技术领域
本发明属于抗肿瘤药物的制备技术领域，特别涉及二棕榈酰磷脂酸在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
近年来，全世界肿瘤疾病的发生率呈不断上升趋势，据世界卫生组织（WHO）统计数据显示，2007年，新确诊的肿瘤病人已达1200多万人，恶性肿瘤（癌症）已是导致人类死亡的主要病症之一。其中肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和乳腺癌已居于前5位。据美国癌症协会统计，2007年全球有760万人死于恶性肿瘤，新发病例1,230万，现患病例近4,500万。2010年全球超过800万人死于癌症，取代心血管病成为世界死亡人数最多的疾病。据世界卫生组织报道，美国、中国、印度、巴西和俄罗斯等国已成为世界五大肿瘤疾病高发国。美国人的癌症发病率居世界之首，中国癌症发病率居美国之后成为世界第二肿瘤高发国。印度和巴西近几年来恶性肿瘤疾病发病率也在不断攀升中。预计到2020年，中国新发病例将达到349万，因恶性肿瘤而死亡的人数将达263万。2020年发病和死亡人数将比2002年上升60%。
肿瘤的侵袭、转移是肿瘤治疗失败的主要因素。肿瘤的生长、侵袭和转移都需要新生血管的生成，肿瘤内存在大量的新生血管，肿瘤依靠血管获取营养物质和氧气，促进肿瘤生长和血行转移。可以看出，肿瘤的血管生成对原发肿瘤的生长和增殖是必不可少的，同时对肿瘤的侵袭、转移亦起着重要作用。肿瘤血管新生取决于生长因子对内皮细胞功能的调控，在肿瘤释放的趋化因子和生长因子的作用下，毛细血管的内皮细胞发生迁移、增殖及管腔出现，形成新的血管。迄今为止，临床上治疗肿瘤的手段主要是通过手术、放化疗联合治疗，但是在抗肿瘤血管生成以及抗肿瘤血行转移方面治疗不理想。以肿瘤血管生成作为靶点对肿瘤进行生物治疗药物的开发将对肿瘤的治疗开拓新的方向。
早在70 年代初期，Folkman首先提出控制肿瘤生长的新途径——抗血管生成。肿瘤的血管形成对原发肿瘤的增殖及肿瘤的侵袭、转移亦起着重要作用，因此，以肿瘤血管生成为靶点开发血管生成抑制药，在抗肿瘤研究中已成为一个新的十分活跃的研究领域。分子靶向药物进入肿瘤治疗领域已经有10年历史，目前，已经有一些针对抗血管内皮生长因子（VEGF）及其受体和表皮生长因子及其受体（EGFR）的靶向治疗药物进入临床试验阶段，如舒尼替尼（Sunitinib）、马立马司他（Marimastat）、TNP-470均可以抑制血管形成，并且在临床试验中均显示出对多重肿瘤（肾癌、胃肠间质瘤、乳腺癌、肝癌、结肠癌、非小细胞肺癌等）的显著抑制作用。由于抗肿瘤血管生成不会对人体正常细胞造成非特异的杀伤，但是可以抑制肿瘤吸收营养物质维持其生长和转移，因此已成为当今国际上抗肿瘤研究的热点之一。相信对肿瘤血管生成的靶向治疗会成为临床上治疗肿瘤的新突破。
虽然目前已有部分靶向血管生成的药物已经进入临床试验，对肿瘤的治疗也取得了很好的治疗效果。但是它们均有各自的局限性，如手足皮肤反应、心血管毒性、肾毒性等副作用，存在增加致死性不良事件的风险。最常见的致死性不良事件为出血、心肌梗死、肝衰竭、高血压和蛋白尿等。所以，寻找新的、作用强大的、可以降低或减少对机体副作用的肿瘤血管抑制剂，将为临床肿瘤治疗提供新的治疗途径和希望。
发明内容
