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1、10申请公布号CN104159590A43申请公布日20141119CN104159590A21申请号201280069645X22申请日2012121361/570,59320111214USA61K35/14200601C12N5/078620060171申请人耶达研究与开发有限公司地址以色列雷霍沃特72发明人M埃森巴赫施瓦茨E约勒斯R谢克特O米勒74专利代理机构北京安信方达知识产权代理有限公司11262代理人陈建芳阎娬斌54发明名称用于治疗中枢神经系统损伤的人单核细胞亚群57摘要本发明提供用于治疗CNS损伤的外周血单核细胞PBMC的亚群，其基本上不含CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞。
2、和任选的CD16细胞。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014081386PCT国际申请的申请数据PCT/IL2012/0505222012121387PCT国际申请的公布数据WO2013/088441EN2013062051INTCL权利要求书2页说明书10页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书10页附图6页10申请公布号CN104159590ACN104159590A1/2页21一种基本上不含CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞的外周血单核细胞PBMC亚群，其用于治疗中枢神经系统CNS损伤。2根据权利要求1所述的PBMC亚群，其进一步。
3、基本上不含CD16细胞。3一种基本上不含CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16细胞的外周血单核细胞PBMC亚群，其用于治疗CNS损伤。4根据权利要求1或3所述的PBMC亚群，其基本上富集CD14细胞。5根据权利要求1至4中任一项所述的PBMC亚群，其用于治疗由所述CNS损伤引起的神经元变性。6根据权利要求1至4中任一项所述的PBMC亚群，其用于治疗脊髓损伤。7根据权利要求5或6所述的PBMC亚群，其中所述治疗包括促进脊髓组织修复、功能恢复，或两者兼而有之。8根据权利要求1至5中任一项所述的PBMC亚群，其中所述CNS损伤是创伤如钝性创伤、穿透性创伤、脑外伤或对侧外伤、在神经外科手术或。
4、其他手术过程中经历的创伤，或中风，如出血性中风或缺血性中风。9根据权利要求1至8中任一项所述的PBMC亚群，其为自体PBMC。10根据权利要求1至8中任一项所述的PBMC亚群，其为同种异基因的PBMC。11根据权利要求9或10所述的PBMC亚群，其经过配制用于注射。12根据权利要求11所述的PBMC亚群，其经过配制用于注射至脑脊髓液CSF中。13一种包括基本上不含CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞的外周血单核细胞PBMC亚群的组合物，其用于治疗CNS损伤。14根据权利要求13所述的组合物，其中所述PBMC亚群进一步基本上不含CD16细胞。15一种包括基本上不含CD3细胞、CD19细胞、CD。
5、56细胞和CD16细胞的外周血单核细胞PBMC亚群的组合物，其用于治疗CNS损伤。16根据权利要求13或15所述的组合物，其中所述PBMC亚群基本上富集CD14细胞。17根据权利要求13或15所述的组合物，其中所述亚群的PBMC悬浮在适于注射的药学上可接受的载体中。18根据权利要求17所述的组合物，其中所述注射是用于施用至CSF中。19根据权利要求18所述的组合物，其中所述施用至CSF中是通过鞘内注射、腰椎穿刺LP、通过枕大池CM注射、脑室内ICV注射，或它们的组合。20一种用于治疗CNS损伤的方法，包括向有需要的个体施用有效量的外周血单核细胞PBMC亚群，其基本上不含CD3细胞、CD19细胞。
6、和CD56细胞。21根据权利要求20所述的方法，其中所述PBMC亚群进一步基本上不含CD16细胞。22一种用于治疗CNS损伤的方法，包括向有需要的个体施用有效量的外周血单核细胞PBMC亚群，基本上不含CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16细胞。23根据权利要求20或22所述的方法，其中所述PBMC亚群基本上富集CD14细胞。24根据权利要求23所述的方法，包括将所述PBMC亚群注入CSF中。25一种用于从血液中分离基本上不含CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞的人外周血单核细胞PMBC亚群的方法，其包括以下步骤I从血液中分离单核细胞；权利要求书CN104159590A2/2页3II。
