用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片 【技术领域】
本发明涉及一种基因芯片， 具体讲是一种用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片。 背景技术 心房颤动 (atrial fibrillation) 简称 “房颤” ， 它是一种常见的心律失常， 常并发 于风湿性心脏病、 冠心病和先天性心脏病。 房颤会促发心力衰竭或血流动力学障碍， 诱发室 速或室颤等致命性心律失常， 导致血栓和栓塞事件， 增加基础心脏病的死亡率， 使脑卒中发 生的危险增加五倍、 心力衰竭的危险提高四倍、 死亡或痴呆的危险提高两倍， 房颤本身还可 以引起心脏扩大。
根据世界卫生组织的定义， 房颤的症状表现为心肌丧失了正常有规律的舒缩活 动， 而代之以快速而不协调的微弱蠕动， 致使心房失去正常的有效收缩， 导致心房不规则 的、 杂乱无章的电活动， 房性心动过速， 心电图上 P 波消失， 代之以小 f 波， 频率约 350-600 次 / 分钟， 即基线上形状、 大小、 方向和时程不一的颤动波， 在没有高度或完全性房室传导 阻滞情况下心室率完全不等。
按时间划分， 房颤分为急性房颤和慢性房颤， 慢性房颤又分为阵发性、 持续性和永 久性房颤， 阵发性、 可自行终止的房颤为阵发性房颤， 房颤持续三周以上、 发作后不能自行 终止、 但经治疗后能终止的房颤为持续性房颤， 经治疗后也不能终止的房颤为永久性房颤。
按是否与其他心血管疾病并发来划分， 房颤可分为孤立性房颤和典型性房颤， 孤 立性房颤指无明确的心脏病变基础的心房颤动， 即不伴有相关心血管疾病的房颤 ； 典型性 房颤指伴有相关心血管疾病的房颤， 与房颤有关的心血管基础疾病包括瓣膜性心脏病 ( 大 多为二尖瓣性 )、 冠心病、 高血压、 缺血性心脏病和充血性心衰等。
房 颤 已 成 为 全 世 界 范 围 内 一 种 新 的 流 行 病， 据 统 计， 美国房颤发病率为 0.4％ -0.9％， 随着年龄的增长， 发病率急剧增高， 在 65 岁以上者则高达 3％ -5％， 而欧洲的 房颤发病率与美国相仿， 亚洲的房颤发病率与前二者相比略低。 尽管如此， 中国也已有 1000 万房颤患者， 而且其发病率快速上升， 并有向年轻人转移的趋势。 房颤严重地危害着人类的 健康， 也给社会带来了相当的经济负担。
因此预防、 诊断和治疗房颤成为需要迫切解决的重要医学问题。房颤治疗的目的 是恢复心脏正常的节律性搏动， 或控制合理的心室速率， 防止脑卒中等严重并发症的出现 等。
近 20 年来， 许多学者尝试通过外科手术治愈房颤， 取得了很大进展， 其中， 以迷宫 手术效果最好。 1987 年美国心脏医生发明迷宫手术， 按精心设计的线路在右心房、 房间隔及 左心房分别沿环形线性切开多处， 再缝合起来， 形成一个狭窄而弯曲的心房组织通道， 即人 造一个迷宫， 阻止折返， 将引起房颤的异常传导环路打断， 使房颤不能发生， 却能引导脉冲 从窦房结传到房室结， 从而治愈房颤。随着各种新技术的发展完善 ( 例如根据迷宫手术原 迷宫手术不断得到简化和改进， 其并发症少， 疗 理， 在心房中应用射频消融手术治疗房颤 )，
效提高， 迷宫手术治疗房颤已成为疗效比较确切和可靠的一种方法。
尽管如此， 随访的研究表明， 迷宫手术治疗后仍有约 15％的病人容易复发。 房颤的 术后复发原因显然是多方面的， 如高血压， 糖尿病， 心衰， 心梗， 肥胖和血管性疾病等。
目前的研究无法对房颤的发生机制作清晰的病因学阐述， 它是多种病因的综合疾 病， 包括心血管疾病及其他风险因素。 房颤与某些急性、 暂时性原因有关， 包括饮酒、 外科手 术、 电击、 心肌炎、 肺栓塞、 其它肺脏病以及甲状腺机能亢进， 房颤也是心肌梗塞和心胸外科 手术后较常见的早期并发症。
孤立性房颤没有明显结构上的心脏疾病， 年轻人也会患有孤立性房颤， 孤立性房 颤的患者与典型性房颤的年老患者相比， 更可能突然性地发病， 家族型聚集和早发病是孤 立性房颤的突出特征， 近 30％的孤立性房颤家族渊源者有至少一个轻度患有此症的亲属。
典型性房颤的风险因素包括年老、 肥胖、 高血压、 心力衰竭、 心脏瓣膜病、 甲状腺机 能亢进和家族病， 而且有亲属患有此症的个体也具有更高的房颤患病风险。
大量证据提示房颤病情的加重是心房内不断积累的结构重构和电生理重构的结 果， 房颤一旦发生， 左心房就按组织学重构、 电重构规律发展下去， 即便病因去除， 房颤仍然 会发生。可以说它是致命性的， 所以做好房颤的预防是很有必要的。 最近的研究提供了遗传性因素对房颤影响的有力证据， 表明了房颤的发生和治疗 转归可能和患者自身的体质即基因的关系可能更为密切。 根据个体差异判断迷宫手术治疗 房颤的疗效、 选择合适的手术方案并有效地预防其复发， 是房颤治疗中待解决的重要问题。
由于房颤的直接病因到现在仍未明了， 迷宫手术后引起房颤复发的直接原因也不 清楚， 因此预防房颤复发存在一定困难， 即人们无法知道术后哪方面的因素引起房颤的复 发， 也就无法防止其发生或阻断其复发的某一环节。 尽管如此， 通过各种研究手段和临床试 验， 人们还是发现一些与迷宫手术后房颤预后相关的遗传学因子。
人们探索了房颤的致病基因和与房颤显著相关的 SNP 位点， 但是以往的报道往往 集中在一个或少数几个基因及 SNP 位点， 而房颤的术后复发是由多因素调节的复杂过程， 既往的研究难以反映复杂的复发过程的整体本质。
如果同时对多种易感基因及多个与房颤显著相关的 SNP 位点进行分析， 则有助于 阐明各种易感基因之间的相互作用机制及其对房颤术后复发的影响。目前尚无足够特别、 敏感的针对亚洲人群的房颤复发预测指标和预测模型， 国内外也没有对房颤术后复发的多 基因及多个相关 SNP 位点预测芯片的应用。
发明内容 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷， 提供一种用于预测迷宫手术 治疗房颤疗效的基因芯片， 此基因芯片可检测多个与房颤显著相关的 SNP 位点， 迅速便捷 地对普通人群进行筛查， 准确率高， 成本较低， 可用于批量检测， 能充分满足大规模基因筛 选的要求。
为解决上述技术问题， 本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片， 它 包括针对 rs2200733 位点、 rs10033464 位点、 rs13376333 位点、 rs6843082 位点、 rs17042171 位点、 rs2106261 位点和 rs7193343 位点而设计的寡核苷酸探针和能特异性扩增出包括上 述 SNP 位点的 DNA 片段的特异性引物， 所述特异性引物的 5’ 端预先均用信号物质进行标记。
作为优选， 所述寡核苷酸探针具有 SEQ ID NO.1-NO.56 所示的核苷酸序列。 作为优选， 所述特异性引物具有 SEQ ID NO.57-NO.70 所示的核苷酸序列。 作为优选， 所述特异性引物的 5’ 端预先均用荧光素、 同位素、 生物素或地高辛进行标记。 作为优选， 所述基因芯片还包括固相载体， 所述固相载体为经过表面化学基团修 饰的玻璃基质或尼龙膜， 所述寡核苷酸探针的末端带有修饰氨基， 所述固相载体的化学基 团可与寡核苷酸探针的修饰氨基共价结合。
