通过施加磁场而分布腔中的颗粒 【技术领域】
本发明涉及用于使多个顺磁颗粒在小体积液体中团聚 (cluster) 并随后均匀分 布的方法和装置。背景技术
将减小的尺寸并容纳磁或顺磁颗粒的微流体 (microfluidic) 系统用于分析应用 的用途是公知的， 并且磁或顺磁纳米颗粒和微颗粒已经成为数个研究技术领域的热点。功 能纳米颗粒和微颗粒 (“珠” ) 为化学接合提供了大的比表面， 并且与具有相同量的固体的 溶液相比， 聚合物胶体或微球溶液具有低的粘性， 这使其具有特殊的特性。由此， 这样的小 颗粒可被有利地用作用于生物鉴定 (bio-assay) 的 “可移动基板” 。然而， 磁珠最显著的优 点之一在于， 可以使用永磁体或电磁体磁探测和操纵颗粒， 而不依赖于通常的化学或生物 学过程。 像磁分离的一些经典应用已经延伸到对样品和试剂的消耗具有强限制的小型 流体或 “片上实验室” 系统 ； 在这样的系统中， 磁珠有效提供了具有大的表面对体积比率 (surface-to-volume ratio) 的化学活性基板。磁珠的小型应用的兴旺领域为未来的开发 提供了令人兴奋的可能性。其是高度的多学科领域， 需要来自在磁珠的制备中涉及的无机 化学、 通过允许其功能化的生物化学和医学科学、 以及当然地磁学和磁材料的基础物理学 的贡献。可以使用磁珠实现生物鉴定的几乎所有重要功能 ： 样品纯化、 为样品提供固体基 板、 混合、 标示 (labelling)、 操纵和输运以及最终的分离。
覆有标识 (label) 或俘获分子的磁或顺磁珠被广泛用于检测生物标记物和生物 分子， 并且基于磁颗粒的鉴定已经成为现代化学和生物学诊断的标准。通常使用目标分子 与用标识标记的特定受体 ( 例如， 抗体 ) 之间的生物分子识别来实现生物分子的检测。标 识可以为例如放射性同位素、 酶、 荧光分子或带电分子或其任何组合。近期， 磁珠还被用作 生物感测的标识。
通过使用产生磁场的装置来操纵这些磁和顺磁珠。磁场 ( 就极性而言 ) 相对于包 括顺磁材料的液体的定位通常使得磁场的各极被设置为直接垂直于包含颗粒的液体。 换言 之， 本领域公知的具有第一和第二异性磁极 (opposite poles) 的磁装置产生磁场， 该第一 和第二异性磁极被设置为使具有限定了在磁极之间延伸的极轴的第一和第二彼此间隔的 异性磁极的场产生装置的磁场作用于顺磁颗粒， 将场产生装置相对于液体设置为使极轴与 液体形成 90°的角。图 5A 示出了现有技术装置的实例。
然而， 当使用常规操纵技术来对包含顺磁或磁珠的小体积溶液进行磁操纵时， 已 经令人吃惊地观察到不令人满意的检测限制和在可比较的鉴定之间的显著标准偏差。 这导 致不令人满意的高 CV 值 ( 检测平均 / 标准偏差 )， 因此使用顺磁珠技术的小体积检测器装 置目前尚未被广泛认可为可靠的检测设备。
本发明的发明人旨在发现该观察到的不令人满意的高 CV 值 ( 检测平均 / 标准偏 差 ) 的起因。在这些调查期间， 观察到， 根据现有技术在流体环境中对磁颗粒的操纵会导致