7、从I的所述单核细胞中去除所述CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞，其是通过使所述单核细胞与抗CD3抗体、抗CD19抗体和抗CD56抗体接触，其中每一个抗体被连接到微珠，从而使所述细胞结合至所述微珠，并且将所述微珠去除，由此从血液中得到人外周血单核细胞PMBC的亚群，其基本上不含CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞。26一种用于从血液中分离基本上不含CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16细胞的人外周血单核细胞PMBC亚群的方法，其包括以下步骤III从血液中分离单核细胞；IV从I的所述单核细胞中去除所述CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16细胞，其是通过使所述单核细胞与抗C。
8、D3抗体、抗CD19抗体、抗CD56抗体和抗CD16抗体接触，其中每一个抗体被连接到微珠，从而使所述细胞结合至所述微珠，并且将所述微珠去除，由此从血液中得到人PMBC亚群，其基本上不含CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16。27根据权利要求26所述的方法，其中步骤IV包括以下子步骤V从I的所述单核细胞中去除所述CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞，从而从血液中获得基本上不含CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞的人PMBC亚群；并且VI从V的所述PMBC群体中去除所述CD16细胞，由此从血液中获得基本上不含CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16细胞的人PMBC亚群。28根。
9、据权利要求27所述的方法，其中步骤IV是在单一步骤中进行。权利要求书CN104159590A1/10页4用于治疗中枢神经系统损伤的人单核细胞亚群发明领域0001本发明总体上涉及中枢神经系统CNS损伤，并且尤其涉及适用于治疗CNS损伤的人单核细胞亚群、分离这些亚群并且治疗患有脊髓损伤的患者的方法。0002发明背景0003中枢神经系统损伤，包括脊髓损伤，是最具破坏性和致残性的可能损伤之一。取决于损伤严重性，可导致不同程度的瘫痪。截瘫和四肢瘫痪经常由脊髓严重损伤引起。0004全世界每年脊髓损伤SCI的发病率估计为22人/百万人，并且SCI存活者的总数估计为2百5十万人。SCI最常发生于二十几岁的青年。
10、人中，这些人可预期具有准正常的预期寿命，但是难以维持可接受的生活质量。这种情况产生重大的个人、社会和经济成本。虽然预期寿命是非常好的，但是SCI患者患有一些重大障碍取决于病变的程度和严重性，这些障碍严重削弱他们的生活质量如瘫痪、感觉缺失、顽固性疼痛、褥疮和泌尿等感染。尽管在过去的二十年中，科研和临床界已经投入了密集的研究，但是到目前为止还没有可以扭转SCI后所丧失功能的良药或疗法。0005迄今为止，治疗努力主要集中于预防破坏性事件神经保护作用，其次集中于增强由SCI诱导的自发修复事件。功能进一步恢复将需要有效的神经保护性和修复性治疗干预的结合。上述因素导致本发明人遵循新的生理方法，它采用人体的。
11、专业治疗系统，即免疫系统，来抗衡中枢神经系统CNS损伤的后果，从而导致神经保护和修复。0006在本发明人的实验室中证明与皮肤片段一起孵育的来源于血液的单核细胞获得了类似于文献中所述的抗炎症M2单核细胞的非炎症性表型BOMSTEIN等人,2003。在大鼠中将单核细胞注射至损伤脊髓中诱导更好的SCI恢复US5,800,812；US6,117,424；和US6,267,955。这种方法在对于患有急性切断脊髓损伤的患者的临床研究中得到测试，呈现令人鼓舞的成果WO03/044037；KNOLLER等人,2005。因此，治疗需要包括椎板切除术的外科手术来暴露损伤脊髓并且将细胞注射于病变部位的边界，这种病变。
12、部位是很难定位的。发明人认为，发现克服定位病变部位和使患者暴露于侵入性手术的难题的方法会有助于SCI的治疗。0007在发明人的实验室进行的近期研究表明，在脊髓损伤后，在损伤后三到四天，血液产生的单核细胞自发地浸润受损的CNS，优先聚集在病变部位的边缘，在恢复的过程中起到了举足轻重的作用。这些细胞调节受伤组织的免疫活性以变得具有较少发炎，并产生了支持愈合的分子，因而有利于细胞再生和组织修复SHECHTER等人,2009。尽管它们的积极作用，但是在严重损伤中，不足以诱导完全恢复，甚至部分功能恢复。0008外周血浸润/募集至病变部位中受到从病变部位引出的信号控制，从而影响大脑CSF屏障。CNS损伤后。
