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1、(10)申请公布号 CN 103720722 A (43)申请公布日 2014.04.16 CN 103720722 A (21)申请号 201410022755.1 (22)申请日 2014.01.16 A61K 36/06(2006.01) A61K 9/20(2006.01) A61K 9/48(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 合肥工业大学 地址 230009 安徽省合肥市包河区屯溪路 193 号 (72)发明人 叶明 卢莹 宋升 (74)专利代理机构 安徽省合肥新安专利代理有 限责任公司 34101 代理人 汪祥虬 (54) 发明名称 水溶性粒。
2、毛盘菌黑色素在制备抑制肝癌药物 中的用途 (57) 摘要 本发明公开了一种水溶性粒毛盘菌黑色素在 制备抑制肝癌药物中的用途， 特征是将菌种保藏 编号为 CCTCC No:M2011054 的粒毛盘菌所产胞内 黑色素， 经组氨酸分子修饰后， 得到水溶性粒毛盘 菌黑色素 ； 药效学实验证明该水溶性粒毛盘菌黑 色素不仅具有显著的抑制肝癌功能， 且无毒副作 用， 其制备方法简单经济， 故可将菌种保藏编号为 CCTCC No:M2011054 的粒毛盘菌胞内黑色素及其 水溶性黑色素， 按药剂学的常规制备方法， 将有效 量的水溶性粒毛盘菌黑色素与适量的药用辅料混 合加工制备成口服片剂或胶囊剂型的抑制肝癌药。
3、 物。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103720722 A CN 103720722 A 1/1 页 2 1. 一种水溶性粒毛盘菌黑色素在制备抑制肝癌药物中的用途， 将菌种保藏编号为 CCTCC No:M2011054 的粒毛盘菌发酵后提取纯化制备得到的胞内黑色素， 采用组氨酸对该 胞内黑色素进行修饰， 改性后得到水溶性粒毛盘菌黑色素 ； 其特征在于 ： 将该水溶性粒毛 盘菌黑色素应用在制备抑制肝癌药物中的用途。 2. 如权利。
4、要求 1 所述水溶性粒毛盘菌黑色素在制备抑制肝癌药物中的用途， 特征在于 所述水溶性粒毛盘菌黑色素为， 将菌种保藏编号为 CCTCC No:M2011054 的粒毛盘菌发酵后 提取纯化制备得到的胞内黑色素按如下条件采用组氨酸对该胞内黑色素进行修饰 ： 将胞内 黑色素与组氨酸， 和水， 按摩尔比为 1:2 5:50 100 混合， 震荡至黑色素固体溶解， 离心 后将该溶液于截留分子量为200Da的透析袋透析2448h， 冷冻干燥， 所得到的水溶性粒毛 盘菌黑色素。 3. 如权利要求 1 所述水溶性粒毛盘菌黑色素在制备抑制肝癌药物中的用途， 特征在于 按药剂学的常规制备方法将有效量的水溶性粒毛盘菌。
5、黑色素与药用辅料混合加工制备成 片剂或胶囊。 权 利 要 求 书 CN 103720722 A 2 1/8 页 3 水溶性粒毛盘菌黑色素在制备抑制肝癌药物中的用途 技术领域 0001 本发明属于粒毛盘菌黑色素在医药领域中的应用技术领域， 具体涉及菌种保藏编 号为 CCTCC No:M2011054 的粒毛盘菌的水溶性黑色素作为制备抑制肝癌药物的用途。 背景技术 0002 恶性肿瘤是临床上常见的疾病之一， 亦是导致人类死亡的主要病因之一。 目前， 恶 性肿瘤的治疗主要采用放、 化疗等方法， 通常使用的化疗药物多为化学合成物质而非天然 产物， 因此在杀死肿瘤细胞的同时， 对正常细胞也有一定程度的杀。
