)以及本领域技术人员所 知的其它实例。优选颗粒作为干粉经干粉吸入器施用。
用容器装入或储存颗粒和/或包含颗粒的可吸入药学组合物。在一 个实施方案中，颗粒质量至少5毫克。另一个实施方案中，储存或装 入的颗粒质量至少约1mg至至少约100mg。颗粒可以由1-100％的抗原 物质组成。优选实施方案中，颗粒含有5-10％重量的抗原物质。
施用于的呼吸道的颗粒优选通过上气道(口咽和喉)，下气道，包 括气管继而分支为支气管和细支气管，并通过终末细支气管继而分为 呼吸细支气管，然后抵达最终呼吸区，腺泡或深肺。在本发明的优选 实施方案中，颗粒主体的大多数沉积在深肺中。本发明的另一个实施 方案中，主要传送至气道中部。递送至上气道也能实现。
术语“有效量”用于本文意指达到所需的治疗或诊断效果或疗效 需要的量。根据所采用的具体药物或其组合、制成的具体组合物、给 药模式和患者的年龄、体重、状况、以及治疗的症状或病症的严重度， 药物的实际有效量可以改变。具体患者的剂量以本领域普通技术人员 常规的考虑事项来确定(如根据恰当的、传统的药理方案)。
气雾剂剂量、配制和递送系统也可选择用于特定治疗，例如，描 述于Gonda I.的“Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract，”Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，6：273-313，1990；和Moren的“Aerosol dosage forms and formulations”，Aerosols in Medicine.Principles，Diagnosis and Therapy，Moren，et al.，Eds，Esevier，Amsterdam，1985。
对于注射递送而言，颗粒首先悬浮在恰当的递送液中，通过细套 管针皮下或肌内递送形成体内储药库。
施用释放蛋白质和DNA的颗粒重现了DNA/蛋白质的初次/加强免 疫引发的免疫反应。含DNA的颗粒构成初次，蛋白质的缓释按照与加 强途径相同的方式刺激免疫系统。本技术的优点在于提供了对疟疾或 其它寄生虫长时间持续免疫的单疫苗。