用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片.pdf

1、10申请公布号CN102363806A43申请公布日20120229CN102363806ACN102363806A21申请号201110338262522申请日20111031C12Q1/68200601C40B40/06200601C40B50/0620060171申请人杭州博泰基因技术有限公司地址311121浙江省杭州市余杭区文一西路1500号余杭组团创新基地6号楼901室72发明人金涛王海勇郭兴中陈艳丽符伟红孙早74专利代理机构杭州华知专利事务所33235代理人宁冈54发明名称用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片57摘要本发明公开了一种用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片，它包括针

2、对RS2200733位点、RS10033464位点、RS13376333位点、RS6843082位点、RS17042171位点、RS2106261位点和RS7193343位点而设计的寡核苷酸探针和能特异性扩增出包括上述SNP位点的DNA片段的特异性引物，所述特异性引物的5端预先均用信号物质进行标记。本发明的基因芯片可检测多个与房颤显著相关的SNP位点，迅速便捷地对普通人群进行筛查，准确率高，成本较低，可用于批量检测，能充分满足大规模基因筛选的要求。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书10页序列表15页CN102363824A1/1页21一种用于预测

3、迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片，其特征在于它包括针对RS2200733位点、RS10033464位点、RS13376333位点、RS6843082位点、RS17042171位点、RS2106261位点和RS7193343位点而设计的寡核苷酸探针和能特异性扩增出包括上述SNP位点的DNA片段的特异性引物，所述特异性引物的5端预先均用信号物质进行标记。2根据权利要求1所述的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片，其特征在于所述寡核苷酸探针具有SEQIDNO1NO56所示的核苷酸序列。3根据权利要求1所述的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片，奇特征在于所述特异性引物具有SEQIDNO57NO70

4、所示的核苷酸序列。4根据权利要求13任一项所述的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片，其特征在于所述特异性引物的5端预先均用荧光素、同位素、生物素或地高辛进行标记。5根据13任一项所述的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片，其特征在于所述基因芯片还包括固相载体，所述固相载体为经过表面化学基团修饰的玻璃基质或尼龙膜，所述寡核苷酸探针的末端带有修饰氨基，所述固相载体上的化学基团可与寡核苷酸探针的修饰氨基共价结合。6根据权利要求13任一项所述的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片，其特征在于所述基因芯片还包括一个阴性对照样本和一个阳性对照样本。7根据权利要求13任一项所述的用于预测迷宫手术治疗

5、房颤疗效的基因芯片，其特征在于所述基因芯片还包括杂交盒和杂交液。8根据权利要求7所述的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片，其特征在于所述基因芯片还包括DNA取样试剂、PCR扩增试剂和PCR产物纯化试剂。9一种权利要求1所述的基因芯片的制备方法，其特征在于它采用如下步骤1使用寡核苷酸合成仪制备所述寡核苷酸探针和特异性引物，将特异性引物的5端预先均用信号物质进行标记；2使用基因芯片点样仪将所述寡核苷酸探针点制在经过醛基修饰的固相载体上，干燥后制得基因芯片。10一种权利要求8所述的基因芯片的使用方法，其特征在于所述方法为1使用所述DNA取样试剂提取患者DNA；2使用所述特异性引物和所述PCR扩增

6、试剂扩增包括目标SNP位点的DNA片段；3将同一样本的各个PCR扩增产物混合，加入杂交液后与所述芯片杂交；4使用扫描仪扫描杂交信号。权利要求书CN102363806ACN102363824A1/10页3用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片技术领域0001本发明涉及一种基因芯片，具体讲是一种用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片。背景技术0002心房颤动ATRIALFIBRILLATION简称“房颤”，它是一种常见的心律失常，常并发于风湿性心脏病、冠心病和先天性心脏病。房颤会促发心力衰竭或血流动力学障碍，诱发室速或室颤等致命性心律失常，导致血栓和栓塞事件，增加基础心脏病的死亡率，使脑卒中发生的