本发明的目的在于提供二棕榈酰磷脂酸在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
二棕榈酰磷脂酸在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的，所述肿瘤为乳腺癌或黑色素瘤肿瘤。
二棕榈酰磷脂酸在制备抗肿瘤血管形成药物中的应用。优选的，所述肿瘤为乳腺癌或黑色素瘤肿瘤。
二棕榈酰磷脂酸与药物上可接受的载体和/或稀释剂组成的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
二棕榈酰磷脂酸与药物上可接受的载体和/或稀释剂组成的组合物在制备抗肿瘤血管形成药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明首次将二棕榈酰磷脂酸用于制备抗肿瘤药物，通过实验证明二棕榈酰磷脂酸可抑制4T1皮下移植瘤、MMTV-PyMT自发乳腺癌及黑色素瘤肿瘤的生长，进一步研究证明其通过抑制血管形成而抑制了肿瘤的生长，因此，二棕榈酰磷脂酸是一种具有开发前景的抗肿瘤药物。由于二棕榈酰磷脂酸为机体自身存在的磷脂酰胆碱的代谢产物，对人体无毒副作用，保证了其临床治疗肿瘤的安全性。
附图说明
图1为 4T1皮下移植瘤治疗后的观察结果。
图2为MMTV-PyMT小鼠自发乳腺癌治疗后的观察结果。
图3为4T1皮下移植瘤治疗后的微血管密度观察结果。
图4为药物处理鸡胚绒毛尿囊膜模型后的观察结果。
图5为药物处理鸡胚卵黄囊膜模型后的观察结果。
图6为B16黑色素瘤皮下移植瘤治疗后的观察结果。
具体实施方式
在肿瘤的发生过程中，肿瘤血管生成对原发肿瘤的生长和增殖必不可少，同时对肿瘤的侵袭、转移亦起着重要作用。目前，以肿瘤血管生成为靶点开发血管生成抑制药在抗肿瘤研究中已成为一个新的十分活跃的研究领域。血管生成抑制药通过抑制、阻断肿瘤新生血管形成从而阻止肿瘤的生长、转移甚至导致肿瘤细胞的凋亡达到治疗肿瘤的目的。
二棕榈酰磷脂酸（DPPA）为磷脂酰胆碱的代谢产物，在机体内普遍存在，其主要介导PKC（protein kinase C）信号转导通路，参与细胞生长、增殖等过程的调控。迄今为止尚无报道指出磷脂酰胆碱代谢产物与肿瘤具有相关性。发明人在研究过程中发现DPPA可抑制4T1皮下移植瘤的生长，并可以抑制MMTV-PyMT自发乳腺癌的生长。进一步研究发现，DPPA是通过抑制血管形成而抑制了肿瘤的生长。由于DPPA为机体自身存在的代谢产物，对人体无毒副作用，为临床治疗肿瘤的安全性提供了保证。
下面结合具体的实施例进一步阐述本发明内容。
实施例1
1、皮下移植瘤模型的建立及治疗
BALB/C小鼠，28只，雌性，6-8周龄。取对数生长期4T1乳腺癌细胞，2.5g/L胰酶消化后用无血清培养液重悬收集细胞，无菌生理盐水调整细胞密度。经台盼蓝染色，确定活细胞数在95%以上，于每只小鼠右上肢腋下皮下接种1×105个（0.2ml）细胞。将接种小鼠随即分为两组（DPPA实验组和DMSO对照组）。DPPA（EnZo）或DMSO（Sigma-Aldrich）用量为60μg/20g（每20g体重用60μg的DPPA或DMSO）小鼠。各组实验动物均以尾静脉注射方式给药，每天一次，治疗两周。每次治疗前观察肿瘤体积并做记录。