13、的有限自发恢复可部分归因于有效子集的单核细胞不充分地、不合时宜地、自发地募集至病变部位。本着这一精神，我们已经证明使外周血单核细胞池富集来源于骨髓的CD115细胞可增强小鼠在SCI之后的功能恢复SHECHTER等人,2009。0009血液单核细胞是具有不同特性和活性的异种细胞群体。将血液单核细胞用于治疗目的需要识别具有有害功能的细胞以及有益的那些细胞。说明书CN104159590A2/10页50010在人类中，有人提出，单核细胞上的CD16的表达可以区分三个子集，即CD14CD16经典CD14CD16和CD14DIMCD16非经典单核细胞，但它们在生理和病理条件中的作用尚不完全清楚。0011发。
14、明概述0012在一些方面，本发明提供基本上不含CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞的外周血单核细胞PBMC亚群，或基本上不含CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16的PBMC亚群，用于治疗中枢神经系统CNS损伤。0013在其它方面，本发明提供了组合物，其包括基本上不含CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞的PBMC亚群或基本上不含CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16的PBMC亚群，用于治疗CNS损伤。0014在其它方面，本发明涉及一种用于治疗CNS损伤的方法，包括向有需要的个体施用有效量的基本上不含CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞的PBMC亚群，或基本上不含CD3细。
15、胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16细胞的PBMC亚群。细胞优选地通过腰椎穿刺或枕大池注入CSF中。0015在其它方面，本发明提供了用于从血液中分离基本上不含CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞的人PBMC亚群或基本上不含CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16细胞的人PMBC亚群的方法。0016附图简述0017图1展示腰椎穿刺LP注入皮肤活化巨噬细胞促进严重脊髓损伤之后大鼠的功能恢复。野生型大鼠遭受严重的脊髓损伤SCI。8天后，通过LP向受伤的动物注射05X106或1X106皮肤活化的巨噬细胞或媒介物至CSF脑脊液中。在注射较高剂量的巨噬细胞的动物组中观察到由巴索比蒂布雷斯纳汉。
16、BASSOBEATTIEBRESNAHAN；BBB评分增加表示的运动显著改善。0018图2展示在遭受脊髓损伤SCI的野生型小鼠中，脑室内ICV注射单核细胞提供运动活性显著改善。BMS，巴索小鼠量表。0019图3AD显示根据它们的CD14、CD16和CD115的表达的外周血单核细胞的分布。图3A展示通过FACS测量的总活单核细胞群体的分布划定的细胞是活细胞活门。SSC，侧向散射；FSC，前向散射；图3B展示了总活门以外的CD45阳性细胞的分布，即造血起源的细胞红细胞系细胞、血小板和它们的前体细胞除外。图3C展示由单克隆抗CD14和抗CD16抗体标记的单核细胞在从CD45阳性细胞划定的单核细胞亚群。
17、以外可以被分离成三个不同的亚群CD14CD16805、CD14CD1648和CD14DIMCD1635。图3D展示不同单核细胞亚群上的CD115的表达水平以平均荧光强度。0020图4AE展示在外周血单核细胞4A和三个亚群的单核细胞CD14CD164B、CD14CD164C和CD14DIMCD164D上的CX3CR1和CCR2分布。4E的图表示出了三个亚群中的分布。0021图5展示通过消耗CCR2细胞而使CD14DIMCD16细胞富集。柱形展示各亚群占总单核细胞群体的比例。PBMC条形图表示外周血单核细胞中的单核细胞亚群的分布，这些外周血单核细胞从使用FICOL梯度分离的新鲜献血中分离。CD14。
18、柱表示通过使用偶联至磁性微珠的CD14抗体来阳性选择CD14阳性细胞后的单核细胞亚群的分布；CCR2消耗条表示阴说明书CN104159590A3/10页6性选择CCR2阳性细胞和阳性选择CD14阳性细胞后的单核细胞亚群的分布。0022图6展示通过消耗CCR2细胞来使CD14DIMCD16细胞富集的血源性单核细胞的ICV注射未能改善SCI恢复。而且功能结果有恶化的趋势；与注射磷酸盐缓冲盐水PBS的对照组动物相比，在经过治疗的动物单核细胞中，巴索小鼠量表BMS评分较低。0023图7展示伤后第4天通过阴性选择分离的血源性单核细胞的ICV注射改善小鼠的功能恢复。然而，通过CD14阳性细胞的阳性选择分离。
