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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810601284.8 (22)申请日 2018.06.12 (71)申请人 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 地址 350013 福建省福州市晋安区新店埔 档 (72)发明人 王锦祥 谢喜平 陈岩锋 桑雷 孙世坤 陈冬金 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (51)Int.Cl. A61K 39/116(2006.01) A61K 39/02(2006.01) A61K 39/085(2006.01) A61P 31/04(20。
2、06.01) (54)发明名称 兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫 苗及制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病 二联组织灭活疫苗及其制备方法。 所述兔葡萄球 菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗， 由兔葡萄 球菌病组织灭活抗原液和兔波氏杆菌病组织灭 活抗原液按照3:1的体积比组成。 兔葡萄球菌病 组织灭活抗原液由兔葡萄球菌病患兔的病变组 织经匀浆、 过滤、 离心沉淀和灭活制备而成； 兔波 氏杆菌病组织灭活抗原液由兔波氏杆菌病患兔 的病变组织经匀浆、 过滤、 离心沉淀和灭活制备 而成。 本发明的二联组织灭活疫苗针对性强、 安 全性高， 能有效的预防兔葡萄球菌病和兔波。
3、氏杆 菌病的发生。 权利要求书2页 说明书5页 CN 108721614 A 2018.11.02 CN 108721614 A 1.兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗， 其特征在于： 由兔葡萄球菌病组织灭 活抗原液和兔波氏杆菌病组织灭活抗原液按照 3:1 的体积比组成。 2.根据权利要求 1 所述的兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗， 其特征在 于： 每毫升兔葡萄球菌病组织灭活抗原液的总蛋白含量不高于5mg且不低于 500 g； 每毫升 兔波氏杆菌病组织灭活抗原液的总蛋白含量不高于5mg且不低于 500 g。 3.制备权利要求 1或2所述兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活。
4、疫苗的方法， 其特 征在于： 包括如下步骤： （1） 分别制备兔葡萄球菌病组织抗原液和兔波氏杆菌病组织抗原液， 分别加入终浓度 为 0.4% 的甲醛灭活， 得到兔葡萄球菌病组织灭活抗原液和兔波氏杆菌病组织灭活抗原 液， 备用； （2） 将步骤 （1） 所得的兔葡萄球菌病组织灭活抗原液和兔波氏杆菌病组织灭活抗原液 按照 3:1 的体积比进行配苗， 充分混匀， 即得兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫 苗。 4.根据权利要求3 所述的方法， 其特征在于， 所述兔葡萄球菌病组织灭活抗原液制备 方法为： （1） 兔葡萄球菌病病料 选取自然发病、 临床症状包括脚皮炎、 乳房炎、 气管炎、 支气管炎、。
5、 肺炎、 化脓性肺炎、 皮 下脓肿以及其他组织器官脓肿等一种或几种且检测确定为金黄色葡萄球菌感染的患兔， 无 菌采集病变组织， 制成组织匀浆， 现用； （2） 金黄色葡萄球菌增殖 将步骤 （1） 所述组织匀浆接种健康兔使其感染金黄色葡萄球菌， 采集接种兔的相关组 织， 现用或 -20 保存； （3） 兔葡萄球菌病组织抗原液制备 将步骤 （2） 所述相关组织剔除脂肪和结缔组织， 称重， 加入 4 预冷的灭菌生理盐水 或磷酸盐缓冲液， 制成组织匀浆； 组织匀浆经 3 次冻融后过滤， 滤液于 4 过夜， 除去油 脂， 离心， 除去沉淀， 获得抗原液； （4） 兔葡萄球菌病组织抗原液灭活 向步骤 （3。
