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1、(10)授权公告号 CN 102772429 B (45)授权公告日 2015.02.04 CN 102772429 B (21)申请号 201210272362.7 (22)申请日 2012.08.01 A61K 33/24(2006.01) A61K 31/337(2006.01) A61K 31/17(2006.01) A61K 31/282(2006.01) A61K 31/7068(2006.01) A61K 9/08(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/04(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 31/10(200。
2、6.01) A61P 31/12(2006.01) (73)专利权人 牛旗 地址 100083 北京市海淀区黑山扈路甲 17 号 专利权人 李倩 (72)发明人 李倩 (74)专利代理机构 安徽省合肥新安专利代理有 限责任公司 34101 代理人 何梅生 (54) 发明名称 一种能杀伤放化疗耐药肿瘤细胞和肿瘤干细 胞的癌症治疗药物 (57) 摘要 本发明公开了一种能杀伤放化疗耐药肿瘤 细胞和肿瘤干细胞的癌症治疗药物及其应用， 其 特征是药物组成为 ： 每 100 毫升药液含无水乙醇 2-10 毫升、 顺铂 40-50 毫克和灭菌水 90-98 毫升。 本发明药物主要用于肿瘤局部注射或胸、 腹、。
3、 心包 腔恶性积液的灌注治疗或肺部肿瘤的雾化吸入治 疗， 适用于肺癌、 肝癌、 胰腺癌、 卵巢癌、 子宫颈癌、 乳腺癌、 腹膜后肿瘤或腹膜后淋巴结转移、 贲门 癌、 胃肠道恶性肿瘤、 软组织肉瘤、 胶质瘤和头颈 部肿瘤等各种实体肿瘤及伴有胸、 腹、 心包腔恶性 积液的耐药或不耐药的肿瘤治疗。 (51)Int.Cl. 审查员 姚张欢 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 (10)授权公告号 CN 102772429 B CN 102772429 B 1/1 页 2 1. 一种能杀伤放化疗耐药。
4、肿瘤细胞和肿瘤干细胞的癌症治疗药物， 其特征是所述药物 组成为 ： 每 100 毫升药液含无水乙醇 2-10 毫升、 顺铂 40-50 毫克和灭菌水 90-98 毫升。 权 利 要 求 书 CN 102772429 B 2 1/5 页 3 一种能杀伤放化疗耐药肿瘤细胞和肿瘤干细胞的癌症治疗 药物 技术领域 0001 本发明涉及一种药物， 更具体地说是癌症治疗药物。 背景技术 0002 目前认为肿瘤干细胞是肿瘤转移复发和放化疗耐药的根源， 也是肿瘤治疗失败和 死亡的最主要原因。 ABCG2等跨膜转运体能将化疗药有效泵出细胞以避免细胞遭受损害， 是 导致肿瘤干细胞耐药的关键。 寻找并建立能有效杀伤。
5、肿瘤干细胞和克服放化疗耐药对于控 制肿瘤和改善癌症患者预后有重要意义， 对此， 迄今为止没有相关文献的公开报导。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种能杀伤放化疗耐药肿瘤细胞和肿瘤干细胞的癌症治疗 药物， 用于多种放化疗耐药或不耐药实体瘤的有效治疗。 0004 本发明为解决技术问题采用如下技术方案 ： 0005 本发明能杀伤放化疗耐药肿瘤细胞和肿瘤干细胞的癌症治疗药物的特点是所述 药物组成为 ： 每 100 毫升药液含无水乙醇 2-10 毫升、 顺铂 40-50 毫克和灭菌水 90-98 毫升。 0006 本发明能杀伤放化疗耐药肿瘤细胞和肿瘤干细胞的癌症治疗药物的特点也在于 ： 可以用于。
