技术领域
本发明涉及一种保肝药物或保健品组合物及其制备方法和用途。
背景技术
化学性肝损伤的发生与日常接触化学毒物、酒精及一些药物有关，这些 因素易造成肝脏功能受损。大自然和人类工业生产过程中均存在一些对肝脏 有毒性的物质，称为“亲肝毒物”，这些毒物在人群中普遍易感，潜伏期短， 病变的过程与感染的剂量直接相关，可引起肝脏不同程度的肝细胞坏死、脂 肪变性、肝硬化和肝癌。
随着生活水平的提高，人们对酒精的接触几率呈上升趋势。因而，也增 加了酒精对肝脏损伤的几率。酒精性肝损伤容易发展为酒精性肝病。酒精性 肝病(ALD)是发达国家的常见病，是导致肝硬化的主要病因。我国作为一个 酒消耗大国，饮酒人群较大，造成临床上与饮酒相关的疾病如脂肪肝、肝硬 化等有逐渐增加的趋势。然而，酒精性肝病至今没有特效药，改善机体状况 的根本措施是戒酒，而酒精成瘾性使得戒酒对大部分饮酒人群来说较为困难。 因而，在适量饮酒的同时，也急需具有保肝功能的保健食品预防酒精对肝脏 的损害。
目前，已经报道具有抗肝损伤的药物已有数十种，如虫草、大黄、三七、 黄芪、苦参、丹参、枸杞子、五味子、灵芝、马齿苋、绞股蓝、川芎等，其 中，不乏药食同源的中药材。因此，从中药中寻找可用于预防肝损伤的药物， 也就成为了研究的热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于治疗或者预防肝损伤的药物或保健品 组合物及其制备方法和用途；本发明的另一目的在于提供基于该药物或保健 品组合物的咀嚼片，以及该咀嚼片的制备方法。
本发明提供了一种保肝药物或保健品组合物，它是由如下重量配比的原 料药制备而成的制剂：
杜仲叶666-2500份、金银花575-3450份、菊花159-2155份、灵芝孢子 25-100份。
进一步地，它是由杜仲叶提取物、金银花提取物、菊花提取物、破壁灵 芝孢子粉为活性成分制备而成的制剂：
杜仲叶提取物100-200份、金银花提取物115-345份、菊花提取物35-280 份、破壁灵芝孢子粉25-100份；优选为杜仲叶提取物150份、金银花提取物 115份、菊花提取物35份、破壁灵芝孢子粉50份。
其中，所述的杜仲叶提取物中，绿原酸含量不低于20％；金银花提取物 中，绿原酸含量不低于20％；菊花提取物中，总黄酮含量不低于2％；破壁灵 芝孢子粉中，灵芝总三萜含量不低于3％。
其中，所述的杜仲叶提取物为杜仲叶用水提取后，再用70-90％V/V乙醇 醇沉所得的上清液的干燥物；杜仲叶为杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)的干燥树叶；
金银花提取物为金银花用水提取后，再用70-90％V/V乙醇醇沉所得的上 清液的干燥物；金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.红腺忍 冬Lonicera confusa CD.或毛花柱忍冬Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花 蕾或初开的花；
菊花提取物为菊花用水提取后，再用70-90％V/V乙醇醇沉所得的上清液 的干燥物；菊花为菊科植物菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat)的干燥 头状花序；
破壁灵芝孢子粉为灵芝孢子经破壁所得细粉，破壁率大于90％；灵芝为 多孔菌科真菌赤芝(Ganoderma lucidum)或紫芝(Ganoderma sinensis)的 干燥子实体。
其中，所述的制剂为口服制剂。
进一步地，所述的制剂为胶囊、颗粒剂、散剂、丸剂、片剂、滴丸或口 服液。
本发明还提供了一种制备上述药物或保健品组合物的方法，包括如下步 骤：