7、危险增加五倍、心力衰竭的危险提高四倍、死亡或痴呆的危险提高两倍，房颤本身还可以引起心脏扩大。0003根据世界卫生组织的定义，房颤的症状表现为心肌丧失了正常有规律的舒缩活动，而代之以快速而不协调的微弱蠕动，致使心房失去正常的有效收缩，导致心房不规则的、杂乱无章的电活动，房性心动过速，心电图上P波消失，代之以小F波，频率约350600次/分钟，即基线上形状、大小、方向和时程不一的颤动波，在没有高度或完全性房室传导阻滞情况下心室率完全不等。0004按时间划分，房颤分为急性房颤和慢性房颤，慢性房颤又分为阵发性、持续性和永久性房颤，阵发性、可自行终止的房颤为阵发性房颤，房颤持续三周以上、发作后不能自行终

8、止、但经治疗后能终止的房颤为持续性房颤，经治疗后也不能终止的房颤为永久性房颤。0005按是否与其他心血管疾病并发来划分，房颤可分为孤立性房颤和典型性房颤，孤立性房颤指无明确的心脏病变基础的心房颤动，即不伴有相关心血管疾病的房颤；典型性房颤指伴有相关心血管疾病的房颤，与房颤有关的心血管基础疾病包括瓣膜性心脏病大多为二尖瓣性、冠心病、高血压、缺血性心脏病和充血性心衰等。0006房颤已成为全世界范围内一种新的流行病，据统计，美国房颤发病率为0409，随着年龄的增长，发病率急剧增高，在65岁以上者则高达35，而欧洲的房颤发病率与美国相仿，亚洲的房颤发病率与前二者相比略低。尽管如此，中国也已有1000万

9、房颤患者，而且其发病率快速上升，并有向年轻人转移的趋势。房颤严重地危害着人类的健康，也给社会带来了相当的经济负担。0007因此预防、诊断和治疗房颤成为需要迫切解决的重要医学问题。房颤治疗的目的是恢复心脏正常的节律性搏动，或控制合理的心室速率，防止脑卒中等严重并发症的出现等。0008近20年来，许多学者尝试通过外科手术治愈房颤，取得了很大进展，其中，以迷宫手术效果最好。1987年美国心脏医生发明迷宫手术，按精心设计的线路在右心房、房间隔及左心房分别沿环形线性切开多处，再缝合起来，形成一个狭窄而弯曲的心房组织通道，即人造一个迷宫，阻止折返，将引起房颤的异常传导环路打断，使房颤不能发生，却能引导脉冲

10、从窦房结传到房室结，从而治愈房颤。随着各种新技术的发展完善例如根据迷宫手术原理，在心房中应用射频消融手术治疗房颤，迷宫手术不断得到简化和改进，其并发症少，疗说明书CN102363806ACN102363824A2/10页4效提高，迷宫手术治疗房颤已成为疗效比较确切和可靠的一种方法。0009尽管如此，随访的研究表明，迷宫手术治疗后仍有约15的病人容易复发。房颤的术后复发原因显然是多方面的，如高血压，糖尿病，心衰，心梗，肥胖和血管性疾病等。0010目前的研究无法对房颤的发生机制作清晰的病因学阐述，它是多种病因的综合疾病，包括心血管疾病及其他风险因素。房颤与某些急性、暂时性原因有关，包括饮酒、外科手

11、术、电击、心肌炎、肺栓塞、其它肺脏病以及甲状腺机能亢进，房颤也是心肌梗塞和心胸外科手术后较常见的早期并发症。0011孤立性房颤没有明显结构上的心脏疾病，年轻人也会患有孤立性房颤，孤立性房颤的患者与典型性房颤的年老患者相比，更可能突然性地发病，家族型聚集和早发病是孤立性房颤的突出特征，近30的孤立性房颤家族渊源者有至少一个轻度患有此症的亲属。0012典型性房颤的风险因素包括年老、肥胖、高血压、心力衰竭、心脏瓣膜病、甲状腺机能亢进和家族病，而且有亲属患有此症的个体也具有更高的房颤患病风险。0013大量证据提示房颤病情的加重是心房内不断积累的结构重构和电生理重构的结果，房颤一旦发生，左心房就按组织学