6、伤作用 ； 且单纯化疗会使 患者食欲不振， 体重降低， 导致机体衰弱， 并引起一定程度的免疫抑制， 毒副作用较大。因 此， 挖掘与开发天然、 无毒副作用的抗肿瘤药物对维护人类健康具有重要的意义。 0003 黑色素是通过多羟基酚氧化而成的构造不规则的类多酚聚合体， 来源于动物、 植 物及微生物， 一般只溶于碱液， 不溶 （或微溶）于水。据英国 细胞微生物学 （Cellular Mirobiology,2003,5,167-223） 介绍， 黑色素常与蛋白质牢固结合， 且不溶于水。 0004 粒毛盘菌属是一类腐生性真菌， 近几年来本发明人课题组研究发现粒毛盘菌具有 重要的经济价值。如中国 食品科学。
7、 （2009,30:185-189） 及荷兰 国际生物大分子杂志 （International Journal of Biological Macromolecules,2014,63:170-176） 介绍了粒毛 盘菌一些菌株深层发酵后可产生大量黑色素， 具有较强的抗氧化、 抗辐射等活性。 中国专利 号ZL201110072469.2公开了一株保藏编号为CCTCC No:M2011054的粒毛盘菌YM-292 （本发 明人课题组自定的编号代码） 液态发酵制备胞内黑色素的方法。所制备的胞内黑色素具有 较强的光保护作用， 且经过毒理性试验证实其安全无毒， 同时该粒毛盘菌黑色素在 pH 7 时稳定。
8、， pH 6 时沉淀， 室温下其在水中溶解度仅为 0.11g/100g。由于该粒毛盘菌黑色素 在水中的难溶性使其在医疗、 食品等领域的应用受到限制。若能将碱溶性黑色素改性成水 溶性黑色素， 以便于人体吸收， 可充分发挥其保健功能， 具有重大意义。 目前， 国内外对黑色 素进行改性的研究很少。中国专利号 ZL201210218401.5 公开了一种将粒毛盘菌胞外黑色 素改性为水溶性黑色素的方法， 即将黑色素与精氨酸或组氨酸或赖氨酸， 和水， 按质量比为 1:0.51.5:4.550混合， 震荡至黑色素固体溶解后， 将溶液干燥得到水溶性粒毛盘菌黑 色素。 目前国内外未见有公开文献提及以粒毛盘菌黑色。
9、素作为制备抗肿瘤药物的应用方面 的报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种菌种保藏编号为CCTCC No:M2011054的粒毛盘菌水溶 性黑色素在制备抑制肝癌药物中的用途， 确立菌种保藏编号为 CCTCC No:M2011054 的粒毛 盘菌水溶性黑色素抑制肝癌的药理作用。 0006 本发明水溶性粒毛盘菌黑色素在制备抑制肝癌药物中的用途， 将菌种保藏编号为 CCTCC No:M2011054的粒毛盘菌发酵后提取纯化制备得到的胞内黑色素， 采用组氨酸 （His） 对该胞内黑色素 （LIM） 进行修饰， 改性后得到水溶性粒毛盘菌黑色素 （HLIM） ； 其特征在于 ： 说 明 书 C。
10、N 103720722 A 3 2/8 页 4 通过其对小鼠抑制肝癌的作用药理实验， 确立水溶性粒毛盘菌黑色素 （HLIM） 的抑制肝癌作 用 ； 该水溶性粒毛盘菌黑色素 （HLIM） 在制备抑制肝癌药物中的用途 ： 按药剂学的常规制备 方法， 将有效量的水溶性粒毛盘菌黑色素 （HLIM） 与药用辅料混合加工制备成口服片剂或胶 囊。 0007 本发明中参考专利号 ZL201210218401.5 中公开的改性方法， 并可以略作改进， 即 ： 将原公开专利改性方法中的黑色素、 组氨酸和水的混合方式由按质量比改为按摩尔比， 具体修改方法如下 ： 将菌种保藏编号为 CCTCC No:M2011054。
11、 的粒毛盘菌的胞内黑色素与组 氨酸， 和水， 按摩尔比为 1:2 5:50 100 混合， 震荡至黑色素固体溶解后， 将溶液干燥亦 获得水溶性粒毛盘菌黑色素。采用本发明上述方法得到的改性粒毛盘菌胞内黑色素， 室温 下在水中的溶解度由原来改性前的 0.11g/100g 提高到了改性后的 4.77g/100g， 优于采取 原来专利号 ZL201210218401.5 中已公开的现有改性方法中的条件进行改性后得到的改性 粒毛盘菌胞内黑色素的溶解度 （4.69g/100g） 。采用本发明方法可以克服原保藏号为 CCTCC No:M2011054 的粒毛盘菌 (Lachnum singerianum) 。