6、替代顺铂的是 ： 多西紫杉醇、 卡莫司汀、 奥沙利铂、 卡铂和吉西他滨中的一种或多 种任意组合。 0007 本发明药物在制备治疗肺癌、 肝癌、 胰腺癌、 卵巢癌、 子宫颈癌、 乳腺癌、 腹膜后肿 瘤或腹膜后淋巴结转移、 贲门癌、 胃肠道恶性肿瘤、 软组织肉瘤和头颈部肿瘤的各种实体肿 瘤及伴有胸、 腹、 心包腔恶性积液的耐药或不耐药的肿瘤的药物中的应用。 0008 本发明药物在制备治疗耐药细菌或真菌或病毒从而使其对抗感染药物重新敏感 的药物中的应用。 0009 治疗机理 ： 0010 肿瘤干细胞是肿瘤转移复发和放化疗耐药的根源， 也是肿瘤治疗失败和死亡的最 主要原因。 ABCG2等跨膜转运体能将。
7、化疗药有效泵出细胞以避免细胞遭受损害， 是导致肿瘤 干细胞耐药的关键。2-10% 乙醇能部分或全部灭活肿瘤细胞和肿瘤干细胞膜上的 ABCG2 跨 膜转运体从而阻滞肿瘤细胞内化疗药物被其泵出而使化疗药物积聚在细胞内， 从而与化疗 药协同发挥杀伤化疗耐药肿瘤细胞或肿瘤干细胞的作用。 0011 本发明药物在体外能高效杀伤肿瘤干细胞并能使 3 只荷瘤裸鼠肿瘤消退及余下 荷瘤裸鼠肿瘤生长停滞。生存分析表明， 本发明药物能显著延长荷瘤裸鼠生存时间。与已 有技术相比， 本发明的有益效果体现在 ： 0012 1、 本发明可以克服各种肿瘤的化疗药耐药和放疗耐受， 高效杀伤耐药肿瘤， 适用 于各种放化疗无效的实体。
8、瘤和恶性胸、 腹、 心包腔积液治疗。 0013 2、 本发明制备方法操作简便、 成本低， 非常适合工业化生产。 说 明 书 CN 102772429 B 3 2/5 页 4 0014 3、 本发明各组分均为国家食品药品管理局允许的肿瘤治疗成分， 且各组分间不发 生相互作用， 可以即刻进入临床应用。 附图说明 0015 图 1 为应用流式细胞仪 SP 分选法分选获得 A549/DDP 细胞系的 SP 细胞并证明其 富含并可代表肺癌肿瘤干细胞。 0016 图 2-1 和图 2-2 为流式细胞仪分析肺癌肿瘤干细胞凋亡情况。 0017 图 3 为本发明治疗荷瘤裸鼠的肿瘤体积变化。 0018 图 4 为。
9、四组动物治疗后的生存情况， 利用发明治疗荷瘤裸鼠后动物生存时间显著 延长。 具体实施方式 0019 以下动物试验对本发明有益效果作进一步说明 ： 从 A549/DDP 分离侧群细胞作 为肺癌肿瘤干细胞来验证本发明在体外的杀伤效能。体内试验采用耐顺铂肺腺癌细胞系 A549/DDP 皮下接种裸鼠建立荷耐化疗药肿瘤动物模型， 以研究本发明杀伤耐药肿瘤的体内 药效。其方法、 结果和结论如下 ： 0020 1材料与方法 0021 1.1 细胞系和细胞培养 0022 人肺腺癌细胞 （A549/CDDP） 购自中科院生化细胞所细胞库。人肺腺癌 A549/CDDP 细胞培养于含 2 mol 顺铂 ( 齐鲁医药。
10、公司 ) 和 10% 灭活胎牛血清 （Gibco 公司） 的高糖 DMEM（Gibco 公司） 培养液， 置于 37含 5% CO的培养箱中培养。细胞用 0.25% 胰蛋白酶 消化传代。 0023 1.2 SP 细胞分选 0024 取对数生长期的细胞制备成单细胞悬液。自培养皿中以 0.25 % 胰酶 -EDTA 消化、 收集细胞,1000 r/ min 低速离心10 min ,用含2%FBS 的磷酸缓冲盐溶液( PBS ) 重悬。 调整细胞密度为 106个 /ml, 设实验组和对照组。实验组加入 Hoechst 33342 (Sigma, St Louis, MO, USA)至终浓度为5g/m。