12、重构、电重构规律发展下去，即便病因去除，房颤仍然会发生。可以说它是致命性的，所以做好房颤的预防是很有必要的。0014最近的研究提供了遗传性因素对房颤影响的有力证据，表明了房颤的发生和治疗转归可能和患者自身的体质即基因的关系可能更为密切。根据个体差异判断迷宫手术治疗房颤的疗效、选择合适的手术方案并有效地预防其复发，是房颤治疗中待解决的重要问题。0015由于房颤的直接病因到现在仍未明了，迷宫手术后引起房颤复发的直接原因也不清楚，因此预防房颤复发存在一定困难，即人们无法知道术后哪方面的因素引起房颤的复发，也就无法防止其发生或阻断其复发的某一环节。尽管如此，通过各种研究手段和临床试验，人们还是发现一些

13、与迷宫手术后房颤预后相关的遗传学因子。0016人们探索了房颤的致病基因和与房颤显著相关的SNP位点，但是以往的报道往往集中在一个或少数几个基因及SNP位点，而房颤的术后复发是由多因素调节的复杂过程，既往的研究难以反映复杂的复发过程的整体本质。0017如果同时对多种易感基因及多个与房颤显著相关的SNP位点进行分析，则有助于阐明各种易感基因之间的相互作用机制及其对房颤术后复发的影响。目前尚无足够特别、敏感的针对亚洲人群的房颤复发预测指标和预测模型，国内外也没有对房颤术后复发的多基因及多个相关SNP位点预测芯片的应用。发明内容0018本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种用于预测迷宫

14、手术治疗房颤疗效的基因芯片，此基因芯片可检测多个与房颤显著相关的SNP位点，迅速便捷地对普通人群进行筛查，准确率高，成本较低，可用于批量检测，能充分满足大规模基因筛选的要求。0019为解决上述技术问题，本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片，它包括针对RS2200733位点、RS10033464位点、RS13376333位点、RS6843082位点、RS17042171位点、RS2106261位点和RS7193343位点而设计的寡核苷酸探针和能特异性扩增出包括上述SNP位点的DNA片段的特异性引物，所述特异性引物的5端预先均用信号物质进行标记。说明书CN102363806ACN1023

15、63824A3/10页50020作为优选，所述寡核苷酸探针具有SEQIDNO1NO56所示的核苷酸序列。0021作为优选，所述特异性引物具有SEQIDNO57NO70所示的核苷酸序列。0022作为优选，所述特异性引物的5端预先均用荧光素、同位素、生物素或地高辛进行标记。0023作为优选，所述基因芯片还包括固相载体，所述固相载体为经过表面化学基团修饰的玻璃基质或尼龙膜，所述寡核苷酸探针的末端带有修饰氨基，所述固相载体的化学基团可与寡核苷酸探针的修饰氨基共价结合。0024作为改进，所述基因芯片还包括一个阴性对照样本和一个阳性对照样本。0025作为改进，所述基因芯片还包括杂交盒和杂交液。0026作为

16、进一步改进，所述基因芯片还包括DNA取样试剂、PCR扩增试剂和PCR产物纯化试剂。0027本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片，其制备方法为00281使用寡核苷酸合成仪制备所述寡核苷酸探针和特异性引物，将特异性引物的5端预先均用信号物质进行标记；00292使用基因芯片点样仪将所述寡核苷酸探针点制在经过醛基修饰的固相载体上，干燥后制得基因芯片。0030本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片，其使用方法为00311使用所述DNA取样试剂提取患者DNA；00322使用所述特异性引物和所述PCR扩增试剂扩增包括目标SNP位点的DNA片段；00333将同一样本的各个PCR扩增产物混合，

17、加入杂交液后与所述芯片杂交；00344使用扫描仪扫描杂交信号。0035本发明选取了全基因组关联研究6WAS与房颤显著相关的7个SNP位点。0036染色体4Q25基因座为与房颤紧密相关的一个基因座，RS2200733位点、RS10033464位点、RS6843082位点和RS17042171位点均在此基因座内。0037其中RS2200733位点、RS10033464位点位于染色体4Q25的一个单一的连锁不平衡区域内，在年轻患者和患有孤立性房颤的患者中，上述两个SNP位点与房颤的相关性尤为显著。该连锁不平衡区域不存在已知基因，却包含一个剪接的表达序列标签DA725631和两个独立外显子表达序列标签