12、胞内黑色素由于难溶于水而不适合用于 制成口服制剂或食品添加剂用于医疗、 食品等领域的问题， 对于扩展黑色素的应用领域和 适用范围具有积极意义。经药效学实验表明， 该水溶性粒毛盘菌黑色素具有显著的抑制肝 癌功能， 且无毒副作用， 克服了现有化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时， 对正常细胞也有一定 程度杀伤作用， 且单纯化疗会使患者食欲不振， 体重降低， 导致机体衰弱， 并引起一定程度 的免疫抑制， 毒副作用较大等缺点。 本发明方法简单经济， 可将水溶性粒毛盘菌黑色素应用 于制备片剂或胶囊剂型的抑制肝癌药物。 附图说明 0008 图 1 为改性前的原粒毛盘菌 （Lachnum） CCTCC No:M20。
13、11054 胞内黑色素的红外光 谱图 ； 0009 图 2 为采用本发明中所述的方法对粒毛盘菌 （Lachnum） CCTCC No:M2011054 胞内 黑色素采用组氨酸进行改性修饰后的水溶性黑色素的红外光谱图。 具体实施方式 0010 实施例 1 ： 0011 一、 粒毛盘菌胞内黑色素 （LIM） 的制备 ： 0012 将菌种保藏编号为 CCTCC No:M2011054 的粒毛盘菌接种于 5L 发酵罐， 培养基 配方为按质量百分比由马铃薯汁 20%， 葡萄糖 2%， 蛋白胨 1%， 酪氨酸 0.03%， K2HPO40.05%， MgSO47H2O0.05% 组成 ； 装料系数体积比为。
14、 0.7， 接种量为 8%（体积比） ， 培养温度为 27， 通气量为 1.0L/min， 搅拌转速为 180r/min， 发酵时间为 8 天 ； 将发酵液抽滤， 收集菌丝体， 60烘干， 按菌丝体的质量 （g） 与浓度为 0.4mol/L 的氢氧化钠 （mL） 比为 1:200（g/mL） 混 匀， 80水浴浸提 2h， 抽滤得浸提液 ； 用 1mol/LHCl 调节上述浸提液 pH 值为 2， 静置 12h， 得 到黑色素悬浮液 ； 然后将上述黑色素悬浮液离心， 弃上清， 所得到的沉淀经去离子水洗涤至 pH 值为 7 后真空冷冻干燥， 即得黑色素粗品 ； 将该黑色素粗品经 7mol/L H。
15、Cl 于 100酸解 2h， 以除去与黑色素结合的蛋白质及碳水化合物。然后将酸解后得到的沉淀经双蒸水洗涤 至上清液pH值为7时重新溶于1mol/L NH3 H2O溶液， 旋转蒸发仪蒸去NH3至溶液pH为7.5 说 明 书 CN 103720722 A 4 3/8 页 5 后， 依次经乙酸乙酯、 氯仿、 无水乙醇萃取， 以除去脂类物质， 萃取后除去有机相， 水相调 pH 值为2， 5000r/min离心10min， 沉淀经去离子水反复洗涤至上清液Cl定性检测为阴性后， 真空冷冻干燥， 即得菌种保藏编号为 CCTCC No:M2011054 的粒毛盘菌胞内黑色素 （LIM） 。 0013 二、 水。
16、溶性粒毛盘菌黑色素 （HLIM） 的制备 ： 0014 按黑色素与组氨酸摩尔比分别为 1:0.5,1:1,1:1.5,1:2,1:2.5,1:3,1:3.5,1: 4， 1:4.5,1:5, 分别取一定量的粒毛盘菌胞内黑色素 （1g）和组氨酸， 溶于 100mL 蒸馏水 中， 室温下振荡溶解， 离心、 稀释后测定溶液的吸光度值， 以溶液的最大吸光度值确定组 氨酸的添加量。结果表明黑色素与组氨酸摩尔比在 1:0.5 1:5 时， 溶液的吸光度值随 组氨酸量的增大而增大， 其中当黑色素与组氨酸摩尔比为 1:2 时， 溶液的吸光度值达到 最大 (0.3940.005)， 黑色素与组氨酸摩尔比小于 0。