作为改进， 所述基因芯片还包括一个阴性对照样本和一个阳性对照样本。
作为改进， 所述基因芯片还包括杂交盒和杂交液。
作为进一步改进， 所述基因芯片还包括 DNA 取样试剂、 PCR 扩增试剂和 PCR 产物纯 化试剂。
本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片， 其制备方法为 ：
(1) 使用寡核苷酸合成仪制备所述寡核苷酸探针和特异性引物， 将特异性引物的 5’ 端预先均用信号物质进行标记 ；
(2) 使用基因芯片点样仪将所述寡核苷酸探针点制在经过醛基修饰的固相载体 上， 干燥后制得基因芯片。
本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片， 其使用方法为 ：
(1) 使用所述 DNA 取样试剂提取患者 DNA ；
(2) 使用所述特异性引物和所述 PCR 扩增试剂扩增包括目标 SNP 位点的 DNA 片段 ；
(3) 将同一样本的各个 PCR 扩增产物混合， 加入杂交液后与所述芯片杂交 ；
(4) 使用扫描仪扫描杂交信号。
本发明选取了全基因组关联研究 (6WAS) 与房颤显著相关的 7 个 SNP 位点。
染 色 体 4q25 基 因 座 为 与 房 颤 紧 密 相 关 的 一 个 基 因 座， rs2200733 位 点、 rs10033464 位点、 rs6843082 位点和 rs17042171 位点均在此基因座内。
其中 rs2200733 位点、 rs10033464 位点位于染色体 4q25 的一个单一的连锁不平 衡区域内， 在年轻患者和患有孤立性房颤的患者中， 上述两个 SNP 位点与房颤的相关性尤 为显著。该连锁不平衡区域不存在已知基因， 却包含一个剪接的表达序列标签 (DA725631) 和两个独立外显子表达序列标签 (DB324364 和 AF017091)。对取自各种组织的互补 DNA 文 库进行逆转录酶介导的聚合酶链式反应， 并没有检测到这些表达序列标签 (EST) 的表达。 位于该连锁不平衡区域毗邻的上游的 PITX2 基因是与这两个风险突变 SNP 位点距离最近的 基因。PITX2 基因通过介导心脏不对称形态的发生而在心脏发育中起重要作用， 它编码的 蛋白为成对型同源区转录因子 2( 即 paired-liked homeodomain transcription factor 2)， 可调节心肌细胞、 心脏神经胚细胞和咽弓间充质细胞， 其基因突变可引起心脏左右信号 传导改变。
rs6843082 位点与房颤最为紧密相关， 而 rs17042171 位点距离转录因子基因 PITX2 约 150kb 端粒， 也与房颤具有显著相关性。
rs13376333 位点位于染色体 1q21 上， 它与孤立性房颤的相关性尤为显著， 与典型 性房颤也相关， 虽然相关性不够紧密。rs13376333 位于 KCNN3 基因第一和第二外显子之间 的内含子上， 它没有与 KCNN3 基因上任何已知的普通非同义 SNP 位点连锁不平衡。 KCNN3 基
因编码了参与心房复极化的钾通道蛋白， 此蛋白属于弱传导钙激活钾通道蛋白家族， 此蛋 白最大的特点是影响可兴奋细胞的放电类型， 例如在一些神经元中影响相位型放电， 而在 另一些神经元影响连续型放电， 因而此蛋白在许多易兴奋组织中被表达， 包括大脑和心脏。
rs2106261 位点和 rs7193343 位点均位于染色体 16q22 上的 ZFHX3 基因 ( 锌指同 源框基因， 也称 AT 模式绑定银子， 即 ATBF1) 内， 这两个位点均为 ZFHX3 基因的内含子 SNP 位点， 与孤立性房颤和典型性房颤均紧密相关。ZFHX3 基因编码一种名为 Atbf1 的转录因 子， 此蛋白是最大的已知 DNA 结合蛋白， 与一些组织的生长和分化的调节有关， 具体来说是 调节肌源性和神经性分化。 ZFHX3 在许多组织中被表达， 例如心脏、 肝脏、 肺、 肾脏、 脑下垂体 和大脑。
Atbf1 为 POU 类 1 同源框 1(POU1F1) 基因早期转录激活的所需蛋白， POU1F1 基因 是调节哺乳动物脑垂体细胞分化和激素表达的 POU- 同源域转录因子家族的一员。POU1F1 与 PITX2 基因相互作用， 促进 DNA 结合和转录活性， 这两个基因之间的相互作用具有重要 意义， 因为之前已确定的染色体 4q25 上的房颤突变 SNP 位点位于与 PITX2 毗邻的位置， 而 PITX2 基因对心脏发育有关键作用。
基因多态性是指人群中不同个体之间基因核苷酸序列的差异性， 而 SNP( 单核苷 酸多态性 ) 则是指基因核苷酸序列中某个位点上单个核苷酸的变异性， 如果一个群体中同 一位点存在两种以上等位基因， 并且最低基因频率≥ 1％， 即认为具有 SNP。 SNP 在人类基因 组中广泛存在， 平均密度约为 1/1000bp， 其总数可达 300 万个甚至更多。SNP 是人类可遗传 的变异中最常见的一种， 占所有已知多态性的 90％以上， 因此 SNP 可作为第三代的遗传标 记。 SNP 所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异， 这种变异主要由单个碱基的转 换 (transition) 或颠换 (transversion) 所引起， 也可由碱基的插入 (insertion) 或缺失 (deletion) 所致。
在基因组 DNA 中， 任何碱基均有可能发生变异， 因此 SNP 既有可能在编码序列内， 也有可能在非编码序列上。 SNP 是基因组 DNA 序列变异的主要形式， 是决定人类疾病 ( 尤其 是多基因疾病 ) 易感性和药物反应性个体差异的核心信息。相当一部分 SNP 的频率在不同 种族、 人群中有着显著差异。 SNP 本身只轻度或不改变通道蛋白的功能， 通常不直接致病， 但 改变个体对疾病的易感性。
SNP 可影响其他突变基因的致病性， 同一基因突变， 在不同多态性背景下致病性可 能不同。需要注意的是， SNP 的生物学作用可能并不被发现， 尤其在多基因疾病中， 其他的 很多附加因素共同作用影响了疾病的表现型， 从而隐藏了多态性的作用。
另外， 遗传异质性的问题亦不容忽视。同一个基因的同一种多态性在不同种族或 不同数量人群中， 得出的结论可能不同甚至完全相反。
本发明所选取的 7 个 SNP 位点均为针对亚洲人种的房颤显著相关 SNP 位点。
本发明的技术方案中， DNA 提取、 PCR 扩增、 PCR 产物纯化和基因芯片等均为常规的 分子生物学技术。
基因芯片技术是近年迅速发展起来的一项前沿分子生物学技术， 它又被称为 DNA 芯片或 DNA 微阵列， 是生物芯片的一种。它通过与计算机图像分析的有机结合， 在一次实验 中可对样品中靶分子的质量或数量进行快速、 准确、 高效的检测。具体来说， 基因芯片是指