数个物理限制。观察到连续地暴露到磁场的颗粒会粘在一起并积聚， 从而失去了其主要优 点中的几个优点 ： 例如， 与周围生物化学液体接触的颗粒的活性 / 涂覆表面急剧减小， 这严 重损害了鉴定性能。此外， 在颗粒积聚物之间俘获的分析物物种 (analyte species) 不会 适当地响应于鉴定检测装置 ( 颗粒屏蔽了来自其他颗粒的信号 )， 这进一步降低了信噪比。 在其中没有接合到目标分析物的磁或顺磁颗粒在应用检测装置之前被丢弃的特定的应用 中， 一些未被接合的磁或顺磁颗粒被捕获在积聚物中， 因而不能被去除。 这些不希望的效应 急剧增加了背景信号并减少了基于分析物的信号。因此， 观察到不令人满意的可再现性和 可靠性。
因此， 在现有技术中需要这样的改善的方法和装置， 其可以在检测小体积样品中 的分析物的存在和浓度时可以增加敏感度并减小标准偏差。
由此， 本发明的一个目的是提供一种可以在检测小体积样品中的分析物的存在和 浓度时增加敏感度并减小标准偏差的改善的方法和装置。
美国专利申请 2004/0265903 涉及用于分离悬浮在液体中的磁颗粒的系统。该系 统包括包含至少两个磁体的环形材料， 其中这两个磁体被设置为使磁体轴垂直于环面取 向。初始地， 容纳悬浮磁颗粒的反应容器被引入到该环形磁体装置中。由于磁场， 颗粒被沉 积在容器的内壁上。上层清液 (supernatent) 被去除并被清洗溶液替换几次。最后， 使容 器与磁装置分离， 并通过移动容器或引入液体而使沉积的颗粒泥饼 (cake) 重新悬浮。该方 法的一个缺点在于， 在磁场去除之后， 颗粒附着到容器壁。因此， 为了获得颗粒在液体中的 希望的分布， 附加的重新悬浮步骤是必需的。 这使得该方法在微流体装置中的使用复杂化。 同样， 该方法需要设置在彼此上方的至少两个环形磁体， 这增加了成本和系统复杂性。此 外， 美国专利申请 2004/0265903 中的磁装置的设置使磁场产生装置围绕含有磁颗粒的液 体。磁场产生装置的这种设置并不适合应用于根据本发明的微流体系统。
因此本发明的另一目的为提供一种用于使多个顺磁颗粒团聚并随后分布的简单 方法， 该方法可以容易地应用于微流体装置。 发明内容 令人吃惊地， 通过简单地改变施加到样品的磁场的方向， 即从其中磁极垂直于包 含颗粒的液体的情况改变到其中磁极基本上平行于包含颗粒的流体的情况， 可以解决本发 明的问题。磁场的磁极相对于顺磁颗粒的定位直到目前尚未被认为具有任何重要性。
相应地， 本发明涉及一种用于使多个顺磁颗粒在腔中的小体积液体中团聚并随后 分布的方法， 所述腔具有第一壁和相对的第二壁， 所述方法包括以下步骤 ：
a) 提供包含所述多个顺磁颗粒的液体 ；
b) 通过第一场产生装置对所述顺磁颗粒施加第一磁场， 所述第一场产生装置具 有第一和第二彼此间隔的异性磁极并限定了在所述磁极之间延伸的第一极轴， 所述场产生 装置被相对于所述第一壁设置， 以便所述第一极轴 (a1) 与所述第一壁形成小于 89°的角 (v1)， 所述角 (v1) 优选小于 60° ；
c) 使所述磁场沿具有所述第一极轴的方向的移动分量的第一移动方向移动， 或 者， 使所述磁场的极性改变一次或多次 ； 以及
d) 去除所述磁场。
此外， 本发明还涉及一种用于使多个顺磁颗粒在腔中团聚并随后分布的系统， 所 述系统包括腔装置以及磁装置， 所述腔装置具有第一壁和相对的第二壁， 所述第一壁和所 述第二壁限定被设置用于接收并容纳所述多个顺磁颗粒的腔， 并且所述磁装置包括 ： a) 接 收装置， 其用于接收所述腔装置， 并包括用于产生第一磁场的第一磁场产生装置， 所述第一 磁场产生装置具有第一和第二彼此间隔的异性磁极并限定了在所述磁极之间延伸的第一 极轴 (a1)， 所述第一场产生装置被相对于在所述接收装置中接收的所述腔装置的所述第一 壁设置， 以便对所述腔中的顺磁颗粒施加所述场并且所述第一极轴 (a1) 与在所述接收装置 中接收的所述腔装置的所述第一壁形成小于 60°的角 (v1)， 并且还包括用于改变所述磁场 的装置。