19、的血源性单核细胞不太有益。BMS，巴索小鼠量表。0024图8AB展示分离CD14CD16细胞的依序方法，即首先使用CD3、CD19和CD56抗体A来消耗白细胞，随后消耗CD16阳性细胞。最终产物是含有CD14CD16细胞和少于01的CD16细胞B的群体。0025图9展示在遭受受控严重脊髓损伤的小鼠中通过ICV将05106CD14CD16皮肤活化血液单核细胞MQ或PBS注射至CSF的效果。Y轴，总测试动物中的展示有意义的功能恢复的动物。0026发明详述0027本发明是基于以下发现，由不存在、或者几乎不存在表达CD3、CD19、CD56和任选CD16的细胞来定义的单核细胞亚群能够从脑脊液CSF归巢。
20、到损伤的脊髓部位，促进组织修复和改善功能恢复。现有技术的方法教导将单核吞噬细胞准确施用至病灶边界的必要性，以便获得满意疗效例如美国专利号5,800,812。0028根据本发明进一步发现，细胞在治愈受伤脊髓中的有益效果通过以下方法来获得施用与皮肤片段一起共孵育的细胞或将未活化的细胞施用至受伤脊髓的CSF。0029在其表面上表达某种可识别标记，如分化抗原簇CD分子X的细胞在本文中称为CDX。例如，在其表面上表达CD3分子的细胞在本文中称为CD3。表达于细胞表面上的CD分子的相对量是通过添加“”来指示的，例如，CD3表示高含量的CD分子，或者术语“DIM”表示CD分子的相对较低水平。包括由表达某种C。
21、D来定义的细胞类型的细胞群体、以这些细胞相对富集的群体，或缺乏此类细胞的群体分别被称为CD、CD或CD。0030因此，在某些实施方案中，外周血单核细胞PBMC亚群基本上不含CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞。0031在其它实施方案中，另外，CD16细胞已经从PBMC亚群中去除，导致PBMC亚群进一步基本上不含CD16细胞，即亚群基本上不含CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16的细胞。0032如本文所用的术语“外周血单核细胞PBMC”是指具有圆形核的任何血细胞，如淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。从血液中分离PBMC的方法对于本领域技术人员是显然熟知的。一个非限制性的例子是用聚蔗糖从全。
22、血中来提取这些细胞，所述聚蔗糖是分离血液层的亲水性多糖，其中单核细胞和淋巴细胞形成血浆层下的血沉棕黄层，或通过白细胞分离来制备白细胞浓缩物，并且将红细胞和白细胞减少的血浆返回至供体。0033短语“基本上不含的细胞群体”在本文中可与短语“几乎不存在”互换使用并且优选地包括缺乏某种细胞类型的细胞群体，或可替代地包括的某种细胞类型的相对量不超过所述细胞群体中的总细胞数的约005、01、05、1、2、3、4或5。0034因此，在某些实施方案中，CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞中的每一个的相对说明书CN104159590A4/10页7量不超过PBMC群体中的总细胞数的约005、01、05、1、2、。
23、3、4或5。在某些实施方案中，基本上不含CD3的细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16细胞的亚群中的CD16细胞的相对量不超过总细胞数的约005、01、05、1、2、3、4或5。0035在某些实施方案中，基本上不含CD3细胞、CD19细胞和CD56并且任选地还基本上不含CD16细胞的亚群基本上富含CD14细胞。0036短语“基本上富含的细胞群体”是指如下细胞群体，其包括的某种细胞类型的相对量超过所述细胞群体中的总细胞数的约60、70、80、90、95或99。0037在某些实施方案中，基本上不含CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞的PBMC亚群包含至少约60的CD14细胞，并且基本上不含C。
24、D3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16细胞的亚群包含至少约80的CD14细胞。因此，基本上不含CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16细胞的亚群在本文中也被称为CD14，CD16群体。0038在某些实施方案中，本发明的PBMC亚群用于治疗由CNS损伤所引起的神经元变性。0039因此，在某些实施方案中，本发明的PBMC亚群可用于治疗脊髓损伤，并且治疗可以包括促进脊髓组织修复、功能恢复，或两者兼而有之。0040在其他实施方案中，CNS损伤是创伤，如钝性创伤、穿透性创伤、脑外伤或对侧外伤、在神经外科手术或其他手术过程中经历的创伤，或中风，如出血性中风或缺血性中风。0041在不同的实施。