将大量人工合成的或应用常规分子生物学技术获得的核酸片段作为探针， 所述探针包含特 定的核苷酸序列， 采用微量点样等方法， 使所述探针按照特定的排列方式和特定的手段固 化于支持物 ( 如玻片、 硅片、 塑料片、 聚丙烯酰胺凝胶篇或尼龙膜等载体 ) 的表面， 形成密集 二维分子排列。然后与已标记的待测生物样品中靶分子进行杂交， 通过特定的扫描仪如光 学扫描仪、 激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影相机 (CCD) 对杂交信号进行快速、 并行、 高效 地分析， 从而判断样品中靶分子的数量和质量。
PCR( 即聚合酶链式反应， Polymerase Chain Reaction) 是最常用的分子生物学技 术之一， 是由体外酶催化扩增特异 DNA 的一种方法。典型的 PCR 一般包括高温使模板 DNA 变性、 引物和模板退火、 引物沿模板延伸三步反应组成的循环， 经过上述多次循环反应， 使 目的 DNA 得以迅速大量扩增。
本发明的寡核苷酸探针根据房颤术后复发相关基因的各 SNP 位点和侧翼序列设 计， 针对每个 SNP 位点， 正反 2 条 DNA 链共设计 8 条探针 ； 然后再根据 SNP 位点两端的更远 侧翼序列设计用于 PCR 扩增的上下游引物， 对每对引物之一的 5’ 端预先进行信号标记， 所 述标记优选为荧光标记、 同位素标记、 生物素标记或地高辛标记。
本领域技术人员可以通过本领域常规方法进行探针合成， 并进行氨基修饰或信号 标记， 然后提取待检测样品的 DNA， 用针对每个待检测 SNP 位点设计的上下游引物对进行 PCR 扩增， 使得微量待检测样品的 DNA 大量扩增， 并在扩增过程中引入荧光标记等信号标 记。扩增后含有信号标记物的待测样品核酸靶分子通过碱基互补配对原则与芯片上的寡 核苷酸探针杂交， 此后进行芯片扫描， 获得每个位点的信号， 对杂交信号强弱和有无进行分 析， 即可判断样品中靶基因的数量和性质。本发明采用 PCR 扩增和基因芯片相结合的技术， 使得检测的灵敏度高、 通量大。 上述 DNA 提取试剂、 PCR 扩增试剂、 PCR 产物纯化试剂、 杂交试剂均可以使用本领域 技术人员所熟知的在这些操作过程中需使用的各种试剂， 这些试剂必要时可以包括在基因 芯片试剂中， 也可以将其配方列在基因芯片试剂的说明书中， 由使用者按照说明书中的指 示自行配制。
因此， 本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤的基因芯片， 与现有技术相比， 具有以 下优点 ：
(1) 设计了针对亚洲人群足够特别、 敏感的房颤复发预测指标和预测模型， 确立 SNP 模式和房颤术后复发的对应关系 ；
(2) 针对房颤术后复发的不同途径检测多个相关的基因及其多态性位点， 能更准 确全面地预测受检者不同患病途径的患病风险， 可迅速便捷地对普通人群进行筛查， 根据 个体差异判断迷宫手术治疗房颤的疗效、 选择合适的手术方案并有效地预防其复发 ；
(3) 准确率高， 成本较低， 可用于批量检测， 能充分满足大规模基因筛选的要求 ；
(4) 芯片制作的步骤简洁方便， 检测灵敏度高， 通量大。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明， 但本发明的内容并不局限于 以下实施例， 相同领域的技术人员可以在本发明的技术方案框架内提出其他的实施例， 但 这些实施例均包括在本发明的保护范围内。下列实施例中未注明具体条件的实施放大， 通常按照常规条件， 或按照厂商所建 议的条件。
本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片， 它包括针对 rs2200733 位 点、 rs10033464 位点、 rs13376333 位点、 rs6843082 位点、 rs17042171 位点、 rs2106261 位 点和 rs7193343 位点而设计的寡核苷酸探针和能特异性扩增出包括上述 SNP 位点的 DNA 片 段的特异性引物， 所述特异性引物的 5’ 端预先均用信号物质进行标记。
作为优选， 所述寡核苷酸探针具有 SEQ ID NO.1-NO.56 所示的核苷酸序列。
作为优选， 所述特异性引物具有 SEQ ID NO.57-NO.70 所示的核苷酸序列。
作为优选， 所述特异性引物的 5’ 端预先均用荧光素、 同位素、 生物素或地高辛进行 标记。
作为优选， 所述基因芯片还包括固相载体， 所述固相载体为经过表面化学基团修 饰的玻璃基质或尼龙膜， 所述寡核苷酸探针的末端带有修饰氨基， 所述固相载体的化学基 团可与寡核苷酸探针的修饰氨基共价结合。
作为改进， 所述基因芯片还包括一个阴性对照样本和一个阳性对照样本。
作为改进， 所述基因芯片还包括杂交盒和杂交液。
作为进一步改进， 所述基因芯片还包括 DNA 取样试剂、 PCR 扩增试剂和 PCR 产物纯化试剂。 本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片， 其制备方法为 ：
(1) 使用寡核苷酸合成仪制备所述寡核苷酸探针和特异性引物， 将特异性引物的 5’ 端预先均用信号物质进行标记 ；
(2) 使用基因芯片点样仪将所述寡核苷酸探针点制在经过醛基修饰的固相载体 上， 干燥后制得基因芯片。
本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片， 其使用方法为 ：
(1) 使用所述 DNA 取样试剂提取患者 DNA ；
(2) 使用所述特异性引物和所述 PCR 扩增试剂扩增包括目标 SNP 位点的 DNA 片段 ；
(3) 将同一样本的各个 PCR 扩增产物混合， 加入杂交液后与所述芯片杂交 ；
(4) 使用扫描仪扫描杂交信号。
本实施例选取了全基因组关联研究 (GWAS) 与房颤显著相关的 7 个 SNP 位点 ： rs2200733 位点、 rs10033464 位点、 rs13376333 位点、 rs6843082 位点、 rs17042171 位点、 rs2106261 位点和 rs7193343 位点， 根据这 7 个 SNP 位点及其侧翼序列设计寡核苷酸探针 和对应的特异性引物， 针对每个 SNP 位点设计 4 对寡核苷酸探针， 即正反两条 DNA 链共设计 8 条寡核苷酸探针， 所述的 7 对特异性引物可分别扩增出包括上述 7 个 SNP 位点在内的 DNA 片段。
具体来说， 基因芯片的制备方法可按照如下步骤进行 ：
原料准备——
醛基芯片 ( 高分子三维基片 D， 厂商 Capitalbio， 规格为 75.5*25.2*1.0)
基因芯片点样液 (Capitalbio， 5ml) 或 2*Spoting Solution 等
1、 寡核苷酸探针序列设计如序列表所述， 按照本领域技术人员熟知的方法合成 5’ 端氨基标记探针， 所述寡核苷酸探针与各 SNP 位点的对应关系如下所示 ：
2、 将合成的探针溶解于基因芯片点样液中 ( 或将探针与 2*Spoting Solution 等 体积混合， 使终浓度为 40pmols/μl)， 用点样仪 ( 如 SmartArrayTM， CapitalBioCorp. 或 Cartesian Tech.， PROSYS 5510A 芯片制作系统 ) 点制在经过醛基修饰的芯片基片上， 干燥 后保存， 其中芯片上探针排列顺序如下 ：