(1)称取如下重量配比的原料药：
杜仲叶666-2500份、金银花575-3450份、菊花159-2155份、灵芝孢子 25-100份；
(2)取杜仲叶，用水提取后，再用70-90％V/V乙醇醇沉，上清液干燥后 即得杜仲叶提取物；取金银花，用水提取后，再用70-90％V/V乙醇醇沉，上 清液干燥后即得金银花提取物；取菊花，用水提取后，再用70-90％V/V乙醇 醇沉，上清液干燥后即得菊花提取物；取灵芝孢子，经破壁处理后所得细粉 即为破壁灵芝孢子粉，其破壁率大于90％；
(3)将杜仲叶提取物、金银花提取物、菊花提取物、破壁灵芝孢子粉混 合，加入药学上可接受的辅料制备成制剂。
进一步地，杜仲叶提取物的制备方法为：取杜仲叶，加水温浸，滤过， 滤液合并，浓缩，浓缩液加入乙醇使含醇量达到70-90％，优选80％，醇沉， 搅匀，静置，待沉淀完全，取上清液，减压回收溶剂，干燥，即得杜仲叶提 取物；
金银花提取物的制备方法为：取金银花，加水煎煮，滤过，滤液合并， 浓缩，浓缩液加入乙醇使含醇量达到70-90％，优选80％，醇沉，静置，待沉 淀完全，取上清液，减压浓缩，干燥，即得金银花提取物；
菊花提取物的制备方法为：取菊花，加水煎煮，滤过，滤液合并，浓缩， 浓缩液加入乙醇使含醇量达到70-90％，优选80％，醇沉，静置，待沉淀完全， 取上清液，减压浓缩，干燥，即得菊花提取物；
破壁灵芝孢子粉的制备方法为：取灵芝孢子，加水在25-50℃温浸，再 加入破壁酶浸泡后，煮沸10-30min，优选20min，过滤，干燥，即得破壁灵 芝孢子粉。
本发明还提供了上述药物或保健品组合物在制备治疗/预防肝损伤的药 物或保健品中的用途。
进一步地，所述药物是治疗/预防酒精性肝损伤的药物。
本发明还提供了一种预防/治疗肝损伤的咀嚼片，它是由如下重量配比的 原辅料制备而成的：
杜仲叶提取物 100-200份、 金银花提取物 115-345份、
破壁灵芝孢子粉 25-100份、 菊花提取物 35-280份、
β-环糊精 25-100份、 填充剂 130-705份、
崩解剂 11-39份、 粘合剂 1.8-6.5份、
矫味剂 0.9-3.5份、 润滑剂 0.8-14.5份。
其中，所述填充剂为淀粉、糊精、乳糖、可压性淀粉、甘露醇；所述崩 解剂为羟丙纤维素、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基纤维素、交联聚乙烯 吡咯烷酮；所述粘合剂为乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、聚维酮K30；所 述润滑剂为硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉；所述矫味剂为阿斯巴甜、甘露醇、 甜菊苷、蔗糖。
进一步地，所述填充剂为乳糖、甘露醇，其中乳糖∶甘露醇＝1∶1-1∶3； 崩解剂为羟丙纤维素；粘合剂为聚维酮K30；润滑剂为硬脂酸镁；矫味剂为 阿斯巴甜。
进一步地优选地，它是由如下重量配比的原辅料制备而成的：
本发明还提供了上述咀嚼片的制备方法，它包括如下操作步骤：
(1)先用25-100份β-环糊精将25-100份破壁灵芝孢子粉包合，得破 壁灵芝孢子粉包合物；
(2)取1.8-6.5份粘合剂，制备成浓度为3％-8％W/V的乙醇溶液；再将 100-200份杜仲叶提取物、115-345份金银花提取物、35-280份菊花提取物、 50-200份破壁灵芝孢子粉包合物混合，加上130-705份填充剂、11-39份崩 解剂、0.9-3.5份矫味剂混合均匀后，加入粘合剂制备的乙醇溶液，制备软 材，制粒，干燥后，加入0.8-14.5份润滑剂，压片，即得咀嚼片。