18、DB324364和AF017091。对取自各种组织的互补DNA文库进行逆转录酶介导的聚合酶链式反应，并没有检测到这些表达序列标签EST的表达。位于该连锁不平衡区域毗邻的上游的PITX2基因是与这两个风险突变SNP位点距离最近的基因。PITX2基因通过介导心脏不对称形态的发生而在心脏发育中起重要作用，它编码的蛋白为成对型同源区转录因子2即PAIREDLIKEDHOMEODOMAINTRANSCRIPTIONFACTOR2，可调节心肌细胞、心脏神经胚细胞和咽弓间充质细胞，其基因突变可引起心脏左右信号传导改变。0038RS6843082位点与房颤最为紧密相关，而RS17042171位点距离转录因子基

19、因PITX2约150KB端粒，也与房颤具有显著相关性。0039RS13376333位点位于染色体1Q21上，它与孤立性房颤的相关性尤为显著，与典型性房颤也相关，虽然相关性不够紧密。RS13376333位于KCNN3基因第一和第二外显子之间的内含子上，它没有与KCNN3基因上任何已知的普通非同义SNP位点连锁不平衡。KCNN3基说明书CN102363806ACN102363824A4/10页6因编码了参与心房复极化的钾通道蛋白，此蛋白属于弱传导钙激活钾通道蛋白家族，此蛋白最大的特点是影响可兴奋细胞的放电类型，例如在一些神经元中影响相位型放电，而在另一些神经元影响连续型放电，因而此蛋白在许多易兴奋

20、组织中被表达，包括大脑和心脏。0040RS2106261位点和RS7193343位点均位于染色体16Q22上的ZFHX3基因锌指同源框基因，也称AT模式绑定银子，即ATBF1内，这两个位点均为ZFHX3基因的内含子SNP位点，与孤立性房颤和典型性房颤均紧密相关。ZFHX3基因编码一种名为ATBF1的转录因子，此蛋白是最大的已知DNA结合蛋白，与一些组织的生长和分化的调节有关，具体来说是调节肌源性和神经性分化。ZFHX3在许多组织中被表达，例如心脏、肝脏、肺、肾脏、脑下垂体和大脑。0041ATBF1为POU类1同源框1POU1F1基因早期转录激活的所需蛋白，POU1F1基因是调节哺乳动物脑垂体细

21、胞分化和激素表达的POU同源域转录因子家族的一员。POU1F1与PITX2基因相互作用，促进DNA结合和转录活性，这两个基因之间的相互作用具有重要意义，因为之前已确定的染色体4Q25上的房颤突变SNP位点位于与PITX2毗邻的位置，而PITX2基因对心脏发育有关键作用。0042基因多态性是指人群中不同个体之间基因核苷酸序列的差异性，而SNP单核苷酸多态性则是指基因核苷酸序列中某个位点上单个核苷酸的变异性，如果一个群体中同一位点存在两种以上等位基因，并且最低基因频率1，即认为具有SNP。SNP在人类基因组中广泛存在，平均密度约为1/1000BP，其总数可达300万个甚至更多。SNP是人类可遗传的

22、变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90以上，因此SNP可作为第三代的遗传标记。0043SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异主要由单个碱基的转换TRANSITION或颠换TRANSVERSION所引起，也可由碱基的插入INSERTION或缺失DELETION所致。0044在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在编码序列内，也有可能在非编码序列上。SNP是基因组DNA序列变异的主要形式，是决定人类疾病尤其是多基因疾病易感性和药物反应性个体差异的核心信息。相当一部分SNP的频率在不同种族、人群中有着显著差异。SNP本身只轻度或不改变通道蛋白的功能，通常不直

23、接致病，但改变个体对疾病的易感性。0045SNP可影响其他突变基因的致病性，同一基因突变，在不同多态性背景下致病性可能不同。需要注意的是，SNP的生物学作用可能并不被发现，尤其在多基因疾病中，其他的很多附加因素共同作用影响了疾病的表现型，从而隐藏了多态性的作用。0046另外，遗传异质性的问题亦不容忽视。同一个基因的同一种多态性在不同种族或不同数量人群中，得出的结论可能不同甚至完全相反。0047本发明所选取的7个SNP位点均为针对亚洲人种的房颤显著相关SNP位点。0048本发明的技术方案中，DNA提取、PCR扩增、PCR产物纯化和基因芯片等均为常规的分子生物学技术。0049基因芯片技术是近年迅速