2、MMTV-PyMT小鼠自发乳腺癌的治疗
MMTV-PyMT小鼠（The Jackson Laboratory），6只，雌性，9周龄，随即分为两组（DPPA实验组和DMSO对照组），3只/组。DPPA或DMSO用量为60μg/20g小鼠。各组实验动物均以尾静脉注射方式给药。隔天治疗，治疗两周。
3、细胞增殖检测
1）随机选取步骤1、2中治疗后的小鼠，每组小鼠各3只。
2）用脱臼法处死小鼠，取没有坏死区域的肿瘤组织，制成石蜡组织切片。
① 固定：4%多聚甲醛固定液中固定24小时；
② 脱水：固定后的组织经过蒸馏水及70%乙醇清洗后进入脱水步骤，脱水过程使用梯度浓度酒精：70%—80%—90%—95%—无水乙醇1—无水乙醇2，其中70%至90%乙醇中放置30分钟，其余步骤均放置1小时。
③透明：二甲苯1放置1小时，二甲苯2放置1小时。
④浸蜡：准备两个蜡缸分别盛放低熔点石蜡及高熔点石蜡，预先放入65℃烘箱熔化。透明后的组织分别放入低熔点石蜡1小时，高熔点石蜡1小时。
⑤包埋：预先在自动包埋机熔化高熔点蜡，并保持其熔化状态，将浸蜡后的组织调整到切片需要的状态放入包埋盒，倒入高熔点蜡并置于冰上或室温等待其冷却凝固。
⑥切片：先将展片池的水温调节为42℃并在冰箱预冷蜡块，修片至需要的截面后将切片厚度调节为4μm开始切片。得到到切片放入展片池以除去皱褶，展片完成后用预先涂有APES的载玻片捞取组织，放置于60℃烘箱4小时或者37℃烘箱过夜烤干后4℃保存。
3）每个标本随机提取一张组织切片进行PCNA特异性免疫染色：
①组织切片脱蜡及重新水化：将载玻片按次序放置于二甲苯1－二甲苯2－1/2二甲苯：乙醇－100％乙醇－95％乙醇－85％乙醇－75％乙醇中浸泡各10min。最后放置于双蒸水中振荡30s。
②将组织切片放入3％H2O-甲醇溶液（提前预热30min）中，37℃，30min。
③从3％H2O-甲醇溶液中取出切片，PBS洗三次，每次5min。
④胃蛋白酶修复：将玻片上的溶液擦干，于组织上加上0.4%胃蛋白酶，37℃，30min。
⑤PBS洗三次，每次5min。将玻片上的溶液擦干，于组织上加上10％BSA，以盖住组织为准，放置于封闭盒中，盒中放入适量双蒸水，37℃，1hr。
⑥用微量移液器将10％BSA直接吸掉，加上一抗PCNA（中衫金桥），置于4℃，过夜。
⑦将组织切片从封闭盒中拿出，PBS 洗三次，每次5min。擦干，于组织上加上二抗goat-anti-mouse IgG（中衫金桥），置于封闭盒中，37℃，40min。
⑧从封闭盒中拿出玻片，PBS洗三次，每次5min。
⑨DAB显色，苏木素复染：擦干，于组织上加上DAB Substrate Kit溶液（现用现配），室温静置约5min，放置于水中停止反应。苏木素染色40s，用流水洗去染色剂，小心不要冲掉组织。
⑩脱水、封片。
4、肿瘤体积、肿瘤重量检测
将上述步骤1、2中治疗后的实验小鼠肿瘤剥离，用电子天平称重获得肿瘤重量。同时，用卡尺对肿瘤的长径（L）及短径(W)进行测量，通过公式（L×W2）×0.5236计算肿瘤体积。
通过建立4T1 乳腺癌皮下移植瘤模型，用DPPA治疗后，测量肿瘤的体积、肿瘤重量，检测肿瘤体积内细胞增殖情况，探讨DPPA对肿瘤生长的作用，同时研究了MMTV-PyMT小鼠自发乳腺癌的DPPA治疗效果。结果分析，所有数据采用SPSS 16.0统计分析包和Sigmaplot软件处理，比较各组间是否有显著性差异。