进一步地，所述乙醇溶液的浓度为5％W/V。
更进一步地，它包括如下操作步骤：
(1)先取β-环糊精50份及50-70％V/V乙醇按1∶0.8-1∶1.2研磨均匀， 然后加入50份破壁灵芝孢子粉充分研磨，将研磨包合物于50-65℃、 -0.07～-0.09MP条件下干燥，即得破壁灵芝孢子粉包合物；
(2)取5份聚维酮K30溶于85-95％V/V乙醇中制成浓度为5％W/V的乙醇 溶液；再将破壁灵芝孢子粉包合物与115份金银花提取物、150份杜仲叶提 取物、35份菊花提取物混合，并加上112.5份甘露醇、112.5份乳糖、15份 羟丙纤维素、2.5份阿斯巴甜，混合均匀后，加入前述乙醇溶液，制备软材， 制粒、干燥后，混入2.5份硬脂酸镁，压片，即得咀嚼片。
本发明药物或保健品组合物将杜仲叶提取物等四种原料配伍使用后，发 挥了协同增效作用，能够更为有效地减轻酒精对肝脏的损伤，减轻肝细胞脂 肪变性，且该组合物安全无毒，为保肝药物或保健品提供了一种新的选择。
附图说明
图1本发明药物或保健品组合物制备方法的流程图
图2评判指标总得分的估算边际均值考察图
具体实施方式
实施例1本发明药物或保健品组合物的制备
先取β-环糊精100g及60％V/V乙醇按1∶1研磨均匀，然后加入100g 破壁灵芝孢子粉充分研磨，将研磨包合物于60℃、-0.08MP条件下干燥4h。 再将上述破壁灵芝孢子粉包合物与230g金银花提取物、300g杜仲叶提取物、 70g菊花提取物混合，并加上225g甘露醇、225g乳糖、30g羟丙纤维素、5g 阿斯巴甜，混合均匀后，取10g聚维酮K30溶于90％食用酒精中制成5％(W/V) 溶液作为粘合剂，制备软材，将制得的软材于60℃恒温干燥箱中进行干燥， 至水分含量为3％时，过20目筛整粒即得到干燥后颗粒，混入5g的硬脂酸镁， 压片即得到本品1000片，1.3g/片。
本发明中，各原料是指：
杜仲叶提取物
【产品名称】杜仲叶提取物
【英文名称】Eucommiae Folium P.E.
【来源】本品为杜仲科植物杜仲Eucommiae ulmoides Oliv.的干燥 叶经加工制成的提取物。可以通过购买市售商品得到，也可以通过一下方法 制备得到：
取杜仲叶，晒干，粉碎，加入16倍量纯化水，加热至50℃，浸渍3h， 滤过，滤液50℃减压浓缩至相对密度1.13～1.18，加入乙醇使含醇量达到80％， 搅匀，静置24h，离心，取上清液，减压回收乙醇，浓缩液喷雾干燥，即得。 本发明杜仲叶提取物的得率为8-15％。
【检查】
水分按GB/T5009.3-2003《食品中水分的测定》第一法，不得超过5％。
【含量测定】按GB/T 22250-2008《保健食品中绿原酸的测定》，绿原酸 含量不得低于20％。
金银花提取物
【产品名称】金银花提取物
【英文名称】Lonicera japonica Flos P.E.
【来源】本品为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thumb.的干燥 花蕾或带初开的花经加工制成的提取物。可以通过购买市售商品得到，也可 以通过一下方法制备得到：
取金银花，分别以20、12和8倍量纯水煎煮3次(第一、二次1小时， 第三次0.5小时)，滤过，滤液合并，浓缩，浓缩液加入乙醇使含醇量达到 80％，静置24h，取上清液减压浓缩后，干燥，即得。本发明金银花提取物的 得率为10-20％。
【检查】水分 按GB/T5009.3-2003《食品中水分的测定》第一法， 不得超过5.0％。
【含量测定】按GB/T 22250-2008《保健食品中绿原酸的测定》，绿原酸 含量不得低于20％。
菊花提取物
【产品名称】菊花提取物
【英文名称】Chrysanthemi Flos P.E.