24、发展起来的一项前沿分子生物学技术，它又被称为DNA芯片或DNA微阵列，是生物芯片的一种。它通过与计算机图像分析的有机结合，在一次实验中可对样品中靶分子的质量或数量进行快速、准确、高效的检测。具体来说，基因芯片是指说明书CN102363806ACN102363824A5/10页7将大量人工合成的或应用常规分子生物学技术获得的核酸片段作为探针，所述探针包含特定的核苷酸序列，采用微量点样等方法，使所述探针按照特定的排列方式和特定的手段固化于支持物如玻片、硅片、塑料片、聚丙烯酰胺凝胶篇或尼龙膜等载体的表面，形成密集二维分子排列。然后与已标记的待测生物样品中靶分子进行杂交，通过特定的扫描仪如光学扫描仪、

25、激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影相机CCD对杂交信号进行快速、并行、高效地分析，从而判断样品中靶分子的数量和质量。0050PCR即聚合酶链式反应，POLYMERASECHAINREACTION是最常用的分子生物学技术之一，是由体外酶催化扩增特异DNA的一种方法。典型的PCR一般包括高温使模板DNA变性、引物和模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成的循环，经过上述多次循环反应，使目的DNA得以迅速大量扩增。0051本发明的寡核苷酸探针根据房颤术后复发相关基因的各SNP位点和侧翼序列设计，针对每个SNP位点，正反2条DNA链共设计8条探针；然后再根据SNP位点两端的更远侧翼序列设计用于PCR扩增的上下

26、游引物，对每对引物之一的5端预先进行信号标记，所述标记优选为荧光标记、同位素标记、生物素标记或地高辛标记。0052本领域技术人员可以通过本领域常规方法进行探针合成，并进行氨基修饰或信号标记，然后提取待检测样品的DNA，用针对每个待检测SNP位点设计的上下游引物对进行PCR扩增，使得微量待检测样品的DNA大量扩增，并在扩增过程中引入荧光标记等信号标记。扩增后含有信号标记物的待测样品核酸靶分子通过碱基互补配对原则与芯片上的寡核苷酸探针杂交，此后进行芯片扫描，获得每个位点的信号，对杂交信号强弱和有无进行分析，即可判断样品中靶基因的数量和性质。本发明采用PCR扩增和基因芯片相结合的技术，使得检测的灵敏

27、度高、通量大。0053上述DNA提取试剂、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、杂交试剂均可以使用本领域技术人员所熟知的在这些操作过程中需使用的各种试剂，这些试剂必要时可以包括在基因芯片试剂中，也可以将其配方列在基因芯片试剂的说明书中，由使用者按照说明书中的指示自行配制。0054因此，本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤的基因芯片，与现有技术相比，具有以下优点00551设计了针对亚洲人群足够特别、敏感的房颤复发预测指标和预测模型，确立SNP模式和房颤术后复发的对应关系；00562针对房颤术后复发的不同途径检测多个相关的基因及其多态性位点，能更准确全面地预测受检者不同患病途径的患病风险，可迅速便捷地对

28、普通人群进行筛查，根据个体差异判断迷宫手术治疗房颤的疗效、选择合适的手术方案并有效地预防其复发；00573准确率高，成本较低，可用于批量检测，能充分满足大规模基因筛选的要求；00584芯片制作的步骤简洁方便，检测灵敏度高，通量大。具体实施方式0059下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的内容并不局限于以下实施例，相同领域的技术人员可以在本发明的技术方案框架内提出其他的实施例，但这些实施例均包括在本发明的保护范围内。说明书CN102363806ACN102363824A6/10页80060下列实施例中未注明具体条件的实施放大，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。0061本

29、发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片，它包括针对RS2200733位点、RS10033464位点、RS13376333位点、RS6843082位点、RS17042171位点、RS2106261位点和RS7193343位点而设计的寡核苷酸探针和能特异性扩增出包括上述SNP位点的DNA片段的特异性引物，所述特异性引物的5端预先均用信号物质进行标记。0062作为优选，所述寡核苷酸探针具有SEQIDNO1NO56所示的核苷酸序列。0063作为优选，所述特异性引物具有SEQIDNO57NO70所示的核苷酸序列。0064作为优选，所述特异性引物的5端预先均用荧光素、同位素、生物素或地高辛进行标记。