此外， 本发明涉及一种用于检测在包括小于 200μl 液体的样品中是否存在目标 分析物的方法， 包括以下步骤 ： (a) 提供这样的液体， 该液体包含分析物和能够接合并固 定 (immobilize) 所述分析物的多个顺磁颗粒 ； (b) 通过第一场产生装置对包含被固定的 分析物的所述顺磁颗粒施加第一磁场， 所述第一场产生装置具有第一和第二彼此间隔的 异性磁极并限定了在所述磁极之间延伸的第一极轴， 所述场产生装置被相对于所述第一 壁设置， 以便所述第一极轴 (a 1) 与所述第一壁形成小于 60°的角 (v1) ； (c) 使所述磁场沿 具有所述第一极轴的方向的移动分量的第一移动方向移动， 或者， 使所述磁场的极性反转 (reverse) ； 以及 (d) 可选地， 将所述顺磁颗粒移动到包括清洗和 / 或检测液体的分离腔， 或 者， 用清洗和 / 或检测液体置换所述腔中的残留液体 ； (e) 去除所述磁场 ； 以及 (f) 检测所 述分析物。 附图说明 下面参考附图详细解释本发明， 其中 ：
图 1 公开了根据本发明的系统的腔装置的实施例的透视图， 为了示例的目的， 盖 被去除 ；
图 2 为如图 1 所示的腔装置的示意性表示 ；
图 3 为腔装置的腔的放大的示意性截面图 ；
图 4 为根据本发明的系统的实施例的示意图 ； 以及
图 5 示意性示例了与现有技术的主要原理相比的本发明的主要原理。
具体实施方式
图 1 和图 2 中示出的腔装置 (9) 包括具有第一部分 (3) 和第二部分 (5， 6) 的微流 体通道。第一部分 (3) 是被形成为毛细通道的腔并且是在实施根据本发明的方法时被施加 磁场的腔。然而， 同样可以对第二部分 (5， 6) 施加磁场。顺磁颗粒可以在引入液体之前存 在于第一部分中， 或者可以随液体引入。
腔装置还包括施加区域 (1) 和分离腔 (2)， 施加区域 (1) 用于对毛细通道施加包括 分析物 ( 例如， 血液 ) 的液体， 并且， 在分离腔 (2) 中， 该液体被分离为滞留物和包含分析物 的液体。分离腔 (2) 在该具体实施例中通过过滤器和物理阻挡物 (10) 而被连接到毛细通 道 (3)， 物理阻挡物 (10) 可被形成为台阶 (10a) 或斜坡 / 斜面 (10b)。
收集腔 (4a) 被形成在毛细通道 (3) 与微流体通道的第二部分之间。第二部分包括清洗腔 (5) 和检测腔 (6)， 在清洗腔 (5) 中在顺磁颗粒与分析物在腔 (3) 中接合之后清洗 顺磁颗粒， 而在检测腔 (6) 中通过检测窗口 (14) 进行检测。在微流体系统的这些部分中也 可以使用本发明的方法以避免颗粒的积聚。 可以将清洗和检测溶液供给到微流体通道的第 二部分 (5， 6)。在毛细通道 (3) 与微流体通道的第二部分 (5， 6) 之间设置废物出口 (4b)。
如图 3 所示， 通过第一壁 (12) 和相对的第二壁 (13) 限定毛细通道 (3)， 并且毛细 通道容纳多个顺磁颗粒 (7)。
参考图 4， 根据本发明的用于使多个顺磁颗粒团聚并随后分布的系统包括上述腔 装置 (9) 和磁装置 (15)。