6、） 所得抗原液加入终浓度为 0.4% 的甲醛， 37 灭活 24h， 获得兔葡萄球菌 病组织灭活抗原液。 5.根据权利要求 3所述的方法， 其特征在于， 所述兔波氏杆菌病组织灭活抗原液制备 方法： （1） 兔波氏杆菌病病料 选取自然发病， 临床症状包括喷嚏、 鼻炎、 气管炎、 支气管炎、 肺炎以及脓疱性肺炎等一 种或几种且检测确定为支气管败血波氏杆菌感染的患兔， 无菌采集病变组织， 制成组织匀 浆， 现用； （2） 支气管败血波氏杆菌增殖 将步骤 （1） 所述组织匀浆接种健康兔使其感染支气管败血波氏杆菌， 采集接种兔的相 关组织， 现用或 -20 保存； （3） 兔波氏杆菌病组织抗原液制备 权。
7、 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 108721614 A 2 将步骤 （2） 所述病变组织剔除脂肪和结缔组织， 称重， 加入 4 预冷的灭菌生理盐水 或磷酸盐缓冲液， 制成组织匀浆； 组织匀浆经 3 次冻融后过滤， 滤液于 4 过夜， 除去油 脂， 离心， 除去沉淀， 获得抗原液； （4） 兔波氏杆菌病组织抗原液灭活 向步骤 （3） 所得抗原液加入终浓度为 0.4% 的甲醛， 37 灭活 24h， 获得兔波氏杆菌 病组织灭活抗原液。 6.一种如权利要求 1所述的兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗在兔养殖过 程中的应用。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 108721614。
8、 A 3 兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗及制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭 活疫苗及其制备方法。 背景技术 0002 兔葡萄球菌病是由金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus） 感染兔引起的一种 多症状传染病。 临床上该病主要以脚皮炎、 乳房炎、 皮下脓肿、 全身各种组织和器官脓肿为 特征， 也可见呼吸道症状。 伴随呼吸道症状的死亡兔或濒临死亡兔表现为机体极度消瘦和 化脓性肺炎。 兔葡萄球菌病多发于温暖潮湿的季节， 不同年龄和品种的兔均可发病。 0003 兔波氏杆菌病是由支气管败血波氏杆菌 。
9、（Bordetella bronchiseptica） 感染兔引 起的一种呼吸道传染病。 临床上该病主要以喷嚏、 咳嗽、 鼻炎、 支气管肺炎和脓疱性肺炎等 为特征。 兔波氏杆菌病在季节交替且温差大时多发， 不同年龄和品种的兔均可发病。 0004 兔葡萄球菌病和波氏杆菌病都是兔养殖过程中的常发病， 给养兔业造成严重的经 济损失。 因此， 提供一种有效的兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联疫苗具有重要意义。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗及其制 备方法。 0006 本发明实现上述目的， 采用技术方案如下： 兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗。
10、的制备方法， 包括以下步骤： 一、 兔葡萄球菌病组织灭活抗原液的制备 1. 兔葡萄球菌病病料 选取自然发病， 经检测为金黄色葡萄球菌感染死亡或濒临死亡的患兔， 无菌采集病变 组织 （气管、 肺脏、 肝脏、 脾脏、 乳房炎组织、 脚皮炎组织、 皮下脓肿组织、 其他化脓性病变组 织） ， 以病变组织和 4 预冷灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液按照质量体积比 （W / V） 为 1: 2 混合， 制成组织匀浆， 现用； 2. 金黄色葡萄球菌增殖 将步骤 1 所得组织匀浆滴鼻接种健康兔使其感染金黄色葡萄球菌， 接种兔于隔离器 中饲养 7-30 d， 待接种兔鼻腔出现黄色黏稠鼻液或机体极度消瘦时扑杀， 无菌条。
11、件下取出 气管、 肺脏、 肝脏、 脾脏和淋巴结等组织器官， 现用或 -20 保存； 3. 兔葡萄球菌病组织抗原液制备 将步骤 2 所得组织器官剔除脂肪和结缔组织， 称重， 以病变组织和 4 预冷灭菌生 理盐水或磷酸盐缓冲液按照质量体积比 （W / V） 为 1:2 混合， 制成组织匀浆； 组织匀浆连 续冻融 3 次后过滤， 滤液于 4 过夜， 除去油脂， 再离心除去沉淀， 获得抗原液； 4. 兔葡萄球菌病组织抗原液灭活 向步骤 3 所得兔葡萄球菌病组织抗原液中加入终体积浓度为 0.4% 的甲醛， 37 灭 说 明 书 1/5 页 4 CN 108721614 A 4 活 24h， 获得兔葡萄球。