11、l， 对照组加入维拉帕米(Sigma, St Louis, MO, USA) 至终浓度为 50mol/ml， 37 5 % CO2 、 95 % 湿度孵箱中孵育 90 min ,1 000 r/ min 离 心 , 以含 2 %FBS 的 PBS 重悬至 1 106 / mL , 经 40m 滤网过滤后于 4 下存放至检 测。 检测前,加碘化丙啶( PI) 染色标记死亡细胞, 然后入流式细胞仪FACS Vantage SE （BD Bioscience） 检测分选， 350 nm 波长紫外光激发 Hoechst 染色 , 荧光通过 405/BP30 （Hoechst 蓝色） 和 570/BP2。
12、0（Hoechst 红色） 光学过滤器检测。 （将低 Hoechst Red 及低 Hoechst Blue 且维拉帕米缺失区域设定为SP细胞的门） ， 计算百分比， 分选出SP 细胞和非 SP 细胞。SP 和 non-SP 的 A549/DDP 细胞在经流式细胞仪分选后加入完全 RPMI 培养基中， 并在 2 小时内为进一步的实验使用。 0025 1.3 克隆形成试验 0026 用平板克隆形成试验来评估SP 和non-SP A549/CDDP 细胞的体外成瘤能力。 取生 长良好的SP 和 non-SP A549/DDP细胞用PBS洗1次， 0.1%-0.2%的胰蛋白酶消化后加入含 10% 小。
13、牛血清的培养液。1000r/min 离心 10min 后收集细胞， 用含 10% 小牛血清的培养液制 说 明 书 CN 102772429 B 4 3/5 页 5 成单细胞悬液， 使 100 个 SP 和 100 个 non-SP A549/DDP 细胞分别培养在 6 孔培养板上， 每组各有 3 个复孔。培养基每周换 2 次， 10 天后每个孔在显微镜下进行克隆计数。按下述 公式计算克隆形成率 (%CFE) = (克隆数/接种细胞数) 100， 并计算了克隆形成率的对 数形式进行比较。 0027 1.4 流式细胞技术分析肺癌干细胞凋亡率 0028 流式细胞仪分离的侧群细胞经对照、 顺铂、 2-。
14、10% 乙醇、 2-10% 乙醇 - 顺铂处理 小时后， 用 2.5g/L 的胰蛋白酶消化收集细胞， 用 Annexin V-FITC apoptosis detection kit (BioVision, Mountain View, CA, USA) 并用 FACScalibur flow cytometer (BD Bioscience) 流式细胞仪检测细胞凋亡率 ( 按试剂盒中说明书操作 )。 0029 1.5 动物和肿瘤生长 0030 Balb/C裸鼠和NOD/SCID鼠均为雌性， 6周龄， 体质量18-20g， 购于中国实验动物学 会(CALAS)。 取对数生长期的细胞， 经胰蛋白。
15、酶消化收集细胞， 洗次， 悬浮于生理盐 水， 取 5 x106的 A549/DDP 0.2ml 单细胞悬液分别接种至 NOD/SCID 鼠 （成瘤试验） 或 Balb/ C 裸鼠 （肿瘤生长试验） 左侧肋部皮下， 建立皮下移植瘤模型。荷瘤裸鼠肿瘤体积达 0.6cm3 左右后， 将 48 只 Balb/C 裸鼠随机分为以下 4 组， 对照组、 顺铂组、 2-10% 乙醇组、 2-10% 乙 醇 - 顺铂组， 每组 12 只， 并开始相应治疗， 治疗为 0.2ml 相应药液瘤内注射， 每 3 天一次， 共 4 周。密切观察皮下肿瘤生长情况， 每 3 天用游标卡尺测量肿瘤大小 1 次， 按公式 V=。