【来源】本品为菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的 干燥头状花序经加工制成的提取物。可以通过购买市售商品得到，也可以通 过一下方法制备得到：
取菊花，分别以20、12和8倍量纯水煎煮3次(第一、二次1小时，第 三次0.5小时)，滤过，滤液合并，浓缩，浓缩液加入乙醇使含醇量达到80％， 静置24h，取上清液，减压浓缩后，干燥即得。本发明菊花提取物的得率为 13％-22％。
【检查】水分 按GB/T5009.3-2003《食品中水分的测定》第一法， 不得超过5.0％。
【含量测定】按《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)“保健食品 中总黄酮的测定”规定的方法测定，总黄酮含量不得低于2％。
破壁灵芝孢子粉
【产品名称】破壁灵芝孢子粉
【来源】本品为多孔菌科真菌赤芝(Ganoderma lucidum)或紫芝 (Ganoderma sinensis)的干燥孢子经破壁所得细粉。可以通过购买市售商 品得到，也可以通过一下方法制备得到：
取灵芝孢子，加入3倍量水，35℃恒温搅拌浸泡12h，再加入灵芝孢子 1.5％W/W的破壁酶浸泡3h后，100℃煮沸20min，过滤，研磨镜检后干燥灭菌， 即得破壁灵芝孢子粉。灵芝孢子的破壁方法也可按照现有文献报道的方法进 行，如李淑芳等，灵芝孢子破壁技术的研究，食品工业科技，2008，vo1.29， NO.09。本发明中破壁酶可采用纤维酶、纤维酶-蛋白酶复合酶。
【检查】水分 按GB/T5009.3-2003《食品中水分的测定》第一法， 不得超过5.0％。
破壁率 按NY/T1677-2008《破壁灵芝孢子粉破壁率的测定》，不得低于 90％。
【含量测定】按DB44/T496-2008《灵芝中三萜类物质的测定》，灵芝 总三萜含量不得低于3％。
实施例2本发明药物或保健品组合物的制备
取杜仲叶提取物100g、金银花提取物345g、菊花提取物280g、破壁灵 芝孢子粉100g。混匀后，加适量糊精、可溶性淀粉，湿法制粒后，即得颗粒 剂。
实施例3本发明药物或保健品组合物的制备
取杜仲叶提取物200g、金银花提取物115g、菊花提取物35g、破壁灵芝 孢子粉25g，再加入适量微晶纤维素，混匀后，装胶囊，即得胶囊剂。
实施例4本发明药物或保健品组合物中原料药配比的筛选
根据参考文献用量，采用正交设计对所选定的原料进行最优化选择，筛 选出最佳的配比。参照《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)进行 实验，验证本组方是否对化学性肝损伤具有辅助保护作用，动物模型为酒精 性肝损伤模型，以试验动物肝脏中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)、还 原型谷胱甘肽(GSH)、甘油三酯(TG)为判定指标。
表1正交因素水平表(L9(34))
表2动物组织检查结果
表3空白对照组与模型组动物组织检查结果
注：△△表示与阴性对照组比较P＜0.05
根据配方称取各物料，按正交试验安排表进行试验。参照《保健食品检 验与评价技术规范》(2003年版)选择受试动物肝组织中脂质过氧化代谢产物 丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、甘油三酯(TG)作为评价指标。 在模型成立的前提下，与模型对照组相比，预期本品可使得受试动物体内丙 二醛、甘油三酯浓度明显低于模型对照组，使还原型谷胱甘肽浓度明显高于 模型对照组。因此，以丙二醛、甘油三酯各实验浓度与实验平均浓度比值的 倒数作为该指标得分，以还原型谷胱甘肽各实验浓度与实验平均浓度比值作 为指标得分，然后以三个指标得分相加得到总得分，作为正交试验评价指标。 (计算公式如下所示)
10-18号实验对应1-9号实验，作为重复对照试验，以进行数学统计。
公式一： P MDA = 1 m i * n / Σ i = 1 n m i ]]>
公式二： P GSH = g i * n Σ i = 1 n g i ]]>