rs2200733 SNP1 rs10033464 SNP1 rs13376333 SNP1 rs6843082 SNP1 rs17042171 SNP1 rs2106261 SNP1 rs2200733 SNP2 rs10033464 SNP2 rs13376333 SNP2 rs6843082 SNP2 rs17042171 SNP2 rs2106261 SNP2 rs2200733 SNP3 rs10033464 SNP3 rs13376333 SNP3 rs6843082 SNP3 rs17042171 SNP3 rs2106261 SNP3 rs2200733 SNP4 rs10033464 SNP4 rs13376333 SNP4 rs6843082 SNP4 rs17042171 SNP4 rs2106261 SNP49102363806 A CN 102363824 rs7193343 SNP1 阳性对照 PC说rs7193343 SNP2明书rs7193343 SNP3 rs7193343 SNP48/10 页3、 对芯片进行前处理 ： 将芯片置于 75％的相对湿度、 30℃条件下 48-72 小时进行 固定， 然后将芯片沸水浴 30 秒， 取出室温充分干燥。
或按下列步骤对芯片进行前处理 ：
(1) 将芯片置于密闭、 100％湿度的湿盒中， 37℃过夜处理 ；
(2) 将芯片放于 0.25％ NaBH4 溶液中， 水平摇床 (80rpm) 上还原处理 5min ；
(3) 在蒸馏水中， 水平摇床 (80rpm) 上清洗 5min ；
(4) 重复步骤 (3) 一次 ；
(5) 把芯片放置于 50ml 专门的离心甩干管中， 2000rpm 离心 1min。
经如上处理的芯片即可用于杂交。
在本实施例中， 选用玻璃基质作为芯片的载体， 所述玻璃基质的基片带有经化学 修饰处理的活化醛基基团， 而寡核苷酸探针为按照序列表设计的寡核苷酸片段， 其末端带 有氨基标记， 因此 DNA 探针附带的修饰氨基可与玻璃基质的活化醛基基团共价结合， 利用 此法 DNA 探针就可按一定的排列规律固定在基片表面。因此可方便地根据使用者的要求制 出所需芯片， 芯片制作的步骤简洁方便、 成本较低。 也可选用经活化的尼龙膜作为芯片的固 相载体。
PCR 芯片的具体制备可按照如下步骤进行 ：
1、 特异性引物的序列设计如序列表所示， 按照本领域技术人员熟知的方法合成带 有 5’ 端信号标记的上下游引物， 所述信号标记为荧光标记或地高辛标记， 所述特异性引物 与各 SNP 位点的对应关系如下所示 ：
2、 采用预制 PCR 芯片的形式， 将 PCR 扩增试剂和各特异性引物对定量预点于 96 孔 实时定量 PCR 板 ( 如 ABI 公司 )， 于 -20℃保存。96 孔实时定量 PCR 板， 每排 12 孔， 每个基 因位点设复孔， 共 12 孔， 每排检测 1 个病人， 可以同时检测 8 个病人的同一 SNP 位点。
基因芯片的具体使用方法可按照如下步骤进行 ：
1、 样本 DNA 提取 ： 使用 DNA 提取试剂提取样本 DNA， 如刮取受检者的口腔粘膜上皮 细胞， 加入同等体积的细胞裂解液， 裂解两次， 充分溶解白细胞， 离心后弃上清， 加入蛋白酶 K 缓冲液和蛋白酶 K(50ug/ml)， 65℃孵育 10 分钟， 异丙醇沉淀、 75％乙醇洗涤两次， 晾干后 溶于适量 TB 溶液中。
2、 PCR 扩增 ： 检测时在 PCR 芯片中加入相应的受检者 DNA 提取液， 进行多重 PCR 扩 增， 反应条件为预变性 95℃ 3min， 94℃ 30s， 58℃ 30s， 72° 1min， 40 个循环， 72℃ 5min， Hold 4℃。
3、 PCR 产物纯化 ： 使用 PCR 产物纯化试剂纯化 PCR 产物， 如在 PCR 产物中加入 0.2μl Exo I， 1μl SAP， 3μl 10×SAP 反应缓冲液和 1.5μl 去离子水， 将 PCR 芯片放入 PCR 仪中进行纯化， 纯化程序 ： 37℃ 30min， 96℃ 10min， Hold4℃。
4、 杂交 ： 取同一待检样本的各个 PCR 扩增产物各 2μl 混合， 加入杂交液 15μl， 95℃变性处理 3min， 冰上放置 2min 以上后上样于芯片， 盖上盖玻片， 置于 40℃湿盒中杂交 30min。
5、 芯片清洗 ： 将芯片移至装有预热有芯片清洗液 ( 如 0.5*SSC， 0.1％ SDS， PH7.4) 的 50ml 管中， 于 42℃轻摇洗涤 5min。
6、 以荧光检测检测为例——
扫描 ： 将芯片放置于扫描仪 (LuxScan 10K 或 General Scanning 芯片信号分析系 统 Scannarray 3000) 中按既定程序扫描。
以地高辛显色法检测为例——
地高辛显色试剂处理芯片后， 用光学扫描仪扫描杂交信号， 用相应软件对结果进 行分析。
7、 结果判定 ： 作为对照的杂交点会在 PC( 即阳性对照， Positive Control) 位置出 现绿色荧光信号或显色信号， 提示本次杂交成功， 同时阴性对照的位点不应该出现荧光或 显色信号， 此时结果的判读视为有效。
本发明涉及一种基因芯片， 具体讲是一种用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片。 背景技术 心房颤动 (atrial fibrillation) 简称 “房颤” ， 它是一种常见的心律失常， 常并发 于风湿性心脏病、 冠心病和先天性心脏病。 房颤会促发心力衰竭或血流动力学障碍， 诱发室 速或室颤等致命性心律失常， 导致血栓和栓塞事件， 增加基础心脏病的死亡率， 使脑卒中发 生的危险增加五倍、 心力衰竭的危险提高四倍、 死亡或痴呆的危险提高两倍， 房颤本身还可 以引起心脏扩大。
根据世界卫生组织的定义， 房颤的症状表现为心肌丧失了正常有规律的舒缩活 动， 而代之以快速而不协调的微弱蠕动， 致使心房失去正常的有效收缩， 导致心房不规则 的、 杂乱无章的电活动， 房性心动过速， 心电图上 P 波消失， 代之以小 f 波， 频率约 350-600 次 / 分钟， 即基线上形状、 大小、 方向和时程不一的颤动波， 在没有高度或完全性房室传导 阻滞情况下心室率完全不等。
按时间划分， 房颤分为急性房颤和慢性房颤， 慢性房颤又分为阵发性、 持续性和永 久性房颤， 阵发性、 可自行终止的房颤为阵发性房颤， 房颤持续三周以上、 发作后不能自行 终止、 但经治疗后能终止的房颤为持续性房颤， 经治疗后也不能终止的房颤为永久性房颤。
按是否与其他心血管疾病并发来划分， 房颤可分为孤立性房颤和典型性房颤， 孤 立性房颤指无明确的心脏病变基础的心房颤动， 即不伴有相关心血管疾病的房颤 ； 典型性 房颤指伴有相关心血管疾病的房颤， 与房颤有关的心血管基础疾病包括瓣膜性心脏病 ( 大 多为二尖瓣性 )、 冠心病、 高血压、 缺血性心脏病和充血性心衰等。