磁装置 (15) 包括接收装置， 该接收装置用于接收腔装置 (9) 并由载物片 (slide) (17) 中的凹槽 (16) 形成， 该凹槽 (16) 具有基本上对应于腔装置 (9) 的轮廓。腔装置 (9) 被置于该凹槽中， 其中第二壁 (13) 面向凹槽 (16) 的底部。
如图 4 所示， 载物片 (17) 通过轴 / 螺母装置 (18) 可沿与腔装置的微流体通道 (3， 5， 6) 的纵向方向平行地水平移动。轴 / 螺母装置包括两个彼此间隔的支撑部 (19) 和连接 到载物片 (17) 的螺母 (20)， 支撑部 (19) 支撑并通过未示出的导引器 (guide) 纵向地导引 载物片。轴 (21) 延伸穿过支撑部 (19) 中的支座 (bearing)(19) 并穿过螺母 (20)。可以通 过马达 (22) 来驱动轴 (21) 旋转以使载物片 (17) 沿通过箭头示出的第一方向和相反方向 (M) 水平移动。 如稍后将解释的， 轴 / 螺母装置提供了用于改变第一磁场的装置。
磁装置还包括第一磁场产生装置， 在示出的实施例中， 该第一磁场产生装置由限 定了第一极轴 (P1) 的具有第一和第二间隔的异性磁极 N1 和 S1 的第一永磁体 (23) 形成。
磁体 (23) 具有相对于载物片 (17) 固定的位置， 并针对在载物片 (17) 的凹槽 (16) 中接收的腔装置 (9) 而将磁体 (23) 设置为使至少容纳在毛细通道 (3) 中的顺磁颗粒 (7) 经受第一磁体 (23) 的磁场 ( 在被施加时 )。在示出的实施例中， 第一极轴与腔装置 (9) 的 微流体通道的纵向方向基本上平行。 不必需使极轴或场的移动平行于用于装置功能的毛细 通道。然而， 磁场必须能够使容纳在毛细通道中的顺磁颗粒沿腔装置 (9) 的微流体通道的 纵向方向移动。
用于改变磁场的装置还可被用作去除磁场的装置， 当颗粒不能跟随磁场的快速移 动时， 颗粒于是因重力而从第一壁掉落。或者， 在电磁体的情况下， 可以通过切断电源来实 现磁场的去除。
如图 4 所示， 磁装置 (15) 附加地包括第二磁场产生装置， 在示出的实施例中， 通过 具有第一和第二间隔的异性磁极 N2 和 S2 并限定了在磁极之间延伸的第二极轴 P2 的第二 永磁体 (24) 而形成第二磁场产生装置。
在示出的实施例中， 第二磁体 (24) 被设置为， 使第二极轴垂直于腔装置的微流体 通道的纵向方向， 并且在施加时第二磁体的磁场施加到至少容纳在毛细通道中的顺磁颗粒 (7)。
优选地， 每次仅仅磁体 (23， 24) 中的一个磁体起作用。在备选实施例中， 当应用第 一磁体 (23) 时， 磁拖曳力 (magnetic drag force) 优选强于第二磁体 (24)。磁体 (24) 也 可被设置为与磁体 (23) 一样， 即， 具有根据本发明定向的磁极。
参考图 5， 该附图示例了与现有技术情况 (A) 相比的本发明的原理 (B)， 在本发明
中， 磁场的极轴 (26) 基本上平行于腔装置的第一壁， 而在现有技术中， 磁场的极轴基本上 垂直于腔装置的第一壁。
磁场产生装置 (25) 具有彼此间隔的异性的第一磁极 (N) 和第二磁极 (S)， 限定了 在磁极之间延伸的第一极轴 (26)， 该磁场产生装置被相对于第一壁设置为使第一极轴 (a1) 与第一壁 (12) 形成小于 60°的角 (v1)。(13) 示例了相对的第二壁 (13)， 以及 (7) 示例了 多个顺磁颗粒。