25、方案中，人PBMC亚群从自体PBMC中分离，即血液从需要治疗CNS损伤的患者收集，根据本发明的PBMC亚群如下文所定义来制备，然后施用返回给患者。0042在另一个实施方案中，人PBMC亚群从同种异基因的PBMC中分离，即血液从基因相似但不相同的供体中收集，根据本发明的PBMC亚群如下文所定义制备并且在施用至患者前任选地存储细胞库中。0043在某些实施方案中，PBMC亚群被配制用于注射，优选用于注射到CSF。0044如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指任何类型的无毒、稀释、配方助剂，或只是无菌水性介质，如盐水。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例是糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉。
26、米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽、明胶、滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二元醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯、琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水、林格氏溶液；乙醇和磷酸盐缓冲液，以及用于药物制剂的其它无毒相容物质。0045这些额外的非活性成分，以及有效的制剂和施用方法在本领域中是熟知的，并且在标准的教科书中进行了描述，例如GOODMANANDGILLMANSTHEPHARMACOLOGICAL。
27、BASESOFTHERAPEUTICS,第8版,GILMAN等人编PERGAMONPRESS1990,以及REMINGTONSPHARMACEUTICALSCIENCES,第18版,MACKPUBLISHINGCO,EASTON,PA1990，这两种文献都通过引用的方式全部并入本文。0046在另一个方面，本发明提供了包含用于治疗CNS损伤的上文定义的PBMC亚群的组合物。所述组合物可包含PBMC亚群细胞，其悬浮于适于注射，优选适于施用到CSF中的药学上可接受的载体。药学上可接受的载体的非限制性实例是PBS或培养基。然而，替代性说明书CN104159590A5/10页8的药学上可接受的载体对于本。
28、领域技术人员是显然熟知的。0047在某些实施方案中，所述细胞或组合物施用至CSF中是通过鞘内注射、腰椎穿刺LP、通过枕大池CM注射、脑室内ICV注射，或它们的组合。0048根据本发明，发现PBMC亚群从CSF成功迁移植到脊髓损伤的边界、减轻了损伤并且改善功能恢复，不论细胞是否先前已经通过与皮肤片段共培养来活化，即它们是皮肤活化细胞，或它们是否是原生的，即未受操纵的或未活化的。0049因此，在某些实施方案中，注入CSF的本发明的PBMC亚群细胞是皮肤活化细胞。0050在某些实施方案中，注入CSF的本发明的PBMC亚群细胞是未活化细胞。0051根据本发明的PBMC亚群，以及包含它们的组合物可用于治。
29、疗CNS损伤，例如脊髓损伤。具体地说，所述治疗包括促进脊髓组织修复，包括例如预防或抑制神经元变性、促进神经元存活、轴突再生和/或萌芽、受伤脊髓中的神经发生，和/或促进功能恢复，如通过大鼠中的巴索比蒂布雷斯纳汉BBB评分或小鼠中的小鼠巴索量表BMS测量，如下文所定义。0052在另一个实施方案中，CNS损伤可为创伤，如钝性创伤、穿透性创伤、脑外伤或对侧外伤、在神经外科手术或其他手术过程中经历的创伤，或中风，如出血性中风或缺血性中风。0053因此，本发明还提供了用于治疗CNS损伤，尤其是脊髓损伤的方法，该方法包括向有需要的个体施用有效量的如本文所定义外周血单核细胞PBMC亚群。0054如本文所用，术。
30、语“治疗”或“正在治疗”损伤包括减轻其至少一种症状、降低其严重性，或延迟、预防或抑制其进展。治疗并不一定意味着损伤得到完全治愈。为了成为一种有效的治疗，本文中的有用组合物只需要降低损伤的严重性、降低与其相关联的症状的严重性或提供患者或受试者的生活质量的改善。0055在不同的方面，本发明提供了用于从血液中分离基本上不含CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞的人PMBC亚群的方法，其包括以下步骤I从血液中分离单核细胞；并且II从I的单核细胞中去除CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞，其是通过使所述单核细胞与抗CD3抗体、抗CD19抗体和抗CD56抗体接触，其中每一个抗体被连接到微珠，从而使所述细。