30、0065作为优选，所述基因芯片还包括固相载体，所述固相载体为经过表面化学基团修饰的玻璃基质或尼龙膜，所述寡核苷酸探针的末端带有修饰氨基，所述固相载体的化学基团可与寡核苷酸探针的修饰氨基共价结合。0066作为改进，所述基因芯片还包括一个阴性对照样本和一个阳性对照样本。0067作为改进，所述基因芯片还包括杂交盒和杂交液。0068作为进一步改进，所述基因芯片还包括DNA取样试剂、PCR扩增试剂和PCR产物纯化试剂。0069本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片，其制备方法为00701使用寡核苷酸合成仪制备所述寡核苷酸探针和特异性引物，将特异性引物的5端预先均用信号物质进行标记；00712使用

31、基因芯片点样仪将所述寡核苷酸探针点制在经过醛基修饰的固相载体上，干燥后制得基因芯片。0072本发明的用于预测迷宫手术治疗房颤疗效的基因芯片，其使用方法为00731使用所述DNA取样试剂提取患者DNA；00742使用所述特异性引物和所述PCR扩增试剂扩增包括目标SNP位点的DNA片段；00753将同一样本的各个PCR扩增产物混合，加入杂交液后与所述芯片杂交；00764使用扫描仪扫描杂交信号。0077本实施例选取了全基因组关联研究GWAS与房颤显著相关的7个SNP位点RS2200733位点、RS10033464位点、RS13376333位点、RS6843082位点、RS17042171位点、RS2

32、106261位点和RS7193343位点，根据这7个SNP位点及其侧翼序列设计寡核苷酸探针和对应的特异性引物，针对每个SNP位点设计4对寡核苷酸探针，即正反两条DNA链共设计8条寡核苷酸探针，所述的7对特异性引物可分别扩增出包括上述7个SNP位点在内的DNA片段。0078具体来说，基因芯片的制备方法可按照如下步骤进行0079原料准备0080醛基芯片高分子三维基片D，厂商CAPITALBIO，规格为755252100081基因芯片点样液CAPITALBIO，5ML或2SPOTINGSOLUTION等00821、寡核苷酸探针序列设计如序列表所述，按照本领域技术人员熟知的方法合成5端氨基标记探针，所

33、述寡核苷酸探针与各SNP位点的对应关系如下所示说明书CN102363806ACN102363824A7/10页90083008400852、将合成的探针溶解于基因芯片点样液中或将探针与2SPOTINGSOLUTION等体积混合，使终浓度为40PMOLS/L，用点样仪如SMARTARRAYTM，CAPITALBIOCORP或CARTESIANTECH，PROSYS5510A芯片制作系统点制在经过醛基修饰的芯片基片上，干燥后保存，其中芯片上探针排列顺序如下0086RS2200733SNP1RS2200733SNP2RS2200733SNP3RS2200733SNP4RS10033464SNP1RS

34、10033464SNP2RS10033464SNP3RS10033464SNP4RS13376333SNP1RS13376333SNP2RS13376333SNP3RS13376333SNP4RS6843082SNP1RS6843082SNP2RS6843082SNP3RS6843082SNP4RS17042171SNP1RS17042171SNP2RS17042171SNP3RS17042171SNP4RS2106261SNP1RS2106261SNP2RS2106261SNP3RS2106261SNP4说明书CN102363806ACN102363824A8/10页10RS7193343S

35、NP1RS7193343SNP2RS7193343SNP3RS7193343SNP4阳性对照PC00873、对芯片进行前处理将芯片置于75的相对湿度、30条件下4872小时进行固定，然后将芯片沸水浴30秒，取出室温充分干燥。0088或按下列步骤对芯片进行前处理00891将芯片置于密闭、100湿度的湿盒中，37过夜处理；00902将芯片放于025NABH4溶液中，水平摇床80RPM上还原处理5MIN；00913在蒸馏水中，水平摇床80RPM上清洗5MIN；00924重复步骤3一次；00935把芯片放置于50ML专门的离心甩干管中，2000RPM离心1MIN。0094经如上处理的芯片即可用于杂交。