当通过磁场产生装置将磁场施加到所述通道的至少一部分时， 顺磁颗粒被吸引到 腔的第一内表面， 由此形成颗粒的团簇 (cluster)。 当使磁场产生装置相对于腔纵向 ( 如箭 头所示 ) 移动时， (A) 中的颗粒的团簇不会使磁极性偏移 (shift)( 如半圆箭头所示 ) 并被 释放为颗粒的行 / 团簇。不希望受理论的束缚， 认为在 (B) 中， 颗粒会使磁极性偏移并被释 放为较小的团簇和 / 或单独的颗粒并通过重力而均匀分布在第二壁 (13) 上。至少实践已 表明， 在 (B) 中， 颗粒被释放为小团簇和 / 或单独的颗粒， 如实例 1 中获得的结果所示。
定义
在本发明的上下文中， “顺磁颗粒” 表示这样的颗粒， 其在存在外部施加的磁场的 情况下是磁性的， 但在经受磁场之前不是磁性的。根据本发明的顺磁颗粒能够接合和固定 所关注的特定分析物物种 ( 例如， 通过被受体或抗体涂覆 )。 在本发明的上下文中， “均匀分布” 表示这样的分布， 其中， 颗粒团簇中的大多数颗 粒首要地 ( 优选 ) 被释放为单独的颗粒， 其次被释放成较小的团簇， 这些单独的颗粒和较小 的团簇在毛细通道的给定区域内基本上均匀地分隔。
在本发明的上下文中， “毛细通道” 表示流体可以通过的窄管道或通道。优选地， 根 据本发明的毛细通道的直径 ( 或宽度 ) 小于 10mm。更优选地， 根据本发明的毛细通道的直 径小于 5mm， 例如小于 4mm， 或小于 3mm， 或甚至小于 2mm。在最优选的实施例中， 毛细通道具 有 1mm 或更小的直径， 例如， 0.2-1.0mm。通道还可以被形成为非圆形形状， 例如， 矩形或三 角形， 在该情况下， “直径” 是指从通道的中心到周边的平均距离。
本发明的公开
本发明的目的为开发一种用于定量地检测在小液体样品中是否存在目标分析物 的系统和方法， 其中改善了给定的鉴定的准确度和精确度， 对于小量的分析物尤其如此， 并 且其中降低或消除了非特定背景信号， 并且其中增加了来自分析物的信号。
令人吃惊地， 发现磁场的磁极的相对于顺磁材料的移动方向的定位极为重要。相 应地， 发现这样的磁场设置可以提供信号强度的显著改善并减小背景， 该磁场的磁极具有 第一和第二彼此间隔的异性磁极并限定了在磁极之间延伸的第一极轴， 该设置使得场产生 装置被相对于包括顺磁颗粒的腔的第一壁设置为使第一极轴 (a1) 与容器的第一壁形成小 于 60°的角 (v1)。此外， 发现本发明的磁场设置导致鉴定的显著提高的再现性。
本发明的发明人的发现是特别令人吃惊的， 这是由于通常认为在没有外部施加 的磁场时顺磁材料不会保持任何实质磁化， 因为没有磁场时热运动使自旋变为随机定向。 由此， 在所施加的磁场被去除时， 总磁化在理论上将降低到零。此外， 顺磁颗粒遵循居里 (Curie) 型定律， 但却异常地具有大的居里常数值。由此， 通常认为顺磁颗粒不是磁性的并 且在无磁场的情况下不会团聚。
然而， 不希望受理论的束缚， 相信根据本发明所解决的问题的起因在于， 当被置于
磁场中时， 顺磁颗粒实际上通过磁偶极子相互作用获得了足以启动各颗粒之间的相互作用 的磁矩， 并且通过去除磁场不能简单地去除该偶极子相互作用。该相互作用会将颗粒的自 发团聚诱导为更大的、 通常为复杂的结构和积聚物， 这再次导致了鉴定的信号和再现性的 降低。