17、.5 时， 溶液的吸光度值基本保持在 0.394-0.395 范围内。可此可知， 1:2 为组氨酸与黑色素的最佳摩尔比。然后将溶液于截留 分子量为 200Da 的透析袋透析 36h， 冷冻干燥后获得水溶性粒毛盘菌黑色素 （HLIM） 。对其 进行复溶实验， 结果表明该组氨酸 - 黑色素复溶效果较好， 室温下在蒸馏水中的溶解度为 4.77g/100g。 0015 三、 水溶性粒毛盘菌黑色素 （HLIM） 的结构验证 ： 0016 分别取前面制备的粒毛盘菌胞内黑色素 （LIM） 及上述制备的水溶性粒毛盘菌黑 色素 （HLIM）各 2mg， 分别与 400mg 干燥的 KBr 研磨后压片， 采用傅里。
18、叶变换红外光谱仪 （Nexus670）进行 IR 光谱分析， 扫描范围是 4000-400cm-1。图 1 为改性前的原粒毛盘菌 （Lachnum） CCTCC No:M2011054 胞内黑色素的红外光谱图 ； 图 2 为采用上述方法对粒毛盘 菌 （Lachnum） CCTCC No:M2011054 胞内黑色素采用组氨酸进行改性修饰后的水溶性黑色 素的红外光谱图。对比分析这两个红外光谱图的结果表明， 改性前后的粒毛盘菌 CCTCC No:M209193 胞外黑色素均具有真菌黑色素的特征吸收峰， 即 3388cm-1和 1629cm-1处的 C=O 和-O(N)H基团特征吸收峰， 此外水溶性。
19、黑色素在1659.67cm-1和1636.01cm-1处具有黑色素 的羰基与组氨酸的氨基结合形成的特征吸收峰， 在 3000cm-1-3200cm-1处具有组氨酸咪唑环 上 C-H 的伸缩振动吸收峰 ； 在 1463.33cm-1-1576.63cm-1处具有组氨酸咪唑环上 C=N 伸缩振 动吸收峰， 在 1171.06cm-1处具有组氨酸咪唑环上 C-H 面内弯曲振动吸收峰。该结果表明组 氨酸对粒毛盘菌胞内黑色素改性成功。 0017 四、 粒毛盘菌胞内黑色素 （LIM） 及水溶性粒毛盘菌黑色素 （HLIM） 的抑制肝癌作用 药理实验 ： 0018 （1） 粒毛盘菌胞内黑色素及其水溶性黑色素生。
20、理盐水溶液的制备 ： 将上述粒毛盘 菌胞内黑色素及其通过组氨酸对粒毛盘菌胞内黑色素改性后的水溶性黑色素粉末用质量 百分浓度为 0.9% 的生理盐水分别配置成 50mg/mL、 100mg/mL 和 200mg/mL 的水溶液， 采取的 给药体积为 0.25mL/ 每只小鼠。 0019 （2） 动物 ： 昆明小鼠 100 只， 雌雄各半， 体重 222g， 随机分组。 0020 （3） 试剂盒 ： 采用的超氧化物歧化酶 （SOD） 测试盒、 过氧化氢酶 （CAT） 测试盒、 丙二 醛 （MDA） 试剂盒、 小鼠白细胞介素 -2（IL-2） ELISA 试剂盒和肿瘤坏死因子 -（TNF-） ELI。
21、SA 试剂盒， 为南京建成生物工程研究所生产的产品 ； 阳性药物 ： 环磷酰胺， 为上海华联 制药有限公司生产的产品。 0021 （4） 方法 ： 将小鼠 H22 肝癌细胞常规培养后， 调整浓度为 2106个 /ml。取昆明小 说 明 书 CN 103720722 A 5 4/8 页 6 鼠 10 只， 每只腹腔注射 0.5ml 细胞悬液进行瘤细胞体内增值。常规饲养 7d 后， 选择生长状 态良好的小鼠取腹水瘤细胞， 离心后弃上清， 用无菌生理盐水稀释至细胞浓度为107个/ml。 另取健康小鼠 80 只 （雌雄各半） ， 每只小鼠右侧腋部皮下接种 0.2ml 上述细胞悬液， 常规饲 养 4d 。
22、后， 得到肿瘤直径达到 0.5cm 左右的 H22 荷瘤模型小鼠， 表明建模成功。 0022 将上述建模成功的 H22 荷瘤模型小鼠随机分为 8 组 （每组 10 只） ， 分别为模型对照 组 （0.9% 的生理盐水） 、 阳性对照组 （环磷酰胺， 25mgkg-1） 、 黑色素低剂量组 (50mgkg-1)、 黑色素中剂量组 (100mgkg-1)、 黑色素高剂量组 (200mgkg-1)、 水溶性黑色素低剂量组 (50mg kg-1)、 水溶性黑色素中剂量组(100mg kg-1)、 水溶性黑色素高剂量组(200mg kg-1)， 取 10 只健康小鼠作为空白对照组， 分别称体重并记录。灌。