16、 1/2 长径 短径 2， 计算肿瘤体积， 并绘制皮下移植瘤生长曲线。动物生存观察至动物死亡或至 125 天截尾。 0031 1.6 体内成瘤试验 0032 24 只 5 周龄的雌性联合免疫缺陷 (NOD/SCID) 小鼠购于中国实验动物学会 (CALAS， 北京 ) 培养在无菌环境。小鼠分为 8 组， 每组 3 只， 分别于侧肋皮下注射接种 100 l 含5 105， 1 105， 5 104， 5 103 SP 细胞， 或含1 107， 5 106， 5 105， 5 104 non-SP 细胞悬液。密切观察皮下肿瘤生长情况， 每周用游标卡尺测量肿瘤大小， 按公式 ： V= 1/2 长径 。
17、短径 2， 计算肿瘤体积。成瘤能力比计算按公式 ： 成瘤能力比 = 成 瘤所需的 non-SP 细胞数 / 成瘤所需的 SP 细胞数。 0033 1.7 统计学分析 0034 统计学分析应用 SPSS19 软件。生存数值表达为均数 标准误， 分析采用 Kaplan-Meier方法计算。 计量资料数值表达为均数标准差， 采用t检验和方差分析进行 统计分析。P 0.05 表示差异显著有统计学意义。 0035 2 结果 0036 2.1 肺癌肿瘤干细胞的鉴定 0037 经过 Hoechst33342 染色后的流失细胞分析发现 A549/CDDP 细胞中存在 10%-17% 的 SP 细胞。加入维拉帕。
18、米的对照组 A549/CDDP 细胞中 SP 细胞消失了 ( 图 1)。 0038 克隆形成试验观察了 10 天。SP 细胞的克隆形成能力较 non-SP 细胞明显高。 SP 细胞的 Log10 CFE (colony forming effi ciency) 和 non-SP 细胞相比有明显统计学差异 (1.544 0.150 vs 0.301 0.082, P0.05, 图 1)。 0039 体内成瘤试验发现， 接种SP细胞的小鼠只需要5 103 个SP细胞便足以成瘤， 而 接种non-SP细胞的小鼠却需要超过5 106 个non-SP细胞才能在体内成瘤(图1)。 A549/ 说 明 书 。
19、CN 102772429 B 5 4/5 页 6 CDDP 细胞分选获得的 SP 成瘤能力是 non-SP 细胞成瘤能力的 1,000 倍。其中， 各接种 5 104 或 5 105 个 SP 细胞的 6 只小鼠侧肋均有瘤体形成， 而各接种 5 104 或 5 105 个 non-SP 细胞的 6 只小鼠侧肋均无瘤体形成。 0040 上述结果表明 ,FACS 分选获得的 SP 细胞具有肿瘤干细胞的成瘤特性 , 为富含肺 癌肿瘤干细胞的细胞群体 , 可以代表肺癌肿瘤干细胞用于肿瘤干细胞生物学特性和干预 研究。 0041 图 1 中上图最上方 A、 B 两图为应用流式细胞仪 SP 分选法分选获得 。
20、A549/DDP 细胞 系的 SP 细胞 ； 中左侧图 C、 D、 E 和 F 为分选获得的 SP 细胞经过体外细胞集落形成试验鉴定 SP细胞具有肿瘤干细胞特性 ； 中右侧图G为SP与non-SP的集落形成能力直观比较图， 表明 SP 的集落形成能力显著高于 non-SP 细胞 （P0.01） ； 下图为分选获得的 SP 细胞经过 NOD/ SCID 鼠体内致瘤实验形成的肿瘤， SP 细胞致瘤能力显著强于 non-SP, 致瘤能力提高 1000 倍。这表明流式细胞仪分选的 A549/DDP SP 细胞具有肺癌肿瘤干细胞的成瘤特性。 0042 2.2 2-10% 乙醇 - 顺铂诱导肺癌肿瘤干细胞。
21、凋亡 0043 与对照组凋亡率 （2.56%0.007） 相比， 2-10% 乙醇 - 顺铂 （97.69%0.06） 能显著 诱导肺癌肿瘤干细胞凋亡 （P0.01） ， 而化疗药顺铂则不能。 0044 图 2-1 散点图为 Annexin V 染色细胞后流式细胞仪分析凋亡的直接结果图， 其 中， a 为对照肺癌肿瘤干细胞 ； b 为顺铂治疗后的肺癌肿瘤干细胞 ； c 为 2-10% 的乙醇治疗 后肺癌肿瘤干细胞 ； d 为 2-10% 的乙醇 - 顺铂治疗后的肺癌肿瘤干细胞。 0045 图 2-2 为四个处理组细胞经流式细胞仪分析后凋亡率直观比较图。从图中可以看 出， 2-10% 乙醇 - 。