36、0095在本实施例中，选用玻璃基质作为芯片的载体，所述玻璃基质的基片带有经化学修饰处理的活化醛基基团，而寡核苷酸探针为按照序列表设计的寡核苷酸片段，其末端带有氨基标记，因此DNA探针附带的修饰氨基可与玻璃基质的活化醛基基团共价结合，利用此法DNA探针就可按一定的排列规律固定在基片表面。因此可方便地根据使用者的要求制出所需芯片，芯片制作的步骤简洁方便、成本较低。也可选用经活化的尼龙膜作为芯片的固相载体。0096PCR芯片的具体制备可按照如下步骤进行00971、特异性引物的序列设计如序列表所示，按照本领域技术人员熟知的方法合成带有5端信号标记的上下游引物，所述信号标记为荧光标记或地高辛标记，所述特

37、异性引物与各SNP位点的对应关系如下所示0098说明书CN102363806ACN102363824A9/10页1100992、采用预制PCR芯片的形式，将PCR扩增试剂和各特异性引物对定量预点于96孔实时定量PCR板如ABI公司，于20保存。96孔实时定量PCR板，每排12孔，每个基因位点设复孔，共12孔，每排检测1个病人，可以同时检测8个病人的同一SNP位点。0100基因芯片的具体使用方法可按照如下步骤进行01011、样本DNA提取使用DNA提取试剂提取样本DNA，如刮取受检者的口腔粘膜上皮细胞，加入同等体积的细胞裂解液，裂解两次，充分溶解白细胞，离心后弃上清，加入蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K

38、50UG/ML，65孵育10分钟，异丙醇沉淀、75乙醇洗涤两次，晾干后溶于适量TB溶液中。01022、PCR扩增检测时在PCR芯片中加入相应的受检者DNA提取液，进行多重PCR扩增，反应条件为预变性953MIN，9430S，5830S，721MIN，40个循环，725MIN，HOLD4。01033、PCR产物纯化使用PCR产物纯化试剂纯化PCR产物，如在PCR产物中加入02LEXOI，1LSAP，3L10SAP反应缓冲液和15L去离子水，将PCR芯片放入PCR仪中进行纯化，纯化程序3730MIN，9610MIN，HOLD4。01044、杂交取同一待检样本的各个PCR扩增产物各2L混合，加入杂交

39、液15L，95变性处理3MIN，冰上放置2MIN以上后上样于芯片，盖上盖玻片，置于40湿盒中杂交30MIN。01055、芯片清洗将芯片移至装有预热有芯片清洗液如05SSC，01SDS，PH74的50ML管中，于42轻摇洗涤5MIN。说明书CN102363806ACN102363824A10/10页1201066、以荧光检测检测为例0107扫描将芯片放置于扫描仪LUXSCAN10K或GENERALSCANNING芯片信号分析系统SCANNARRAY3000中按既定程序扫描。0108以地高辛显色法检测为例0109地高辛显色试剂处理芯片后，用光学扫描仪扫描杂交信号，用相应软件对结果进行分析。0110

40、7、结果判定作为对照的杂交点会在PC即阳性对照，POSITIVECONTROL位置出现绿色荧光信号或显色信号，提示本次杂交成功，同时阴性对照的位点不应该出现荧光或显色信号，此时结果的判读视为有效。0111由信号点显现的位置即可断定该患者是否携带与房颤术后复发相关的SNP位点。说明书CN102363806ACN102363824A1/15页1300010002序列表CN102363806ACN102363824A2/15页140003序列表CN102363806ACN102363824A3/15页150004序列表CN102363806ACN102363824A4/15页160005序列表CN1

41、02363806ACN102363824A5/15页170006序列表CN102363806ACN102363824A6/15页180007序列表CN102363806ACN102363824A7/15页190008序列表CN102363806ACN102363824A8/15页200009序列表CN102363806ACN102363824A9/15页210010序列表CN102363806ACN102363824A10/15页220011序列表CN102363806ACN102363824A11/15页230012序列表CN102363806ACN102363824A12/15页240013序列表CN102363806ACN102363824A13/15页250014序列表CN102363806ACN102363824A14/15页260015序列表CN102363806ACN102363824A15/15页27序列表CN102363806A