公式三： P TG = 1 t i * n / Σ i = 1 n t i ]]>
公式四：P总得分＝PMDA+PGSH+PTG
表4正交试验：主体间效应的检验
因变量：总分
a.R方＝0.950(调整R方＝0.894)
表5杜仲叶提取物水平间比较结果
Duncana，b
表6金银花提取物水平间比较结果
Duncana，b
表7菊花提取物水平间比较结果
Duncana，b
表8破壁灵芝孢子粉水平间比较结果
Duncana，b
正交试验结果可见，组合物中原料组合比例最佳为A2B1C1D2，即杜仲叶 提取物∶金银花提取物∶菊花提取物∶破壁灵芝孢子粉＝150∶115∶35∶50。从其 他组合中可见，四个原料以不同比例组合形成的组合物，对酒精性肝损伤均 有一定保护作用，表现为能够抑制酒精肝损伤引起的丙二醛的升高，提高肝 脏中还原型谷胱甘肽的浓度并降低甘油三酯的含量，以正交试验筛选出的最 佳组合效果最优；在模型组成立的前提下，最佳组合与模型对照组有显著性 差异，参照《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)评判标准，表明 筛选的组合物对酒精性肝损伤具有辅助保护作用。
实施例5本发明咀嚼片辅料及制备方法的筛选
1辅料的筛选
根据实施例1四味原料组分的物化性质及咀嚼片的特点，依据压片前颗 粒的休止角及吸湿率和成品的外观、口感等指标进行评定，确定辅料用量。
针对咀嚼片，辅料主要包括填充剂，粘合剂，润滑剂，矫味剂等，制成 的片剂应具有较好的外观与口感、口味，能够被目标人群所接受。
填充剂可选择的种类有淀粉、蔗糖、糊精、乳糖、可压性淀粉、甘露醇 等；黏合剂可选择的种类有乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、聚维酮K30等； 润滑剂可选择的种类有硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉等。
本品原料含有较多的提取物，口味较苦，可压性较差，吸湿性强，遇水 容易呈胶状，依据这些特点进行辅料的筛选。
甘露醇无吸湿性，溶解时吸热，口腔有舒服感，在咀嚼片中最为常用； 乳糖无吸湿性，可压性好，性质稳定，与大多数药物不起化学反应，成片光 洁美观，可以改善片剂表面光滑性。同时，考虑到目标人群可能存在糖尿病 患者和热量摄入限制人群，避免使用蔗糖，选择甘露醇和乳糖作为填充剂。 淀粉、糊精、可压性淀粉等在试验中发现，气味和口感难以接受，不适用于 本发明组合物。
以甘露醇和乳糖作为填充剂，与拟定每片用量的原料进行混合，分别以 水、70％食用酒精、90％食用酒精作为黏合剂，进行黏合剂的筛选。在预实验 中发现，黏合剂中含有较多的水时，物料黏性急剧增加，结成团呈胶状，无 法过2号筛；90％食用酒精作为黏合剂时，黏性又不足以使物料形成较好的颗 粒。淀粉浆、羧甲基纤维素钠等辅料配成水溶液后粘度较大，用量少，不利 于充分分散，容易造成本配方物料制粒不均匀，片剂表面形成黑点等现象。 因此选择在90％食用酒精中加入聚维酮K30作为配方中的黏合剂，利用高浓 度的乙醇将聚维酮K30分散，与物料混合时起到黏合作用。
表9黏合剂预筛选试验
考虑到目标人群可能采用含化的方式服用本品，在其中加入少量的崩解 剂以加快含化和咀嚼时片剂溶解速度。选择了口感和可压性较好的羟丙纤维 素。
配方中含有较多的提取物，口感较苦，加入适量的阿斯巴甜作为矫味剂 以掩盖苦味；加入咀嚼片中常用的硬脂酸镁作为润滑剂，增加颗粒流动性， 防止粘冲的发生。由于本品中含有破壁灵芝孢子粉，首先将破壁灵芝孢子粉 与β-环糊精进行包合，在增加破壁灵芝孢子粉所含活性成分稳定的同时，可 以掩盖其特有的嗅味及苦味，改善产品口感。参考文献资料及预试验结果， 将破壁灵芝孢子粉包合工艺确定为：先将β-环糊精及60％食用酒精按1∶1 研磨均匀，然后加入与β-环糊精等量的破壁灵芝孢子粉充分研磨15mim，将 研磨包合物于60℃、-0.08MP条件下干燥4h，即得。将包合物与组方中杜仲 叶提取物、金银花提取物、菊花提取物作为原料，进行辅料的筛选。