房 颤 已 成 为 全 世 界 范 围 内 一 种 新 的 流 行 病， 据 统 计， 美国房颤发病率为 0.4％ -0.9％， 随着年龄的增长， 发病率急剧增高， 在 65 岁以上者则高达 3％ -5％， 而欧洲的 房颤发病率与美国相仿， 亚洲的房颤发病率与前二者相比略低。 尽管如此， 中国也已有 1000 万房颤患者， 而且其发病率快速上升， 并有向年轻人转移的趋势。 房颤严重地危害着人类的 健康， 也给社会带来了相当的经济负担。
因此预防、 诊断和治疗房颤成为需要迫切解决的重要医学问题。房颤治疗的目的 是恢复心脏正常的节律性搏动， 或控制合理的心室速率， 防止脑卒中等严重并发症的出现 等。
近 20 年来， 许多学者尝试通过外科手术治愈房颤， 取得了很大进展， 其中， 以迷宫 手术效果最好。 1987 年美国心脏医生发明迷宫手术， 按精心设计的线路在右心房、 房间隔及 左心房分别沿环形线性切开多处， 再缝合起来， 形成一个狭窄而弯曲的心房组织通道， 即人 造一个迷宫， 阻止折返， 将引起房颤的异常传导环路打断， 使房颤不能发生， 却能引导脉冲 从窦房结传到房室结， 从而治愈房颤。随着各种新技术的发展完善 ( 例如根据迷宫手术原 迷宫手术不断得到简化和改进， 其并发症少， 疗 理， 在心房中应用射频消融手术治疗房颤 )，
根据世界卫生组织的定义， 房颤的症状表现为心肌丧失了正常有规律的舒缩活 动， 而代之以快速而不协调的微弱蠕动， 致使心房失去正常的有效收缩， 导致心房不规则 的、 杂乱无章的电活动， 房性心动过速， 心电图上 P 波消失， 代之以小 f 波， 频率约 350-600 次 / 分钟， 即基线上形状、 大小、 方向和时程不一的颤动波， 在没有高度或完全性房室传导 阻滞情况下心室率完全不等。
按时间划分， 房颤分为急性房颤和慢性房颤， 慢性房颤又分为阵发性、 持续性和永 久性房颤， 阵发性、 可自行终止的房颤为阵发性房颤， 房颤持续三周以上、 发作后不能自行 终止、 但经治疗后能终止的房颤为持续性房颤， 经治疗后也不能终止的房颤为永久性房颤。
按是否与其他心血管疾病并发来划分， 房颤可分为孤立性房颤和典型性房颤， 孤 立性房颤指无明确的心脏病变基础的心房颤动， 即不伴有相关心血管疾病的房颤 ； 典型性 房颤指伴有相关心血管疾病的房颤， 与房颤有关的心血管基础疾病包括瓣膜性心脏病 ( 大 多为二尖瓣性 )、 冠心病、 高血压、 缺血性心脏病和充血性心衰等。
房 颤 已 成 为 全 世 界 范 围 内 一 种 新 的 流 行 病， 据 统 计， 美国房颤发病率为 0.4％ -0.9％， 随着年龄的增长， 发病率急剧增高， 在 65 岁以上者则高达 3％ -5％， 而欧洲的 房颤发病率与美国相仿， 亚洲的房颤发病率与前二者相比略低。 尽管如此， 中国也已有 1000 万房颤患者， 而且其发病率快速上升， 并有向年轻人转移的趋势。 房颤严重地危害着人类的 健康， 也给社会带来了相当的经济负担。
因此预防、 诊断和治疗房颤成为需要迫切解决的重要医学问题。房颤治疗的目的 是恢复心脏正常的节律性搏动， 或控制合理的心室速率， 防止脑卒中等严重并发症的出现 等。
近 20 年来， 许多学者尝试通过外科手术治愈房颤， 取得了很大进展， 其中， 以迷宫 手术效果最好。 1987 年美国心脏医生发明迷宫手术， 按精心设计的线路在右心房、 房间隔及 左心房分别沿环形线性切开多处， 再缝合起来， 形成一个狭窄而弯曲的心房组织通道， 即人 造一个迷宫， 阻止折返， 将引起房颤的异常传导环路打断， 使房颤不能发生， 却能引导脉冲 从窦房结传到房室结， 从而治愈房颤。随着各种新技术的发展完善 ( 例如根据迷宫手术原 迷宫手术不断得到简化和改进， 其并发症少， 疗 理， 在心房中应用射频消融手术治疗房颤 )，
效提高， 迷宫手术治疗房颤已成为疗效比较确切和可靠的一种方法。
尽管如此， 随访的研究表明， 迷宫手术治疗后仍有约 15％的病人容易复发。 房颤的 术后复发原因显然是多方面的， 如高血压， 糖尿病， 心衰， 心梗， 肥胖和血管性疾病等。
目前的研究无法对房颤的发生机制作清晰的病因学阐述， 它是多种病因的综合疾 病， 包括心血管疾病及其他风险因素。 房颤与某些急性、 暂时性原因有关， 包括饮酒、 外科手 术、 电击、 心肌炎、 肺栓塞、 其它肺脏病以及甲状腺机能亢进， 房颤也是心肌梗塞和心胸外科 手术后较常见的早期并发症。
孤立性房颤没有明显结构上的心脏疾病， 年轻人也会患有孤立性房颤， 孤立性房 颤的患者与典型性房颤的年老患者相比， 更可能突然性地发病， 家族型聚集和早发病是孤 立性房颤的突出特征， 近 30％的孤立性房颤家族渊源者有至少一个轻度患有此症的亲属。
典型性房颤的风险因素包括年老、 肥胖、 高血压、 心力衰竭、 心脏瓣膜病、 甲状腺机 能亢进和家族病， 而且有亲属患有此症的个体也具有更高的房颤患病风险。
大量证据提示房颤病情的加重是心房内不断积累的结构重构和电生理重构的结 果， 房颤一旦发生， 左心房就按组织学重构、 电重构规律发展下去， 即便病因去除， 房颤仍然 会发生。可以说它是致命性的， 所以做好房颤的预防是很有必要的。 最近的研究提供了遗传性因素对房颤影响的有力证据， 表明了房颤的发生和治疗 转归可能和患者自身的体质即基因的关系可能更为密切。 根据个体差异判断迷宫手术治疗 房颤的疗效、 选择合适的手术方案并有效地预防其复发， 是房颤治疗中待解决的重要问题。
由于房颤的直接病因到现在仍未明了， 迷宫手术后引起房颤复发的直接原因也不 清楚， 因此预防房颤复发存在一定困难， 即人们无法知道术后哪方面的因素引起房颤的复 发， 也就无法防止其发生或阻断其复发的某一环节。 尽管如此， 通过各种研究手段和临床试 验， 人们还是发现一些与迷宫手术后房颤预后相关的遗传学因子。
人们探索了房颤的致病基因和与房颤显著相关的 SNP 位点， 但是以往的报道往往 集中在一个或少数几个基因及 SNP 位点， 而房颤的术后复发是由多因素调节的复杂过程， 既往的研究难以反映复杂的复发过程的整体本质。
如果同时对多种易感基因及多个与房颤显著相关的 SNP 位点进行分析， 则有助于 阐明各种易感基因之间的相互作用机制及其对房颤术后复发的影响。目前尚无足够特别、 敏感的针对亚洲人群的房颤复发预测指标和预测模型， 国内外也没有对房颤术后复发的多 基因及多个相关 SNP 位点预测芯片的应用。
由于房颤的直接病因到现在仍未明了， 迷宫手术后引起房颤复发的直接原因也不 清楚， 因此预防房颤复发存在一定困难， 即人们无法知道术后哪方面的因素引起房颤的复 发， 也就无法防止其发生或阻断其复发的某一环节。 尽管如此， 通过各种研究手段和临床试 验， 人们还是发现一些与迷宫手术后房颤预后相关的遗传学因子。
人们探索了房颤的致病基因和与房颤显著相关的 SNP 位点， 但是以往的报道往往 集中在一个或少数几个基因及 SNP 位点， 而房颤的术后复发是由多因素调节的复杂过程， 既往的研究难以反映复杂的复发过程的整体本质。
如果同时对多种易感基因及多个与房颤显著相关的 SNP 位点进行分析， 则有助于 阐明各种易感基因之间的相互作用机制及其对房颤术后复发的影响。目前尚无足够特别、 敏感的针对亚洲人群的房颤复发预测指标和预测模型， 国内外也没有对房颤术后复发的多 基因及多个相关 SNP 位点预测芯片的应用。