图1为4T1皮下移植瘤治疗后的观察结果：A为不同浓度DPPA药物对4T1乳腺癌细胞活性的影响；B、C显示了用药后肿瘤体积、肿瘤重量的检测结果；D为PCNA观察结果；E为肿瘤细胞增殖指数统计结果。
图2为MMTV-PyMT小鼠自发乳腺癌治疗后的观察结果：A、B显示了用药后肿瘤体积、肿瘤重量的检测结果；C为PCNA观察结果；D为肿瘤细胞增殖指数统计结果。
图1和图2结果显示，与DMSO对照组相比较，DPPA显著抑制了4T1皮下移植瘤及MMTV-PyMT小鼠肿瘤重量、肿瘤体积以及肿瘤细胞的增殖指数。以上结果说明DPPA可以作为抗肿瘤药物抑制肿瘤的生长。
5、CD31免疫组化分析
1）组织切片的制备
随机选取实施例1步骤1中治疗后的实验小鼠，每组小鼠各9只。用脱臼法处死小鼠，取没有坏死区域的肿瘤组织，按实施例1步骤3中所述方法制成石蜡组织切片。
2）组织切片脱蜡及重新水化：将载玻片按次序放置于二甲苯1－二甲苯2－1/2二甲苯：乙醇－100％乙醇－95％乙醇－85％乙醇－75％乙醇中浸泡各10min。最后放置于双蒸水中振荡30s。
①将组织切片放入3％H2O-甲醇溶液（提前预热30min）中，37℃，30min。
②从3％H2O-甲醇溶液中取出切片，PBS洗三次，每次5min。
③高压热修复：10分钟。
④PBS洗三次，每次5min。将玻片上的溶液擦干，于组织上加上10％BSA，以盖住组织为准，放置于封闭盒中，盒中放入适量双蒸水，37℃，1hr。
⑤用微量移液器将10％BSA直接吸掉，加上一抗CD31（北京中衫金桥），置于4℃，过夜。
⑥将组织切片从封闭盒中拿出，PBS洗三次，每次5min。擦干，于组织上加上二抗goat-anti-mouse IgG（中衫金桥），置于封闭盒中，37℃，40min。
⑦从封闭盒中拿出玻片，PBS洗三次，每次5min。
⑧DAB显色，苏木素复染。取出经脱水处理后封片。观察DPPA对肿瘤新生血管的影响。
结果如图3所示，DPPA治疗的4T1皮下移植瘤小鼠肿瘤中的CD31阳性血管数减少，DPPA抑制了4T1乳腺癌皮下移植瘤的微血管密度（MVD），说明DPPA可以抑制肿瘤新生血管的数目。
实施例2
1、鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型的建立及药物处理
1）鸡胚处理：将购买的9天鸡胚表面清洁，1∶1 000新洁尔灭液擦拭，拭干后将鸡胚气室向上，长轴与蛋托呈45°放入普通培养箱中孵化，设定温度(37.8 ±0.5)℃和相对湿度60%，每天照蛋转蛋3次。
2）开窗：孵育第9天，在照蛋器下标记气室，确定开窗位置，用75%酒精消毒后，用慢速牙科钻在气室标记处钻一个1mm3大小的小孔，用眼科弯镊小心揭去蛋壳，形成直径约为1cm的缺口，用眼科镊轻轻揭掉蛋膜暴露鸡胚绒毛尿囊膜。
3）实验分组及加药：开窗后将鸡胚随机分为两组（DPPA实验组和DMSO对照组）。每组8只鸡胚。实验组加待测药物DPPA，对照组加相同剂量的对照液DMSO。将DPPA或DMSO（50μg/mL）从开口处小心加到尿囊膜上，医用胶布封口，放入37.8℃，50％～60％湿度的恒温箱中孵育48小时。