初步选定的辅料种类如下表所示。
表10初步确定的辅料列表
根据参考文献拟定各辅料基本用量，同时，对填充剂，黏合剂浓度，润 滑剂的用量及原料与填充剂比例共四因素进行正交试验以确定各辅料用量。 因素水平见下表。
表11L9(34)正交因素水平表
注：G为甘露醇，R为乳糖
以100片片剂量进行试验，按照正交因素水平表设定各实验中辅料用量， 与配方相当量的原料进行混合，加入相应浓度的黏合剂，制软材，以“轻捏 成团，轻压即碎”作为软材判断方法，记录黏合剂使用体积；将制的软材于 60℃恒温干燥箱中进行干燥，至水分含量为3％时，过2号筛整粒即得到干燥 后颗粒，混入设计量的润滑剂，压片即得到本咀嚼片。
采用干燥后颗粒休止角、颗粒收率、压成片外观和硬度作为评价指标， 对各水平因素实验进行评分，将上述四项指标得分相加得到各水平因素实验 的总分进行评价，以考察各因素对片剂成型的影响。正交试验结果见下表。
表12正交试验结果
a.R方＝0.963(调整R方＝0.922)
注释：**为P＜0.01。
结果显示，黏合剂浓度(B)和原料与填充剂比例(D)的不同有极显著性差 异，为影响片剂成型的主要影响因素。对评判指标总得分的估算边际均值见 图2。
对黏合剂浓度应用Duncan法进行多重比较发现，5％浓度的黏合剂优于其 他两个浓度的黏合剂；根据黏合剂使用体积与浓度，确定出黏合剂聚维酮K30 的用量为10g/1000片(5g/100ml*200ml/100片*1000片＝10g)。
表13黏合剂浓度考察
在原料与填充剂比例的多重比较中，原料与填充剂比例为80∶45时优于 其他两个比例。结果见下表。
表14原料与填充剂比例考察
同时，对填充剂中甘露醇和乳糖比例、润滑剂用量通过直观分析，以甘 露醇∶乳糖＝1∶1、润滑剂用量为0.4％较好。
即可选择如下配比：
杜仲叶提取物150份、金银花提取物115份、破壁灵芝孢子粉50份、 菊花提取物35份、甘露醇112.5份、乳糖112.5份、β-环糊精50份、聚 维酮K305份、羟丙纤维素15份、阿斯巴甜2.5份、硬脂酸镁2.5份。
综合正交试验结果和片重确定结果，确定本品的最终配方，如下：
共1300g，制成1000片，1.3g/片
以下通过具体试验例来进一步证明本发明的有益效果。
试验例1本发明药物或保健品组合物与各原料单独使用功效对比
1按照配方比例称取各原料，即杜仲叶提取物、金银花提取物、菊花提 取物和破壁灵芝孢子粉，混合均匀作为组合物功效实验组；分别按配方比例 称取各原料作为单独使用功效实验组。
2试验分组及剂量设计：将雌性昆明小鼠随机分为七组，每组10只动物。 设组合物组和杜仲叶提取物组、金银花提取物组、菊花提取物组和破壁孢子 粉组四个单独使用组。本发明组合物组经口灌胃组合物混悬液(实施例1组 合物与水混合，用时摇匀)，剂量为350mg/kg.BW(相当于人体推荐服用量 10倍)；各单独使用组分别经口灌胃350mg/kg.BW杜仲叶提取物、 350mg/kg.BW金银花提取物、350mg/kg.BW菊花提取物、350mg/kg.BW破壁 孢子粉混悬液(原料与水混合，用时摇匀)。另设蒸馏水对照组和50％乙醇 模型对照组。用乙醇(分析纯)造成肝损伤模型，乙醇浓度为50％(以蒸馏 水稀释)，灌胃量12ml/kg.BW(折合乙醇的剂量为6000mg/kg.BW)。
3试验方法：采用酒精肝损伤模型法，组合物组和单独使用组给予对应的 受试物，阴性对照组和模型对照组给予蒸馏水，按10ml/kg.BW每天经口灌 胃一次，连续给予30天，每周称两次体重，以此调整给药量。试验结束时将 模型对照组、组合物组和单独使用组一次经口灌胃给予50％乙醇，剂量为 12ml/kg.BW，阴性对照组给予同体积的蒸馏水，禁食16h后处死动物取肝脏 称重，计算脏体比，并用肝脏进行生化指标检测及组织病理学检查。
4检测指标：肝匀浆中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)、还原型谷 胱甘肽(GSH)的测定：MDA和GSH测定试剂盒由南京建成生物工程研究 所提供，用上海天美科学仪器有限公司生产的UV1100分光光度计测定。