12、菌病组织灭活抗原液。 0007 二、 兔波氏杆菌病组织灭活抗原液的制备 1. 兔波氏杆菌病病料 选取自然发病， 经检测为支气管败血波氏杆菌感染死亡或濒临死亡的患兔， 无菌采集 病变组织 （气管、 支气管、 肺脏和肝脏） ， 以病变组织和 4 预冷灭菌生理盐水或磷酸盐缓 冲液按照质量体积比 （W / V） 为 1:2 混合， 制成组织匀浆， 现用； 2. 支气管败血波氏杆菌增殖 将步骤 1 所得组织匀浆经鼻腔滴鼻接种健康兔使其感染支气管败血波氏杆菌， 接种 兔于隔离器中饲养 7-30 d， 待接种兔鼻腔出现黄色黏稠鼻液时扑杀， 无菌条件下取出气 管、 肺脏、 肝脏、 脾脏和淋巴结等组织器官， 现。
13、用或 -20 保存； 3. 兔波氏杆菌病组织抗原液制备 将步骤 2 所得组织器官剔除脂肪和结缔组织， 称重， 以组织和 4 预冷灭菌生理盐 水或磷酸盐缓冲液按照质量体积比 （W / V） 为 1:5 混合， 制成组织匀浆； 组织匀浆连续冻 融 3 次后过滤， 滤液于 4 过夜， 除去油脂， 再离心除去沉淀， 获得抗原液； 4. 兔波氏杆菌病组织抗原液灭活 向步骤 3 所得兔葡萄球菌病组织抗原液加入终体积浓度为 0.4% 的甲醛， 37 灭活 24h， 获得兔波氏杆菌病组织灭活抗原液。 0008 三、 兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗的配制 将上述步骤制备的兔葡萄球菌病组织灭活抗原液和。
14、兔波氏杆菌病组织灭活抗原液按 照体积比 （V / V） 3:1 充分混匀， 获得兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗。 每毫 升兔葡萄球菌病组织灭活抗原液的总蛋白含量不高于5mg且不低于 500 g； 每毫升兔波氏 杆菌病组织灭活抗原液的总蛋白含量不高于5mg且不低于 500 g。 0009 本发明的优点在于： 兔葡萄球菌病和波氏杆菌病都是兔养殖过程中的常发病， 给 养兔业造成严重的经济损失。 然而， 尚未有预防该两种兔常发病的商品化疫苗。 本发明提供 的二联组织灭活疫苗具有确实的免疫效果， 能有效的预防该两种兔常发病的发生。 此外， 根 据本发明实施例的结果， 本发明的二联组织灭活疫苗。
15、免疫兔后无相互干扰， 能减少免疫次 数， 实现一针两防的功效。 具体实施方式 0010 以下结合实施例， 对本发明涉及的技术方案进行详细阐述。 0011 实施例1 一、 兔葡萄球菌病组织灭活抗原液的制备 1. 兔葡萄球菌病病料 选取自然发病， 经检测为金黄色葡萄球菌感染死亡或濒临死亡的患兔， 无菌采集病变 组织 （气管、 肺脏、 肝脏、 脾脏、 乳房炎组织、 脚皮炎组织、 皮下脓肿组织、 其他化脓性病变组 织） ， 除去病变组织中的脂肪和结缔组织， 称取 100g 病变组织， 切碎， 加入 200mL 4 预 冷的灭菌生理盐水， 在冰浴中匀浆， 现用； 2. 金黄色葡萄球菌增殖 选取体重约 1。
16、.5kg、 金黄色葡萄球菌抗体阴性、 金黄色葡萄球菌阴性的健康兔， 滴鼻 说 明 书 2/5 页 5 CN 108721614 A 5 （每个鼻孔 50 L） 接种步骤 1 所得组织匀浆， 接种兔饲养于隔离器中 25d。 待接种兔鼻腔 出现黄色黏稠鼻液或机体极度消瘦时扑杀， 无菌条件下取出气管、 肺脏、 肝脏、 脾脏和淋巴 结， 现用或 -20 保存； 3. 兔葡萄球菌病组织抗原液制备 3.1 除去步骤 2 所得组织器官的脂肪和结缔组织， 称取 500g 组织， 切碎， 加入 1000mL 4 预冷的灭菌生理盐水， 于冰浴中匀浆； 3.2 将步骤 3.1 所得组织匀浆连续冻融 3 次； 3.3。
17、 用 2 层灭菌纱布在无菌条件下将步骤 3.2 所得匀浆过滤， 滤液于 4 过夜， 除 去上层油脂。 再经 4， 2000rpm， 离心 1h， 取上清， 即为兔葡萄球菌病组织抗原液。 经上述 步骤， 所得的抗原液约 1100mL。 0012 4. 兔葡萄球菌病组织抗原液灭活 向步骤 3 所得兔葡萄球菌病组织抗原液加入终体积浓度为 0.4% 的甲醛， 37 灭活 24h， 获得兔葡萄球菌病组织灭活抗原液。 0013 二、 兔波氏杆菌病组织灭活抗原液的制备 1. 兔波氏杆菌病病料 选取自然发病， 经检测为支气管败血波氏杆菌感染死亡或濒临死亡的患兔， 无菌采集 病变组织 （气管、 支气管、 肺脏和。