23、胃给药 0.2ml/ 只， 1 次 /d， 连续 给药 12d。期间， 每日观察小鼠的一般活动、 皮毛、 反应能力等情况， 测定摄食量， 计算平均 值。末次给药后第 2d， 小鼠称体重， 脱颈椎处死。 0023 （5） 相关指标测定 ： 0024 抑瘤率及免疫器官指数测定 ： 分离瘤块， 称瘤质量， 计算抑瘤率 ： 0025 抑瘤率 =（模型组瘤质量 - 给药组瘤质量） / 模型组瘤质量 100% ； 0026 取脾脏和胸腺， 称质量， 计算脏器指数 ： 0027 脏器指数 = 脏器质量 / 体质量 100% ； 0028 SOD 酶活力、 C AT 酶活、 MDA 酶活、 IL-2 和 TN。
24、F- 水平的测定 ： 0029 从小鼠眼球取血， 以 5000r/min 离心 3min， 取血清放于 -20备用 ； 临用前恢复至 室温， 按照试剂盒说明书步骤进行操作， 测定 SOD 酶活力、 C AT 酶活力、 MDA 酶活力、 IL-2 和 TNF- 的水平。 0030 （6） 药理实验结果 ： 0031 表 1 给出了上述粒毛盘菌胞内黑色素及其水溶性黑色素对 H22 荷瘤小鼠摄食量、 体重增长率、 抑瘤率及脏器指数的影响。 0032 表 1 粒毛盘菌胞内黑色素及其水溶性黑色素对 H22 荷瘤 0033 小鼠摄食量、 体重增长率、 抑瘤率及脏器指数的影响 0034 说 明 书 CN 1。
25、03720722 A 6 5/8 页 7 0035 注 ： 与模型对照组相比， aP 0.05，bP 0.01。 0036 对表 1 中的各组指标参数进行比较分析， 可以看出粒毛盘菌胞内黑色素及其水溶 性黑色素对各处理组小鼠相关指标的影响。 0037 与模型对照组相比， 黑色素、 水溶性黑色素组小鼠的摄食量均有不同程度的增加， 而阳性对照组小鼠的摄食量显著降低了 23.02% （P 0.01） 。黑色素、 水溶性黑色素组小鼠 的体重增长率均低于模型对照组小鼠 （其中高剂量组差异显著） ， 但与正常组小鼠相比无显 著差异， 表明粒毛盘菌胞内黑色素及其水溶性黑色素可抑制小鼠肿瘤的生长， 而对小鼠自。
26、 身体重的增长无抑制作用。阳性对照组小鼠的体重增长率显著降低， 表明环磷酰胺在抑制 小鼠肿瘤生长的同时也抑制了小鼠自身体重的增长。与黑色素组相比， 阳性对照组小鼠精 神萎靡， 皮毛疏松杂乱无光泽， 反应迟钝， 活动明显减少， 此现象可能与环磷酰胺严重的毒 副作用有关， 表明粒毛盘菌胞内黑色素及其水溶性黑色素对 H22 荷瘤小鼠小鼠无明显的毒 副作用。 0038 黑色素各剂量组均表现出了显著的抑瘤作用， 且呈剂量效应关系。相同剂量的水 溶性黑色素对小鼠的抑瘤率均高于黑色素， 表明水溶性粒毛盘菌黑色素对 H22 荷瘤小鼠的 说 明 书 CN 103720722 A 7 6/8 页 8 抑瘤作用较黑。
27、色素显著。 0039 表 2 给出了上述粒毛盘菌胞内黑色素及其水溶性黑色素对 H22 荷瘤小鼠 SOD 酶 活、 CAT 酶活、 MDA 酶活、 IL-2 及 TNF- 的影响。 0040 表 2 粒毛盘菌胞内黑色素及其水溶性黑色素对 H22 荷瘤小鼠 0041 SOD 酶活 CAT 酶活 MDA 酶活 IL-2 和 TNF- 的影响 0042 0043 注 ： 与模型对照组相比， aP 0.05，bP 0.01。 0044 与模型对照组相比， 黑色素各剂量组胸腺指数、 脾脏指数均有不同程度提高， 且相 同剂量水溶性粒毛盘菌黑色素组小鼠的胸腺指数和脾脏指数均较黑色素组高， 其中高剂量 组具有显。