31、胞结合至所述微珠，并且去除微珠，由此从血液中得到人外周血单核细胞PMBC的亚群，其基本上不含CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞。0056在不同的方面，本发明提供了用于从血液中分离基本上不含CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16细胞的人外周血单核细胞PMBC亚群的方法，其包括以下步骤III从血液中分离单核细胞；并且IV从III的单核细胞中去除CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16细胞，其是通过使所述单核细胞与抗CD3抗体、抗CD19抗体、抗CD56抗体和抗CD16抗体接触，其中每一个抗体被连接到微珠，从而使所述细胞结合至所述微珠，并且去除微珠，由此从血液中得到人PMBC亚。
32、群，其基本上不含CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16。0057在某些实施方案中，步骤IV，即去除CD3细胞、CD19细胞、CD56细胞和CD16，包括以下子步骤V从III的单核细胞中去除CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞，由此从血液中得到基本上不含CD3细胞、CD19细胞和CD56细胞的人PMBC亚群；并且VI从V的PMBC细胞群去除CD16细胞，从而从血液中获得基本上不含CD3细胞、CD19细胞、说明书CN104159590A6/10页9CD56细胞和CD16细胞的人PMBC亚群。0058在一个实施方案中，步骤IV在单一步骤中进行。0059捕捉在其表面上表达所需抗原的细胞的抗。
33、体，例如CD3、CD19、CD56和/或CD16，可被生物素化，然后连接到含有抗生物素蛋白或链霉亲和素或等效生物素结合蛋白的微珠，或所述抗体可以供应至已经结合至微珠的细胞。微珠可以是磁性或非磁性的，并且如果微珠是没有磁性的，结合至微珠的细胞可通过离心分离从这些细胞悬浮于其中的溶液中去除，或如果微珠是磁性的，通过暴露于磁铁的磁场来去除。0060在优选的实施方案中，抗体在与细胞接触时被连接到磁性微珠时，通过去除细胞结合的微珠来去除细胞，其是用磁铁将它们从溶液中吸出。0061本发明现在将通过以下非限制性实施例来说明。实施例0062材料与方法0063I动物。在实验中使用的动物，如果没有不同地标明，都是。
34、由HARLANLABORATORIES，位于以色列的ISO认证SPF实验动物饲养者和以色列魏兹曼科学研究所的动物繁殖中心ANIMALBREEDINGCENTEROFTHEWEIZMANNINSTITUTEOFSCIENCEREHOVOT,以色列来提供。所有动物均根据由魏兹曼研究所的动物护理和使用委员会制定的规定办理。0064II脊髓损伤。将大鼠野生型SPRAGUEDAWLEY大鼠麻醉氯胺酮70毫克/千克，BEDFORDLABORATORIES,OH,US，甲苯噻嗪10毫克/千克，VMP,BIOULAB,法国，在T9处将椎板切除并且使用NYU冲击器来挫伤GRUNER1992AMONITOREDC。
35、ONTUSIONMODELOFSPINALCORDINJURYINTHERATJNEUROTRAUMASUMMER；921236；论述1268。综述，所述冲击器从50毫米高度将10克的金属棒落在暴露的脊髓上被认为会导致严重的伤害。将小鼠麻醉，它们的脊髓通过在T12处进行椎板切除术来暴露，并用INNITEHORIZON脊髓冲击器PRECISIONSYSTEMSANDINSTRUMENTATION,LEXINGTON,KY在椎板切除的脊髓上施加200KDYN的力，所述冲击器是被证明可施以脊髓的良好校准挫伤性损伤的装置。0065III皮肤制备，以及与单核细胞一起共同孵育。从同一供体小鼠的背部制备小片。
36、皮肤2X6毫米，所述小鼠已被放血以制备单核细胞。上背部的皮毛被剃光，并在切割前将皮肤用乙醇消毒。将两片皮肤组织与同源单核细胞部分见上文的5X106个细胞一起置于5MLDCCM1BIOLOGICALINDUSTRIES,BEITHAEMEK,以色列中，并在37，5CO2下孵育16小时。在孵育结束时，在皮肤片去除，将细胞通过离心回收。0066VBBB评分大鼠中的行为分析使用旷场运动巴索比蒂布雷斯纳汉BBB评分来进行BASSO,DM,BEATTIE,MSBRESNAHAN,JCASENSITIVEANDRELIABLELOCOMOTORRATINGSCALEFOROPENELDTESTINGINRA。