发明内容 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷， 提供一种用于预测迷宫手术 治疗房颤疗效的基因芯片， 此基因芯片可检测多个与房颤显著相关的 SNP 位点， 迅速便捷 地对普通人群进行筛查， 准确率高， 成本较低， 可用于批量检测， 能充分满足大规模基因筛 选的要求。
为解决上述技术问题， 本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片， 它 包括针对 rs2200733 位点、 rs10033464 位点、 rs13376333 位点、 rs6843082 位点、 rs17042171 位点、 rs2106261 位点和 rs7193343 位点而设计的寡核苷酸探针和能特异性扩增出包括上 述 SNP 位点的 DNA 片段的特异性引物， 所述特异性引物的 5’ 端预先均用信号物质进行标记。
作为优选， 所述寡核苷酸探针具有 SEQ ID NO.1-NO.56 所示的核苷酸序列。 作为优选， 所述特异性引物具有 SEQ ID NO.57-NO.70 所示的核苷酸序列。 作为优选， 所述特异性引物的 5’ 端预先均用荧光素、 同位素、 生物素或地高辛进行标记。 作为优选， 所述基因芯片还包括固相载体， 所述固相载体为经过表面化学基团修 饰的玻璃基质或尼龙膜， 所述寡核苷酸探针的末端带有修饰氨基， 所述固相载体的化学基 团可与寡核苷酸探针的修饰氨基共价结合。
作为改进， 所述基因芯片还包括一个阴性对照样本和一个阳性对照样本。
作为改进， 所述基因芯片还包括杂交盒和杂交液。
作为进一步改进， 所述基因芯片还包括 DNA 取样试剂、 PCR 扩增试剂和 PCR 产物纯 化试剂。
本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片， 其制备方法为 ：
(1) 使用寡核苷酸合成仪制备所述寡核苷酸探针和特异性引物， 将特异性引物的 5’ 端预先均用信号物质进行标记 ；
(2) 使用基因芯片点样仪将所述寡核苷酸探针点制在经过醛基修饰的固相载体 上， 干燥后制得基因芯片。
本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片， 其使用方法为 ：
(1) 使用所述 DNA 取样试剂提取患者 DNA ；
(2) 使用所述特异性引物和所述 PCR 扩增试剂扩增包括目标 SNP 位点的 DNA 片段 ；
(3) 将同一样本的各个 PCR 扩增产物混合， 加入杂交液后与所述芯片杂交 ；
(4) 使用扫描仪扫描杂交信号。
本发明选取了全基因组关联研究 (6WAS) 与房颤显著相关的 7 个 SNP 位点。
染 色 体 4q25 基 因 座 为 与 房 颤 紧 密 相 关 的 一 个 基 因 座， rs2200733 位 点、 rs10033464 位点、 rs6843082 位点和 rs17042171 位点均在此基因座内。
其中 rs2200733 位点、 rs10033464 位点位于染色体 4q25 的一个单一的连锁不平 衡区域内， 在年轻患者和患有孤立性房颤的患者中， 上述两个 SNP 位点与房颤的相关性尤 为显著。该连锁不平衡区域不存在已知基因， 却包含一个剪接的表达序列标签 (DA725631) 和两个独立外显子表达序列标签 (DB324364 和 AF017091)。对取自各种组织的互补 DNA 文 库进行逆转录酶介导的聚合酶链式反应， 并没有检测到这些表达序列标签 (EST) 的表达。 位于该连锁不平衡区域毗邻的上游的 PITX2 基因是与这两个风险突变 SNP 位点距离最近的 基因。PITX2 基因通过介导心脏不对称形态的发生而在心脏发育中起重要作用， 它编码的 蛋白为成对型同源区转录因子 2( 即 paired-liked homeodomain transcription factor 2)， 可调节心肌细胞、 心脏神经胚细胞和咽弓间充质细胞， 其基因突变可引起心脏左右信号 传导改变。
rs6843082 位点与房颤最为紧密相关， 而 rs17042171 位点距离转录因子基因 PITX2 约 150kb 端粒， 也与房颤具有显著相关性。
rs13376333 位点位于染色体 1q21 上， 它与孤立性房颤的相关性尤为显著， 与典型 性房颤也相关， 虽然相关性不够紧密。rs13376333 位于 KCNN3 基因第一和第二外显子之间 的内含子上， 它没有与 KCNN3 基因上任何已知的普通非同义 SNP 位点连锁不平衡。 KCNN3 基
因编码了参与心房复极化的钾通道蛋白， 此蛋白属于弱传导钙激活钾通道蛋白家族， 此蛋 白最大的特点是影响可兴奋细胞的放电类型， 例如在一些神经元中影响相位型放电， 而在 另一些神经元影响连续型放电， 因而此蛋白在许多易兴奋组织中被表达， 包括大脑和心脏。
rs2106261 位点和 rs7193343 位点均位于染色体 16q22 上的 ZFHX3 基因 ( 锌指同 源框基因， 也称 AT 模式绑定银子， 即 ATBF1) 内， 这两个位点均为 ZFHX3 基因的内含子 SNP 位点， 与孤立性房颤和典型性房颤均紧密相关。ZFHX3 基因编码一种名为 Atbf1 的转录因 子， 此蛋白是最大的已知 DNA 结合蛋白， 与一些组织的生长和分化的调节有关， 具体来说是 调节肌源性和神经性分化。 ZFHX3 在许多组织中被表达， 例如心脏、 肝脏、 肺、 肾脏、 脑下垂体 和大脑。
Atbf1 为 POU 类 1 同源框 1(POU1F1) 基因早期转录激活的所需蛋白， POU1F1 基因 是调节哺乳动物脑垂体细胞分化和激素表达的 POU- 同源域转录因子家族的一员。POU1F1 与 PITX2 基因相互作用， 促进 DNA 结合和转录活性， 这两个基因之间的相互作用具有重要 意义， 因为之前已确定的染色体 4q25 上的房颤突变 SNP 位点位于与 PITX2 毗邻的位置， 而 PITX2 基因对心脏发育有关键作用。
基因多态性是指人群中不同个体之间基因核苷酸序列的差异性， 而 SNP( 单核苷 酸多态性 ) 则是指基因核苷酸序列中某个位点上单个核苷酸的变异性， 如果一个群体中同 一位点存在两种以上等位基因， 并且最低基因频率≥ 1％， 即认为具有 SNP。 SNP 在人类基因 组中广泛存在， 平均密度约为 1/1000bp， 其总数可达 300 万个甚至更多。SNP 是人类可遗传 的变异中最常见的一种， 占所有已知多态性的 90％以上， 因此 SNP 可作为第三代的遗传标 记。 SNP 所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异， 这种变异主要由单个碱基的转 换 (transition) 或颠换 (transversion) 所引起， 也可由碱基的插入 (insertion) 或缺失 (deletion) 所致。