28、著性差异 (P0.01)， 表明黑色素对于这两大免疫器官具有良好的保护作用， 通过 促进细胞免疫和体液免疫， 增强机体自身抗肿瘤的作用。 阳性对照组小鼠胸腺指数、 脾脏指 数显著减小 (P0.01)， 表明环磷酰胺对荷瘤小鼠的脾脏和胸腺具有较强的毒副作用导致脾 脏和胸腺萎缩。 说 明 书 CN 103720722 A 8 7/8 页 9 0045 与正常对照组相比， 模型对照组小鼠血清中 SOD 酶活、 CAT 酶活、 IL-2 和 TNF- 的 水平显著降低， MDA 含量明显升高。与模型对照组相比， 黑色素、 水溶性黑色素组及阳性对 照组小鼠的 SOD 酶活、 CAT 酶活、 IL-2 和。
29、 TNF- 均有不同程度的增加， MDA 含量有所降低， 且均接近正常组小鼠水平。相同浓度的水溶性黑色素对 H22 荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用较黑 色素显著， 表明组氨酸改性修饰提高了该黑色素的抗肿瘤活性。 0046 上述药理学实验分析测定了小鼠肝癌病症最具代表性的指标， 从以上结果可以看 出， 在给药剂量为 50-200mg/kg 时， 菌种保藏编号为 CCTCC No:M2011054 的粒毛盘菌胞内 黑色素具有显著的抗肿瘤作用， 可显著显著提高 H22 荷瘤小鼠的摄食量、 体重、 抑瘤率、 胸 腺指数及脾脏指数， 有效增加有效增加 SOD、 CAT、 IL-2 和 TNF- 的水平， 降低 。
30、MDA 含量， 具 有明显的抗肿瘤活性。相同浓度水溶性粒毛盘菌黑色素的抗肿瘤活性明显增强。阳性药物 也具有显著的抗肿瘤活性， 但阳性药物组小鼠的摄食量、 体重、 胸腺指数和脾指数均明显降 低， 表明阳性药物在一定程度上影响了小鼠的免疫功能， 具有毒副作用， 而上述粒毛盘菌黑 色素及其水溶性黑色素均无明显的毒副作用。 0047 五、 水溶性粒毛盘菌胞内黑色素制剂的加工 ： 0048 1、 片剂加工 ： 0049 将 300-600g 的水溶性粒毛盘菌黑色素与药用辅料稀释剂 150-250g、 助流剂 20-50g 混匀后， 与 250-500mL 乙醇混合均匀制得软材， 软材过筛得到湿颗粒， 干。
31、燥后整粒， 最后加入润滑剂 5-10g 混匀后压片， 制成 1000 片片剂。所述药用辅料稀释剂选用糊精或干 淀粉 ； 所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素 ； 所述润滑剂采用硬脂酸镁或硬脂 酸锌。 0050 本实施例推荐的片剂加工的优选例为 ： 取过 80-100 目筛的上述粒水溶性粒毛盘 菌黑色素 500g、 稀释剂糊精 250g、 助流剂滑石粉 60g， 混合均匀后加 500mL 乙醇混合均匀制 得软材， 软材过筛得到湿颗粒， 干燥后整粒， 最后加入润滑剂硬脂酸镁 15g 混匀后压片， 制 成 1000 片， 片重 0.8g， 黑色素含量 0.5g/ 片。 0051 2、 胶囊剂加。
32、工 ： 0052 将药用辅料稀释剂 200-300g、 助流剂 50-70g、 润湿剂 2-6g 混匀后与 300-600g 的 上述水溶性粒毛盘菌黑色素混合均匀， 装 1# 空心胶囊， 制得胶囊剂 1000 粒。所述药用辅料 稀释剂选用糊精或干淀粉 ； 所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素 ； 所述润湿剂 采用十二烷基硫酸钠或者磺基丁二酸二辛酯。 0053 本实施例推荐的胶囊剂加工优选例为 ： 取稀释剂干淀粉 250g， 助流剂滑石粉 50g， 润湿剂十二烷基硫酸钠 5g 混合均匀与 500g 上述水溶性粒毛盘菌黑色素混合均匀后装 1# 空心胶囊 1000 粒， 黑色素含量 0.5g/。