22、顺铂能显著诱导肺癌肿瘤干细胞凋亡 （P0.01） 。 0046 2.3 2-10% 乙醇 - 顺铂能诱导荷化疗耐药肿瘤裸鼠肿瘤消退 0047 荷瘤动物治疗四周后， 2-10% 乙醇 - 顺铂组动物肿瘤体积 （0.0810.06 cm3） 低于 2-10% 乙醇 (3.720.83 cm3)、 顺铂 （2.130.31 cm3) 和对照组动物 （4.180.48 cm3)， 差 异均有显著性 (P0.01） ， 见图 3。其中， 2-10% 乙醇 - 顺铂组 3 只裸鼠肿瘤完全消退， 表明 2-10% 乙醇 - 顺铂能克服化疗耐药并高效杀伤肿瘤。 0048 图 3 中， 处最上方线为对照组动物肿。
23、瘤体积随时间增加后的变化线， 稍下方为 2-10% 乙醇治疗后动物肿瘤大小变化线， 再下方线为顺铂治疗组动物肿瘤大小变化线， 最下 方线为 2-10% 乙醇 - 顺铂治疗后动物肿瘤大小变化线。从上图可以看出， 2-10% 乙醇 - 顺铂 治疗后动物肿瘤体积显著缩小 （P0.01） 。 0049 2.4 2-10% 乙醇 - 顺铂显著延长荷瘤裸鼠生存 0050 荷瘤动物经 2-10% 乙醇 - 顺铂治疗后， 生存时间显著延长。2-10% 乙醇 - 顺铂组动 物估计平均生存时间 （123.671.11 天） 显著长于顺铂组 （100.254.41 天） 、 2-10% 乙醇组 （91.085.15。
24、 天） 和对照组 （88.927.52 天） ， 差异均具有显著性 （P0.01） 。 0051 图 4 中 a 线为 2-10% 乙醇 - 顺铂治疗组生存曲线， b 线为顺铂组生存曲线， c 线 为 2-10% 乙醇治疗组生存曲线， d 线为对照组动物生存曲线。从上图 4 可以看出， 2-10% 乙 醇 - 顺铂治疗组动物生存时间显著延长 （P0.01） 。 0052 3. 结论 0053 综上所述， 2-10% 乙醇 - 顺铂可以高效杀伤肺癌肿瘤干细胞和诱导荷瘤裸鼠耐药 肿瘤消退并显著延长荷耐药肿瘤动物生存时间。 说 明 书 CN 102772429 B 6 5/5 页 7 0054 本发。
25、明药物使用方法和用量 ： 0055 通过加入 2-10 毫升无水乙醇、 40-50 毫克顺铂和 90-98 毫升的灭菌水制备成 100 毫升药液。每位实体瘤患者可用上述药液 20-30 毫升进行肿瘤内局部注射或 1020 毫升 雾化吸入 （治疗肺癌） , 每周 1-2 次 , 连续 2-3 周治疗为一疗程。对于胸、 腹、 心包腔恶性积 液患者， 每例病人取 100-500 毫升含 2-25 毫升无水乙醇和 10-30 毫克顺铂的灭菌水溶液用 于恶性胸腹腔和心包腔积液的灌注治疗 , 每周 2-3 次 , 连续 2-3 周治疗为一疗程。 说 明 书 CN 102772429 B 7 1/4 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102772429 B 8 2/4 页 9 图 2-1 说 明 书 附 图 CN 102772429 B 9 3/4 页 10 图 2-2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102772429 B 10 4/4 页 11 图 4 说 明 书 附 图 CN 102772429 B 11 。