在基因组 DNA 中， 任何碱基均有可能发生变异， 因此 SNP 既有可能在编码序列内， 也有可能在非编码序列上。 SNP 是基因组 DNA 序列变异的主要形式， 是决定人类疾病 ( 尤其 是多基因疾病 ) 易感性和药物反应性个体差异的核心信息。相当一部分 SNP 的频率在不同 种族、 人群中有着显著差异。 SNP 本身只轻度或不改变通道蛋白的功能， 通常不直接致病， 但 改变个体对疾病的易感性。
SNP 可影响其他突变基因的致病性， 同一基因突变， 在不同多态性背景下致病性可 能不同。需要注意的是， SNP 的生物学作用可能并不被发现， 尤其在多基因疾病中， 其他的 很多附加因素共同作用影响了疾病的表现型， 从而隐藏了多态性的作用。
另外， 遗传异质性的问题亦不容忽视。同一个基因的同一种多态性在不同种族或 不同数量人群中， 得出的结论可能不同甚至完全相反。
本发明所选取的 7 个 SNP 位点均为针对亚洲人种的房颤显著相关 SNP 位点。
本发明的技术方案中， DNA 提取、 PCR 扩增、 PCR 产物纯化和基因芯片等均为常规的 分子生物学技术。
基因芯片技术是近年迅速发展起来的一项前沿分子生物学技术， 它又被称为 DNA 芯片或 DNA 微阵列， 是生物芯片的一种。它通过与计算机图像分析的有机结合， 在一次实验 中可对样品中靶分子的质量或数量进行快速、 准确、 高效的检测。具体来说， 基因芯片是指
将大量人工合成的或应用常规分子生物学技术获得的核酸片段作为探针， 所述探针包含特 定的核苷酸序列， 采用微量点样等方法， 使所述探针按照特定的排列方式和特定的手段固 化于支持物 ( 如玻片、 硅片、 塑料片、 聚丙烯酰胺凝胶篇或尼龙膜等载体 ) 的表面， 形成密集 二维分子排列。然后与已标记的待测生物样品中靶分子进行杂交， 通过特定的扫描仪如光 学扫描仪、 激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影相机 (CCD) 对杂交信号进行快速、 并行、 高效 地分析， 从而判断样品中靶分子的数量和质量。
PCR( 即聚合酶链式反应， Polymerase Chain Reaction) 是最常用的分子生物学技 术之一， 是由体外酶催化扩增特异 DNA 的一种方法。典型的 PCR 一般包括高温使模板 DNA 变性、 引物和模板退火、 引物沿模板延伸三步反应组成的循环， 经过上述多次循环反应， 使 目的 DNA 得以迅速大量扩增。
本发明的寡核苷酸探针根据房颤术后复发相关基因的各 SNP 位点和侧翼序列设 计， 针对每个 SNP 位点， 正反 2 条 DNA 链共设计 8 条探针 ； 然后再根据 SNP 位点两端的更远 侧翼序列设计用于 PCR 扩增的上下游引物， 对每对引物之一的 5’ 端预先进行信号标记， 所 述标记优选为荧光标记、 同位素标记、 生物素标记或地高辛标记。
本领域技术人员可以通过本领域常规方法进行探针合成， 并进行氨基修饰或信号 标记， 然后提取待检测样品的 DNA， 用针对每个待检测 SNP 位点设计的上下游引物对进行 PCR 扩增， 使得微量待检测样品的 DNA 大量扩增， 并在扩增过程中引入荧光标记等信号标 记。扩增后含有信号标记物的待测样品核酸靶分子通过碱基互补配对原则与芯片上的寡 核苷酸探针杂交， 此后进行芯片扫描， 获得每个位点的信号， 对杂交信号强弱和有无进行分 析， 即可判断样品中靶基因的数量和性质。本发明采用 PCR 扩增和基因芯片相结合的技术， 使得检测的灵敏度高、 通量大。 上述 DNA 提取试剂、 PCR 扩增试剂、 PCR 产物纯化试剂、 杂交试剂均可以使用本领域 技术人员所熟知的在这些操作过程中需使用的各种试剂， 这些试剂必要时可以包括在基因 芯片试剂中， 也可以将其配方列在基因芯片试剂的说明书中， 由使用者按照说明书中的指 示自行配制。
因此， 本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤的基因芯片， 与现有技术相比， 具有以 下优点 ：
(1) 设计了针对亚洲人群足够特别、 敏感的房颤复发预测指标和预测模型， 确立 SNP 模式和房颤术后复发的对应关系 ；
(2) 针对房颤术后复发的不同途径检测多个相关的基因及其多态性位点， 能更准 确全面地预测受检者不同患病途径的患病风险， 可迅速便捷地对普通人群进行筛查， 根据 个体差异判断迷宫手术治疗房颤的疗效、 选择合适的手术方案并有效地预防其复发 ；
(3) 准确率高， 成本较低， 可用于批量检测， 能充分满足大规模基因筛选的要求 ；
(4) 芯片制作的步骤简洁方便， 检测灵敏度高， 通量大。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明， 但本发明的内容并不局限于 以下实施例， 相同领域的技术人员可以在本发明的技术方案框架内提出其他的实施例， 但 这些实施例均包括在本发明的保护范围内。下列实施例中未注明具体条件的实施放大， 通常按照常规条件， 或按照厂商所建 议的条件。
本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片， 它包括针对 rs2200733 位 点、 rs10033464 位点、 rs13376333 位点、 rs6843082 位点、 rs17042171 位点、 rs2106261 位 点和 rs7193343 位点而设计的寡核苷酸探针和能特异性扩增出包括上述 SNP 位点的 DNA 片 段的特异性引物， 所述特异性引物的 5’ 端预先均用信号物质进行标记。
作为优选， 所述寡核苷酸探针具有 SEQ ID NO.1-NO.56 所示的核苷酸序列。
作为优选， 所述特异性引物具有 SEQ ID NO.57-NO.70 所示的核苷酸序列。
作为优选， 所述特异性引物的 5’ 端预先均用荧光素、 同位素、 生物素或地高辛进行 标记。
作为优选， 所述基因芯片还包括固相载体， 所述固相载体为经过表面化学基团修 饰的玻璃基质或尼龙膜， 所述寡核苷酸探针的末端带有修饰氨基， 所述固相载体的化学基 团可与寡核苷酸探针的修饰氨基共价结合。
作为改进， 所述基因芯片还包括一个阴性对照样本和一个阳性对照样本。
作为改进， 所述基因芯片还包括杂交盒和杂交液。
作为进一步改进， 所述基因芯片还包括 DNA 取样试剂、 PCR 扩增试剂和 PCR 产物纯化试剂。 本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片， 其制备方法为 ：
(1) 使用寡核苷酸合成仪制备所述寡核苷酸探针和特异性引物， 将特异性引物的 5’ 端预先均用信号物质进行标记 ；
(2) 使用基因芯片点样仪将所述寡核苷酸探针点制在经过醛基修饰的固相载体 上， 干燥后制得基因芯片。
本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片， 其使用方法为 ：
(1) 使用所述 DNA 取样试剂提取患者 DNA ；
(2) 使用所述特异性引物和所述 PCR 扩增试剂扩增包括目标 SNP 位点的 DNA 片段 ；