5试验数据统计：试验数据统计采用SPSS 11.0 for windows软件包处理。 对照组与各剂量组的数据经方差齐性检验，方差齐，进行方差分析，如P值 小于0.05，则用Dunnett法进行两两比较；若方差不齐，则进行数据转换， 仍不齐，改用秩和检验，如P值小于0.05，则用Dunnett’s T3法进行两两比 较。阴性对照组与模型对照组数据则采用T检验。
6实验结果
6.1组合物与各原料单独使用对小鼠肝匀浆中MDA、还原型GSH含量的影 响，对比结果见表15。
表15对小鼠肝匀浆中MDA、还原型GSH含量的影响
△△表示与阴性对照组比较P＜0.05，**表示与模型对照组比较P＜0.05。
试验表明，模型对照组与阴性对照组小鼠肝匀浆MDA含量有显著性差异 (P＜0.05)，即模型组造成小鼠肝脏MDA含量显著上升，表明模型组建立是成 功的。在实施例1组合物组与杜仲叶提取物组、金银花提取物组、菊花提取 物组、破壁灵芝孢子粉组中，仅实施例1组合物组与模型组对照有显著性差 异(P＜0.05)，即实施例1组合物能够有效降低酒精性肝损伤引起的肝组织 MDA含量升高；四种原料单独使用时与模型组对比没有显著性差异(P＞ 0.05)，但仍表现出了一定的降低MDA趋势。
同时，模型对照组与阴性对照组小鼠肝匀浆还原型GSH含量有显著性差 异(P＜0.05)，即模型组造成小鼠肝脏还原型GSH含量显著下降，表明模型组 建立是成功的。在实施例1组合物与杜仲叶提取物组、金银花提取物组、菊 花提取物组、破壁灵芝孢子粉组中，仅实施例1组合物组与模型组对照有显 著性差异(P＜0.05)，表明实施例1组合物能够有效降低酒精性肝损伤引起 的肝组织还原型GSH含量降低；四种原料单独使用时与模型组对比没有显著 性差异(P＞0.05)，但杜仲叶提取物和破壁灵芝孢子粉表现出了一定升高GSH 趋势。
6.2组合物与各原料单独使用对血液中AST、ALT、SOD及肝脏指数的影响， 对比结果见表16。
表16对血液中AST、ALT、SOD及肝脏指数影响对比
△△表示与阴性对照组比较P＜0.05，**表示与模型对照组比较P＜0.05。
各实验组动物血液中AST、ALT、SOD及肝脏指数比较重可见，模型组与 阴性对照组SOD指标有显著性差异(P＜0.05)，表明模型组建立成功；组合 物组SOD指标与模型组有显著性差异(P＜0.05)，表明组合物能够有效抑制 酒精性肝损伤造成的SOD含量降低；AST、ALT、肝脏指数在阴性对照组、模 型组及各实验组中没有显著性差异(P＞0.05)。
上述试验均在同等剂量下进行比较，试验结果表明，将四种原料配伍使 用后，产生了协同增效作用。
试验例2功效学测试
将确定的配方进行中试生产，制成成品，委托四川省疾病预防控制中心 进行功效学、安全毒理学等试验，表明本品对酒精性化学肝损伤具有辅助保 护作用，并且属于无毒品，安全性良好。
1试验分组及剂量设计：将雌性SD大鼠随机分为五组，每组10只动物， 试验设325mg/kg.BW、975mg/kg.BW、1950mg/kg.BW三个剂量组(分别相 当于人体每日推荐量的5、15、30倍)，分别称取8.13g、24.38g、48.75g受 试物，依次加蒸馏水至250ml混匀备用，冰箱保存，用完再配。另设蒸馏水 对照组和50％乙醇模型对照组。用乙醇(分析纯)造成肝损伤模型，乙醇浓 度为50％(以蒸馏水稀释)，灌胃量12ml/kg.BW(折合乙醇的剂量为6000mg/kg. BW)。
2试验方法：采用酒精肝损伤模型法，三个剂量组给予不同剂量的受试物， 阴性对照组和模型对照组给予蒸馏水，按10ml/kg.BW每天经口灌胃一次， 连续给予30天，每周称两次体重，以此调整给药量。试验结束时将模型对照 组和三个剂量组一次经口灌胃给予50％乙醇，剂量为12ml/kg.BW，阴性对 照组给予同体积的蒸馏水，禁食16h后处死动物取肝脏称重，计算脏体比， 并用肝脏进行生化指标检测及组织病理学检查。
3检测指标