33、 粒。 0054 本发明使用菌种保藏编号为 CCTCC No:M2011054 的粒毛盘菌水溶性黑色素， 并以 上述水溶性黑色素为原料作为制备抑制肝癌药物的应用， 所制备的药物克服了现有化疗药 物在杀死肿瘤细胞的同时， 对正常细胞也有一定程度杀伤作用， 且单纯化疗会使患者食欲 不振， 体重降低， 导致机体衰弱， 并引起一定程度的免疫抑制， 毒副作用较大等缺点， 且制备 方法简单经济。 0055 实施例 2 ： 0056 先按如下条件和方式制备获得粒毛盘菌胞内黑色素 ： 将菌种保藏编号为 CCTCC 说 明 书 CN 103720722 A 9 8/8 页 10 No:M2011054 的辛格粒。
34、毛盘菌接种于 5L 发酵罐， 培养基配方为 （按质量百分比） ： 马铃薯汁 20%， 葡萄糖 3%， 蛋白胨 1.5%， 酪氨酸 0.05%， K2HPO40.06%， MgSO47H2O0.04% ； 装料系数体积 比为 0.8， 接种量为 9%（体积比） ， 培养温度为 26， 通气量为 1.5L/min， 搅拌转速为 160r/ min， 发酵时间为 10 天 ； 将发酵液抽滤， 收集菌丝体， 60烘干， 按菌丝体的质量 （g） 与浓度 为 0.5mol/L 的氢氧化钠 （mL） 比为 1:180（g/mL） 混匀， 80水浴浸提 3h， 抽滤得浸提液 ； 用 1mol/LHCl 调节上。
35、述浸提液 pH 值为 2， 静置 15h， 得到黑色素悬浮液 ； 然后将上述黑色素 悬浮液离心， 弃上清， 所得到的沉淀经去离子水洗涤至 pH 值为 7 后真空冷冻干燥即得黑色 素粗品 ； 将黑色素粗品经 7mol/L HCl 于 100酸解 3h， 以除去与黑色素结合的蛋白质及碳 水化合物。然后将酸解后得到的沉淀经双蒸水洗涤至上清液 pH 值为 7 时重新溶于 1mol/L NH3H2O 溶液， 旋转蒸发仪蒸去 NH3 至溶液 pH 为 7.5 后， 依次经乙酸乙酯、 氯仿、 无水乙醇 萃取， 以除去脂类物质， 萃取后除去有机相， 水相调 pH 值为 2， 5000r/min 离心 8min。
36、， 所得沉 淀经去离子水反复洗涤至上清液 Cl 定性检测为阴性后， 真空冷冻干燥， 即得到菌种保藏 编号为 CCTCC No:M2011054 的粒毛盘菌胞内黑色素。 0057 再采用如下条件和方式制备获得水溶性粒毛盘菌黑色素 ： 参考专利号 ZL201210218401.5 公开的将粒毛盘菌胞外黑色素改性为水溶性黑色素的方法， 将上述制得 的粒毛盘菌胞内黑色素与组氨酸， 和水， 按质量比为 1:1:10 混合， 震荡至黑色素固体溶解 后， 将溶液于截留分子量为 200Da 的透析袋透析 48h， 冷冻干燥后获得水溶性粒毛盘菌黑色 素。 对其进行复溶实验， 室温下其在蒸馏水中的溶解度为4.69。
37、g/100g， 与实施例1中水溶性 黑色素溶解度相当。 0058 然后将上述粒毛盘菌胞内黑色素及其水溶性黑色素用质量百分浓度为 0.9% 的生 理盐水配置成 50mg/mL、 100mg/mL、 200mg/mL 的水溶液， 给药体积为 0.25mL/ 只。 0059 将上述各剂量的粒毛盘菌胞内黑色素及其水溶性黑色素进行小鼠抗肿瘤的作用 药理实验， 所采用的方式步骤和其他条件均与实施例1中相同， 也都得到了与实施例1中类 似的结果。 0060 上述实施例的实验说明， 菌种保藏编号为 CCTCC No:M2011054 的粒毛盘菌胞内黑 色素及其水溶性黑色素不仅具有显著的抑制肝癌功能， 且无毒副作用， 其制备方法简单经 济， 故可将菌种保藏编号为CCTCC No:M2011054的粒毛盘菌胞内黑色素及其水溶性黑色素， 按药剂学的常规制备方法， 将有效量的水溶性粒毛盘菌黑色素与适量的药用辅料混合加工 制备成口服片剂或胶囊剂型的抑制肝癌药物。 说 明 书 CN 103720722 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103720722 A 11 。