37、TSJNEUROTRAUMA12,1211995小鼠中的行为分析使用巴索小鼠量表BMS针对后肢运动功能评定在旷场进行BASSODM,FISHERLC,ANDERSONAJ,JAKEMANLB,MCTIGUEDM,POPOVICHPGBASSOMOUSESCALEFORLOCOMOTIONDETECTSDIFFERENCESINRECOVERYAFTERSPINALCORDINJURYINVECOMMONMOUSESTRAINSJNEUROTRAUMA2006年5月；23563559。说明书CN104159590A7/10页100067VII统计分析重复测量ANOVA用于BBB和BMS评分，每周。
38、通过对比T检验对治疗进行后续比较，并且通过HOLM方法来校正多重比较P005。0068实施例1腰椎穿刺注入皮肤活化巨噬细胞促进脊髓严重损伤后的大鼠功能恢复。0069起初，我们寻找使用微创方式来增加受伤脊髓中的具有所需表型的血源性单核细胞数量的临床可行方法。我们研究了通过腰椎穿刺LP将皮肤活化血源性单核细胞注入脑脊液CSF中在减少大鼠中脊髓损伤后功能障碍方面的疗效。0070表1严重脊髓损伤后的大鼠功能恢复00710072野生型SPRAGUEDAWLEY大鼠遭受严重脊髓挫伤见材料和方法。8天后，向受伤的动物通过LP将05X106或1X106皮肤活化巨噬细胞MQ或媒介物PBS注射到CSF中。展示了在。
39、促进运动功能恢复方面的剂量依赖效应，对于注射了最大剂量的巨噬细胞的动物组观察到运动有显著改善图1，表1。0073实施例2将非活化来源于骨髓的小鼠单核细胞注射至CSF中促进脊髓损伤后的小鼠功能恢复。0074另外我们测试了通过脑室内ICV注射到CSF中的非活化来源于骨髓的单核细胞是否会归巢至受伤脊髓实质。使野生型小鼠经受脊髓挫伤见材料和方法。3天之后，向受伤的动物ICV注射分离的表达绿色萤光蛋白GFP的原生骨髓源性单核细胞05X106CX3CRLGFP/单核细胞，并且分析损伤部位的所注射细胞的存在。注射后4天损伤部位的免疫组化分析揭示所注入的表达GFP的细胞在受伤实质中的存在，靠近病变部位的边缘未。
40、展示参见附图简述中的说明。以类似的方式处理的动物针对运动量表BMS评估的运动活性来跟踪单核细胞池的扩增导致了恢复超出自发恢复水平，这可以从小鼠运动显著改善看出图2。0075这些结果表明，未活化的骨髓源性单核细胞可以从CSF归巢至受伤实质，并且因此，血液CSF屏障可能是单核细胞藉以自发地进入受损CNS的途径。0076实施例3从PBMC中分离表达高水平的CX3CR1和低水平的CCR2的人单核细胞0077在人类中，单核细胞的三个群体是由CD14和CD16的表达来定义，即CD14CD16、CD14CD16和CD14DIMCD16。CD14CD16单核细胞占血液单核细胞的80至90，并表达高水平的趋化因。
41、子受体CCR2和低水平的趋化因子受体CX3CR1不规则趋化因子FRACTALKINE的受体。与此主要子集相反，人CD16单核细胞表达高水平的CX3CR1和低水平的CCR2CROS等人,2010。根据CROS等人2010，基因表达分析指示人CD14DIMCD16与鼠料巡逻GRLDIM单核细胞之间的相似之处。CD14DIMCD16细胞是涉及组织的先天局部监视和自身免疫性疾病的发病机制中的善意单核细胞。说明书CN104159590A108/10页110078方案I00790080为了从外周血单核细胞PBMC中分离出表达CX3CR1和低水平CCR2的CD14DIMCD16细胞，我们使用CCR2的阴性选。
42、择CCR2消耗与CD14的阳性选择CD14相结合的方法，而从PBMC分离CD14作为对照，如方案I示出。008131富集CD14DIMCD16细胞群0082I从人外周血中分离单核细胞从健康供体采集的新鲜血液8毫升以PBS中的25FCS11稀释，并且装载于聚蔗糖梯度上FICOLLPAQUEPLUS,AMERSHAMBIOSCIENCES。试管在1000克下、在20下离心20分钟。将单核细胞相收集，并且用PBS洗涤两次。0083IICCR2消耗首先，单核细胞通过在室温下用FCR阻断试剂25L/106细胞130059901,MILTENYIBIOTEC处理15分钟来进行FC受体阻断。然后，无需洗涤，。
43、加入单克隆抗人CCR2生物素试剂FAB151B,RDSYSTEMS10L/106细胞，并在28下孵育35分钟。然后将细胞用冷的MACSTM缓冲液1MM的EDTA，在PBS中的2FCS洗涤，并且在28下添加链霉亲和素微珠130048101,MILTENYIBIOTEC20L/107细胞20分钟。将细胞洗涤并重悬于05毫升MACSTM缓冲液中。CCR2细胞的消耗使用LD柱130042901,MILTENYIBIOTEC，根据制造商的协议来完成。0084IIICD14细胞的分离将细胞重悬于MACSTM缓冲液80L/107细胞并且在28下加入CD14微珠130050201,MILTENYIBIOTEC。