4）结果观察：加药48小时后，将蛋壳从中线剪开，流净蛋中内容物，肉眼直接观察开窗孔一侧尿囊膜上血管的变化，记录现象，并在体式显微镜下照相观察，统计血管发育情况。
观察指标：以给药点为中心，主干血管向中心盘的弯曲和靠近称之为血管的吸引；周围血管放射状朝向中心的生长状态，称为血管辐辏。反之，无此向心生长情况，且比正常发育情况下的血管网密度小，血管细且数量显著减少，出现明显的无血管区域则存在待定的血管生长发育抑制作用。
结果如图4所示，左图为用0.1%DMSO处理的对照组，右图为用DPPA 50μg/mL处理的实验组的结果。如图所示，DPPA处理的鸡胚绒毛尿囊膜的血管变细，并且二级及三级血管分支变少。可见，DPPA抑制了9天鸡胚CAM的血管形成。
2、鸡胚卵黄囊膜（YSM）模型的建立及药物处理
1）种蛋处理：将种蛋表面清洁，1:1 000新洁尔灭液浸泡3min，拭干后将鸡胚气室向上，长轴与蛋托呈45°放入普通培养箱中孵化，设定温度(37.8 ±0.5)℃和相对湿度60%，每天照蛋转蛋3次。
2）实验方法：取孵化2.5天的鸡胚，将鸡卵内容物倾倒入无菌平皿中，将红色和黑色记号笔标记的两个同样大小的硅胶环放置到鸡胚卵黄囊血管网上血管较少的不同位置，盖好平皿盖(不需封闭)，放入37-38℃孵育箱中继续孵育3-4h。3-4h后，挑选硅胶环未见移位、卵黄囊膜完整、血管网及胚盘发育良好的鸡胚，红色标记的硅胶环中加入待测药物DPPA（50μg/mL），黑色标记的胶圈加入相同剂量的对照液DMSO作为自身对照，然后继续孵育。
结果观察：于加药后0h、12h、24h分别在体式显微镜下拍照，观察胶圈内和周围的YSM血管密度、走向。采用Image-ProPlus6.0图像分析系统分析拍摄实验区域整个硅胶圈内的血管，以血管面积和血管密度的变化作为分析指标。
加药后12h的观察结果如图5所示，A左侧为用0.1%DMSO处理的自身对照，右侧为用DPPA （50μg/mL）处理后的结果；B为对血管密度增长率和血管面积增长率的统计。*P＜0.05；**P＜0.01。可见，DPPA抑制了3天鸡胚YSM的血管生成。
实施例3
1、皮下移植瘤模型的建立及治疗
C57BL/6J小鼠，60只，雌性，6-8周龄。取对数生长期B16细胞，2.5g/L胰酶消化后用无血清培养液重悬收集细胞，无菌生理盐水调整细胞密度。经台盼蓝染色，确定活细胞数在95%以上，于每只小鼠右上肢腋下皮下接种1×105个细胞。将接种小鼠随机分为两组（DPPA实验组和DMSO对照组）。DPPA或DMSO用量为500μg/20g治疗小鼠。各组实验动物均以尾静脉注射方式给药，每天一次，直到肿瘤体积达到2cm3停止治疗。每次治疗前观察肿瘤体积并做记录。
2、细胞增殖检测
1）随机选取治疗后的实验小鼠。
2）用脱臼法处死小鼠，取没有坏死区域的肿瘤组织，按实施例1步骤3所述方法制成石蜡组织切片。
3）每个标本随机提取一张切片进行PCNA及CD31特异性免疫染色：
步骤同实施例1步骤3中的3），其中，步骤⑥添加的一抗为PCNA或CD31（北京中衫金桥）。
3、测量肿瘤体积、肿瘤重量。
4、结果观察
结果如图6所示，与DMSO对照组相比较DPPA显著抑制了B16皮下移植瘤小鼠肿瘤重量、肿瘤体积以及肿瘤细胞的增殖指数以及微血管密度。以上结果说明DPPA可以作为抗肿瘤药物抑制黑色素瘤肿瘤的生长及肿瘤新生血管的形成。