3.1肝匀浆中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽 (GSH)及甘油三酯(TG)的测定：MDA和GSH测定试剂盒由南京建成 生物工程研究所提供，用上海天美科学仪器有限公司生产的UV1100分光光 度计测定；TG测定试剂盒由广州标佳科技有限公司提供，用美国贝克曼库 尔特有限公司生产的CX4全自动生化分析仪进行测定。
3.2肝脏称重及脏器系数的计算
3.3肝脏组织病理学诊断标准
3.3.1病理观察材料：从动物肝左叶中部做横切面取材、切片、染色、镜 下观察脂滴在肝脏中的分布、范围和面积。
3.3.2病理观察方法：每例动物肝组织用40倍物镜连续记录70个视野， 每个视野根据阳性细胞多少和分布的范围，按0、1、2、3、4分进行评分。 将70个视野所得分数的平均值作为该例肝组织的脂肪染色评分。
3.3.3病理诊断标准：病理组织学观察以肝细胞脂滴染色作为观察指标， 并根据病理改变程度“0”、“1”、“2”、“3”、“4”量化，进行肝损伤程度的评 价。
3.3.4肝细胞脂肪染色共分为五级：
4试验数据统计
试验数据统计采用SPSS 11.0 for windows软件包处理。对照组与各剂量 组的数据经方差齐性检验，方差齐，进行方差分析，如P值小于0.05，则用 Dunnett法进行两两比较；若方差不齐，则进行数据转换，仍不齐，改用秩和 检验，如P值小于0.05，则用Dunnett’s T3法进行两两比较。阴性对照组与 模型对照组数据则采用T检验。
5实验结果
5.1本发明药物或保健品组合物对大鼠肝匀浆中MDA、还原型GSH、TG含 量的影响见表17。
表17对大鼠肝匀浆中MDA、还原型GSH、TG含量的影响
注：△△表示与阴性对照组比较P＜0.01，*表示与模型对照组比较P＜0.05。 5.2本发明药物或保健品组合物对大鼠肝脏组织病理学影响见表18。
表18大鼠肝脏组织病理学检查结果
注：△△表示与阴性对照组比较P＜0.01，*表示与模型对照组比较P＜0.05。 5.3本发明药物或保健品组合物对大、小鼠急性经口毒性试验结果见表19。
表19本发明药物或保健品组合物对大、小鼠急性经口毒性试验结果
本发明药物或保健品组合物连续30天经口灌胃给予雌性SD大鼠后，可 见动物生长发育正常。在酒精性肝损伤模型成立的基础上，中、高剂量组能 显著降低大鼠肝匀浆中的过氧化脂质降解产物丙二醛含量(P＜0.05)；中、 高量组大鼠肝匀浆中的还原型谷胱甘肽含量升高有显著性差异(P＜0.05)；而 各剂量组大鼠肝匀浆中的甘油三酯含量与模型对照组之间无显著性差异 (P＞0.05)；高剂量组的肝组织脂肪染色评分降低有显著性差异(P＜0.05)， 组织病理学检查结果为阳性。依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003 年版)中之规定，本发明药物或保健品组合物对雌性SD大鼠具有酒精性肝 损伤辅助保护功能。
本发明药物或保健品组合物对大、小鼠急性经口毒性试验结果MTD值 均＞15000mg/kg.BW，按急性毒性分级，属无毒级。
三项遗传毒性试验(Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验以及小 鼠精子畸形试验)结果未见本发明药物或保健品组合物致突变作用。
30天喂养试验，可见动物生长发育正常，体重持续增长，体态活泼，被 毛光滑柔顺，大、小便未见异常改变。试验期间未见动物出现中毒症状及死 亡。三个剂量组雌雄大鼠的每周体重、每周进食量、每周食物利用率及总食 物利用率、脏体比值与对照组比较，均无显著性差异(P＞0.05)；三个剂量 组雌雄大鼠的血液学指标和末期血生化指标检测结果与对照组比较，除雄鼠 中剂量组的白细胞计数和甘油三酯降低有显著性差异外(P＜0.05)，其余指 标均无显著性差异(P＞0.05)，以上所测值均在本室正常值范围内。组织病 理学检查结果，除动物自发病变外，未见受试物高剂量组引起动物中毒性损 伤改变。
综上所述，本发明药物或保健品组合物将杜仲叶提取物等四种原料配伍 使用后，发挥了协同增效作用，能够更为有效地减轻酒精对肝脏的损伤，减 轻肝细胞脂肪变性，且该组合物安全无毒，为保肝药物或保健品提供了一种 新的选择。