44、20L/107细胞15分钟。然后，将细胞洗涤并重悬于05毫升的MACS缓冲液。CD14细胞的阳性选择通过使用基于LS柱130042401,MILTENYIBIOTEC上磁分离，根据制造商的协议完成。0085IV人单核细胞的荧光活化细胞分选FACSTM染色，所有样品根据制造商的协议来染色。所有样品均通过70M尼龙网来过滤并且在室温下用FCR阻断试剂30L/106细胞130059901,MILTENYIBIOTEC阻断15分钟。下面的荧光染料标记的抗人单克隆抗体根据制造商的协议中使用PERCP偶联的抗CD45345809,BD、FITC标记的抗CD115FAB329F,RDSYSTEMS、PACI。
45、CBLUETM偶联的抗CD14BLG325616、ALEXA700标记的抗CD16BLG302026、PE标记的抗CX3CR1MBLD0705和PERCP偶联的抗CCR2BLG335303。008632结果0087单核细胞群体从活细胞群体中进行分析图3A，并使用CD45细胞的部位散射说明书CN104159590A119/10页12分布来确定图3B，由细黑线划定。单核细胞亚群的分布由它们的CD14和CD16抗原表达来呈现图3C。根据通过FACS的CD14和CD16染色，对于来自健康供体的PBMC的单核细胞亚群的分析揭示了以下亚群的分布CD14CD16805、CD14CD1648和CD14DIMC。
46、D1635，图3AC。有趣的是，CD14DIMCD16亚群也用属于CSF1受体并且表征骨髓源性单核细胞的标记CD115来染色图3D。0088根据通过FACS的CCR2和CX3CR1染色，对于来自健康供体的PBMC的单核细胞亚群的分析揭示，不表达CD16的单核细胞CD16亚群高度表达CCR2，而表达CD16的单核细胞CD14CD16和CD14DIMCD16亚群展示低表达的CCR2和高CX3CR1图4AE。0089这一结果鼓励我们消除CCR2细胞亚群，以富集CD16细胞的亚群。0090如从图5可以看出，CCR2细胞消耗揭示了CD14DIMCD16亚群富集约9倍由8至73并且CD14CD16亚群富集。
47、10倍从1到10，同时降低了CD14CD16亚群约5倍从91至17。0091为了研究CD16单核细胞在脊髓损伤后恢复过程中的作用，在受伤之后第4天将富集CD16亚群的单核细胞ICV注射至CSF中至小鼠。后肢运动活性使用BMS量表系统每周两次监测长达受伤后4周。用媒介物PBS治疗的对照动物表现出随着时间的推移的适度自发恢复，在BMS量表上平均达到约25。在受伤后各个时间点，治疗组CD16富集单核细胞的评分均低于对照组，表明其运动活性相较于对照组降低。我们的结论是，该亚群在SCI后第4天注入到动物的CSF中时减弱自发恢复图76。0092与我们对于CD16单核细胞发现的对于恢复的破坏作用相反，用总单。
48、核细胞亚群的治疗对于脊髓损伤的恢复是有益的，这取决于分离的方法图7。0093论述。对于单核细胞的分离，我们使用由MILTENYIBIOTEC开发的MACS技术，其基于磁分离。在原则上，血样用偶联到不同抗体的磁性微珠来标记。细胞被加载到放置于磁场中的MACS柱上。磁性标记的细胞保留于柱内，而没有标记的细胞通过。保留的细胞可以通过将柱从磁场中去除来洗脱，这被命名为阳性选择。未标记的部分，命名为阴性选择，也可被收集。0094单核细胞用两种方法分离；阳性或阴性选择。对于阳性选择，我们使用MILTENYI的CD14微珠，并且对于阴性选择，我们使用MILTENYI的单核细胞分离试剂盒II。显然，与通过阳性。
49、选择分离的细胞相比，使用阴性选择分离的单核细胞对于动物的脊髓损伤恢复表现出更好、更一致的有益效果。0095总之，对于脊髓损伤之后的治疗，CD16可被用作在有利CD16与破坏性CD16血单核细胞之间进行区分的标记。CD16单核细胞被称为经典单核细胞，并且CD16是只占所有单核细胞10的促炎性单核细胞。0096实施例4将耗尽CD3、CD19、CD56和CD16细胞的单核细胞亚群注射至CSF中促进脊髓损伤后的小鼠功能恢复。0097鉴于上述观察结果，我们开发了使用MACS阴性选择过程来分离CD16单核细胞的程序。PBMC用偶联至CD3、CD19和CD56的微珠来标记以耗尽T细胞、B细胞和NK细胞。通过磁柱的未标记的细胞被收集。该部分用CD16微珠标记并且再次加载于磁柱上。将通过该柱的细胞收集，并且用CD14和CD16荧光抗体染色以在FACS中分析。左图表示分离之前的PBMC图8A并且右图图8B表示如上所述阴性选择之后的最终产物。在PBMC中，说明书CN104159590A1210/10页13总活细胞的19是单核细胞CD14。在单核细胞中，约10是CD16。在最终产物中，约90的活细胞是单核细胞，其中CD16少于01。0098这两个亚群在。