(3) 将同一样本的各个 PCR 扩增产物混合， 加入杂交液后与所述芯片杂交 ；
(4) 使用扫描仪扫描杂交信号。
本实施例选取了全基因组关联研究 (GWAS) 与房颤显著相关的 7 个 SNP 位点 ： rs2200733 位点、 rs10033464 位点、 rs13376333 位点、 rs6843082 位点、 rs17042171 位点、 rs2106261 位点和 rs7193343 位点， 根据这 7 个 SNP 位点及其侧翼序列设计寡核苷酸探针 和对应的特异性引物， 针对每个 SNP 位点设计 4 对寡核苷酸探针， 即正反两条 DNA 链共设计 8 条寡核苷酸探针， 所述的 7 对特异性引物可分别扩增出包括上述 7 个 SNP 位点在内的 DNA 片段。
具体来说， 基因芯片的制备方法可按照如下步骤进行 ：
原料准备——
醛基芯片 ( 高分子三维基片 D， 厂商 Capitalbio， 规格为 75.5*25.2*1.0)
基因芯片点样液 (Capitalbio， 5ml) 或 2*Spoting Solution 等
1、 寡核苷酸探针序列设计如序列表所述， 按照本领域技术人员熟知的方法合成 5’ 端氨基标记探针， 所述寡核苷酸探针与各 SNP 位点的对应关系如下所示 ：
2、 将合成的探针溶解于基因芯片点样液中 ( 或将探针与 2*Spoting Solution 等 体积混合， 使终浓度为 40pmols/μl)， 用点样仪 ( 如 SmartArrayTM， CapitalBioCorp. 或 Cartesian Tech.， PROSYS 5510A 芯片制作系统 ) 点制在经过醛基修饰的芯片基片上， 干燥 后保存， 其中芯片上探针排列顺序如下 ：
rs2200733 SNP1 rs10033464 SNP1 rs13376333 SNP1 rs6843082 SNP1 rs17042171 SNP1 rs2106261 SNP1 rs2200733 SNP2 rs10033464 SNP2 rs13376333 SNP2 rs6843082 SNP2 rs17042171 SNP2 rs2106261 SNP2 rs2200733 SNP3 rs10033464 SNP3 rs13376333 SNP3 rs6843082 SNP3 rs17042171 SNP3 rs2106261 SNP3 rs2200733 SNP4 rs10033464 SNP4 rs13376333 SNP4 rs6843082 SNP4 rs17042171 SNP4 rs2106261 SNP49102363806 A CN 102363824 rs7193343 SNP1 阳性对照 PC说rs7193343 SNP2明书rs7193343 SNP3 rs7193343 SNP48/10 页3、 对芯片进行前处理 ： 将芯片置于 75％的相对湿度、 30℃条件下 48-72 小时进行 固定， 然后将芯片沸水浴 30 秒， 取出室温充分干燥。
或按下列步骤对芯片进行前处理 ：
(1) 将芯片置于密闭、 100％湿度的湿盒中， 37℃过夜处理 ；
(2) 将芯片放于 0.25％ NaBH4 溶液中， 水平摇床 (80rpm) 上还原处理 5min ；
(3) 在蒸馏水中， 水平摇床 (80rpm) 上清洗 5min ；
(4) 重复步骤 (3) 一次 ；
(5) 把芯片放置于 50ml 专门的离心甩干管中， 2000rpm 离心 1min。
经如上处理的芯片即可用于杂交。
在本实施例中， 选用玻璃基质作为芯片的载体， 所述玻璃基质的基片带有经化学 修饰处理的活化醛基基团， 而寡核苷酸探针为按照序列表设计的寡核苷酸片段， 其末端带 有氨基标记， 因此 DNA 探针附带的修饰氨基可与玻璃基质的活化醛基基团共价结合， 利用 此法 DNA 探针就可按一定的排列规律固定在基片表面。因此可方便地根据使用者的要求制 出所需芯片， 芯片制作的步骤简洁方便、 成本较低。 也可选用经活化的尼龙膜作为芯片的固 相载体。
PCR 芯片的具体制备可按照如下步骤进行 ：
1、 特异性引物的序列设计如序列表所示， 按照本领域技术人员熟知的方法合成带 有 5’ 端信号标记的上下游引物， 所述信号标记为荧光标记或地高辛标记， 所述特异性引物 与各 SNP 位点的对应关系如下所示 ：
2、 采用预制 PCR 芯片的形式， 将 PCR 扩增试剂和各特异性引物对定量预点于 96 孔 实时定量 PCR 板 ( 如 ABI 公司 )， 于 -20℃保存。96 孔实时定量 PCR 板， 每排 12 孔， 每个基 因位点设复孔， 共 12 孔， 每排检测 1 个病人， 可以同时检测 8 个病人的同一 SNP 位点。
基因芯片的具体使用方法可按照如下步骤进行 ：
1、 样本 DNA 提取 ： 使用 DNA 提取试剂提取样本 DNA， 如刮取受检者的口腔粘膜上皮 细胞， 加入同等体积的细胞裂解液， 裂解两次， 充分溶解白细胞， 离心后弃上清， 加入蛋白酶 K 缓冲液和蛋白酶 K(50ug/ml)， 65℃孵育 10 分钟， 异丙醇沉淀、 75％乙醇洗涤两次， 晾干后 溶于适量 TB 溶液中。
2、 PCR 扩增 ： 检测时在 PCR 芯片中加入相应的受检者 DNA 提取液， 进行多重 PCR 扩 增， 反应条件为预变性 95℃ 3min， 94℃ 30s， 58℃ 30s， 72° 1min， 40 个循环， 72℃ 5min， Hold 4℃。
3、 PCR 产物纯化 ： 使用 PCR 产物纯化试剂纯化 PCR 产物， 如在 PCR 产物中加入 0.2μl Exo I， 1μl SAP， 3μl 10×SAP 反应缓冲液和 1.5μl 去离子水， 将 PCR 芯片放入 PCR 仪中进行纯化， 纯化程序 ： 37℃ 30min， 96℃ 10min， Hold4℃。
4、 杂交 ： 取同一待检样本的各个 PCR 扩增产物各 2μl 混合， 加入杂交液 15μl， 95℃变性处理 3min， 冰上放置 2min 以上后上样于芯片， 盖上盖玻片， 置于 40℃湿盒中杂交 30min。
5、 芯片清洗 ： 将芯片移至装有预热有芯片清洗液 ( 如 0.5*SSC， 0.1％ SDS， PH7.4) 的 50ml 管中， 于 42℃轻摇洗涤 5min。
6、 以荧光检测检测为例——
扫描 ： 将芯片放置于扫描仪 (LuxScan 10K 或 General Scanning 芯片信号分析系 统 Scannarray 3000) 中按既定程序扫描。
以地高辛显色法检测为例——
地高辛显色试剂处理芯片后， 用光学扫描仪扫描杂交信号， 用相应软件对结果进 行分析。
7、 结果判定 ： 作为对照的杂交点会在 PC( 即阳性对照， Positive Control) 位置出 现绿色荧光信号或显色信号， 提示本次杂交成功， 同时阴性对照的位点不应该出现荧光或 显色信号， 此时结果的判读视为有效。
由信号点显现的位置即可断定该患者是否携带与房颤术后复发相关的 SNP 位点。12102363806 A CN 102363824
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