18、肝脏） ， 除去病变组织中的脂肪和结缔组织， 称取 100g 病 变组织， 切碎， 加入 200mL 4 预冷的灭菌生理盐水， 在冰浴中匀浆， 现用； 2. 支气管败血波氏杆菌增殖 选取体重约 1.5kg、 支气管败血波氏杆菌抗体阴性、 支气管败血波氏杆菌阴性的健康 兔， 滴鼻 （每个鼻孔 50 L） 接种步骤 1 所得组织匀浆， 接种兔饲养于隔离器中25d。 待接种 兔连续咳嗦和鼻腔出现黄色黏稠鼻液时扑杀， 无菌条件下取出气管、 肺脏、 肝脏、 脾脏和淋 巴结， 现用或 -20 保存； 3. 兔波氏杆菌病组织抗原液制备 3.1 除去步骤 2 所得组织器官的脂肪和结缔组织， 称取 100g 组。
19、织， 切碎， 加入 500mL 4 预冷的灭菌生理盐水， 于冰浴中匀浆； 3.2 将步骤 3.1 所得组织匀浆连续冻融 3 次； 3.3 用 2 层灭菌纱布在无菌条件下将步骤 3.2 所得匀浆过滤， 滤液于 4 过夜， 除 去上层油脂。 再经 4， 2000rpm， 离心 1h， 取上清， 即为兔波氏杆菌病组织抗原液。 经上述 步骤， 所得的抗原液约 520mL。 0014 4. 兔波氏杆菌病组织抗原液灭活 向步骤 3 所得兔波氏杆菌病组织抗原液加入终体积浓度为 0.4% 的甲醛， 37 灭活 24h， 获得兔波氏杆菌病组织灭活抗原液。 0015 三、 二兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病联组织灭活疫。
20、苗配制 取兔葡萄球菌病组织灭活抗原液 900mL， 取兔波氏杆菌病组织灭活抗原液 300mL， 充 分混匀， 获得 1200mL 兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗。 0016 四、 兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗安全性检测 1. 细菌检测 取 0.2mL 兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗， 无菌条件下均匀地涂于脱纤 说 明 书 3/5 页 6 CN 108721614 A 6 绵羊血琼脂平板， 试验重复 3 次， 37 培养 72h， 观察有无细菌生长。 结果为阴性， 说明兔 葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗灭活彻底， 无细菌污染； 2. 动物毒性试验 。
21、2.1 小鼠毒性试验 取 20 只 5 周龄雌性昆明小鼠， 平均分为 2 组。 实验组： 腹腔注射 0.5mL 兔葡萄球 菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗； 对照组： 腹腔注射 0.5mL 灭菌生理盐水。 观察 14d。 试验期间， 试验组、 对照组小鼠均活泼健康， 说明组织灭活疫苗安全无毒。 0017 2.2 兔毒性试验 选取 20 只 45 日龄， 金黄色葡萄球菌抗体阴性、 金黄色葡萄球菌阴性、 支气管败血波 氏杆菌抗体阴性和支气管败血波氏杆菌阴性的健康兔， 平均分为 2 组， 雌雄各半。 实验组： 颈部皮下分两点各注射 2.0mL 兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗； 对照组：。
22、 颈 部皮下分两点各注射 2.0mL 灭菌生理盐水。 观察 14d。 试验期间， 试验组、 对照组兔均活泼 健康、 采食量无显著差异， 说明兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗安全无毒。 0018 五、 兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗免疫效果评价 1. 选取 140 只 45 日龄， 金黄色葡萄球菌抗体阴性、 金黄色葡萄球菌阴性、 支气管败 血波氏杆菌抗体阴性和支气管败血波氏杆菌阴性的健康兔， 随机平均分为 7 组， 雌雄各 半。 0019 试验 1 组： 试验动物于 45 日龄经颈部皮下注射 1.0mL 兔葡萄球菌病组织灭活 疫苗， 60 日龄再次注射 1.0mL 疫苗， 。
23、75日龄经鼻腔接种 100 L （每个鼻孔各接种 50 L） 兔 葡萄球菌病组织匀浆； 试验 2 组： 试验动物于 45 日龄经颈部皮下注射 1.0mL 兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病 二联组织灭活疫苗， 60 日龄再次注射 1.0mL 疫苗， 75日龄经鼻腔接种 100 L （每个鼻孔各 接种 50 L） 兔葡萄球菌病组织匀浆； 对照 1 组： 试验动物于 45 日龄经颈部皮下注射 1.0mL 灭菌生理盐水， 60日龄再次 注射 1.0mL 灭菌生理盐水， 75日龄经鼻腔接种 100 L （每个鼻孔各接种 50 L） 兔葡萄球菌 病组织匀浆； 试验 3 组： 试验动物于 45 日龄经颈部皮下注射。
24、 1.0mL 波氏杆菌病组织灭活疫苗， 60 日龄再次注射 1.0mL 疫苗， 75 日龄经鼻腔接种 100 L （每个鼻孔各接种 50 L） 兔波氏 杆菌病组织匀浆； 试验 4 组： 试验动物于 45 日龄经颈部皮下注射 1.0mL 兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病 二联组织灭活疫苗， 60 日龄再次注射 1.0mL 疫苗， 75日龄经鼻腔接种 100 L （每个鼻孔各 接种 50 L） 兔波氏杆菌病组织匀浆； 对照 2 组： 试验动物于 45 日龄经颈部皮下注射 1.0mL 灭菌生理盐水， 60日龄再次 注射 1.0mL 灭菌生理盐水， 75日龄经鼻腔接种 100 L （每个鼻孔各接种 50 L。
25、） 兔波氏杆菌 病组织匀浆； 正常对照组： 试验动物不做任何处理； 试验期 30d。 0020 2. 统计试验 1 组、 试验 2 组和对照 1 组试验动物由金黄色葡萄球菌感染导致 的发病率和死亡率， 试验结束时剖解试验动物， 观察病变， 采集相关组织进行金黄色葡萄球 菌的分离和鉴定。 说 明 书 4/5 页 7 CN 108721614 A 7 0021 3. 统计试验 3 组、 试验 4 组和对照 2 组试验动物由支气管败血波氏杆菌感染 导致的发病率和死亡率， 试验结束时剖解试验动物， 观察病变， 采集相关组织进行支气管败 血波氏杆菌的分离和鉴定。 0022 4. 结果：（1） 与对照 1。
26、 组相比， 试验 2 组试验兔免疫兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病 二联组织灭活疫苗后， 由金黄色葡萄球菌感染导致的发病率明显降低； 与试验 1 组相比， 试验 2 组试验兔免疫二联组织灭活疫苗后， 发病率均为 10%， 死亡率均为 0。 0023 （2） 与对照 2 组相比， 试验 4 组试验兔免疫兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织 灭活疫苗后， 由支气管败血波氏杆菌感染导致的发病率明显降低； 与试验 3 组相比， 试验 4 组试验兔免疫二联组织灭活疫苗后， 发病率均为 5%， 死亡率均为 0。 0024 详细结果见表 1。 0025 表 1 兔葡萄球菌病、 波氏杆菌病二联组织灭活疫苗免疫后由金黄。
27、色葡萄球菌或 支气管败血波氏杆菌感染导致的发病率和死亡率 注： 1. 试验 1 组、 试验 2 组和对照 1 组发病的判定依据为： 试验动物呼吸道有病变 且病变组织中金黄色葡萄球菌阳性， 同时无其他引起试验动物发病的病原 （如兔病毒性出 血症病毒、 多杀性巴氏杆菌、 支气管败血波氏杆菌等） ； 死亡的判定依据为： 试验动物呼吸道 有病变且病变组织中金黄色葡萄球菌阳性， 同时无其他引起试验动物死亡的病原 （如兔病 毒性出血症病毒、 多杀性巴氏杆菌、 支气管败血波氏杆菌等） 。 0026 2. 试验 3 组试验 4 组和对照 2 组发病的判定依据为： 试验动物呼吸道有病变 且病变组织中支气管败血波氏杆菌阳性， 同时无其他引起试验动物发病的病原 （如兔病毒 性出血症病毒、 多杀性巴氏杆菌、 金黄色葡萄球菌等） ； 死亡的判定依据为： 试验动物呼吸道 有病变且病变组织中支气管败血波氏杆菌阳性， 同时无其他引起试验动物死亡的病原 （如 兔病毒性出血症病毒、 多杀性巴氏杆菌、 金黄色葡萄球菌等） 。 0027 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰， 皆应属本发明的涵盖范围。 说 明 书 5/5 页 8 CN 108721614 A 8 。