通过以特定的组 (constellation) 来组合微流体和磁颗粒， 本发明的发明人发 现， 可以实现关键参数并同时将该组应用于能够分析小于 200μl 的样品的相对小的手持 设备 ( 小于 500 克 ) 中。
因此， 本发明在一个实施例中涉及一种用于使多个顺磁颗粒在腔中的小体积液体 中团聚并随后分布的方法， 所述腔具有第一壁和相对的第二壁， 所述方法包括以下步骤 ：
a) 提供包含所述多个顺磁颗粒的液体 ；
b) 通过第一场产生装置对所述顺磁颗粒施加第一磁场， 所述第一场产生装置具 有第一和第二彼此间隔的异性磁极并限定了在所述磁极之间延伸的第一极轴， 所述场产生 装置被相对于所述第一壁设置， 以便所述第一极轴 (a1) 与所述第一壁形成小于 60°的角 (v1) ；
c) 使所述磁场沿具有所述第一极轴的方向的移动分量的第一移动方向移动， 或 者， 使所述磁场的极性改变一次或多次 ； 以及
d) 去除所述磁场。
当顺磁材料已经与包含特定分析物的液体接触时， 以及当该分析物已被固定在顺 磁颗粒的表面上 ( 例如通过使用在顺磁颗粒的表面上涂覆的受主和抗体 ) 时， 通常需要一 个或多个附加的操纵步骤。由此， 对小体积样品中的顺磁颗粒的操纵通常需要几个处理步 骤， 例如， 一个或多个用于样品施加以及在颗粒与包含该特定分析物的样品之间的接触的 步骤， 一个或多个清洗步骤， 以及一个或多个用于施加用于检测目的的其他液体的步骤。 在 这些液体处理步骤中的每个处理步骤期间， 高度优选颗粒不发生积聚， 因为这可能会导致 鉴定的强度和再现性的损失。
因此， 在根据本发明的一个优选实施例中， 步骤 a) 到步骤 d) 被重复一次或多次。 优选地， 后续液体的引入导致本发明步骤的重复。
进一步观察到， 磁场沿极轴方向的一次或多次的往复运动导致改善的结果。相应 地， 在根据本发明的一个优选实施例中， 该方法包括在步骤 c) 之后并在步骤 d) 之前的步骤 c1)， 该步骤 c1) 为， 使磁场沿具有第一极轴 (a1) 的相反方向的移动分量的相反移动方向移 动。优选地， 重复步骤 c) 和 c1) 一次或多次。备选地， 使磁场的极性改变一次或多次同样 可以提供所需的效果。
根据本发明的第一磁场的设置是本发明的基本实施例， 其中， 极轴与液体之间的 角 (v1) 不能为 90°。 然而， 理论上， 小于 89°的角便足以至少获得顺磁颗粒的积聚的减少。 然而， 在实践中， 优选小于 60°的角以获得显著优于现有技术的效果。由此， 在一个实施例 中， 本发明涉及上述的方法， 其中第一场产生装置被相对于第一壁设置为使第一极轴与第 一壁之间的角 (v1) 在 0°与 60°之间。
在一个实施例中， 第一场产生装置被相对于第一壁设置为使第一极轴与第一壁之 间的角 (v1) 在 0°与 50°之间。
在一个实施例中， 第一场产生装置被相对于第一壁设置为使第一极轴与第一壁之间的角 (v1) 在 0°与 40°之间。
在一个实施例中， 第一场产生装置被相对于第一壁设置为使第一极轴与第一壁之 间的角 (v1) 在 0°与 20°之间。
在一个实施例中， 第一场产生装置被相对于第一壁设置为使第一极轴与第一壁之 间的角 (v1) 在 0°与 10°之间。
在一个实施例中， 第一场产生装置被相对于第一壁设置为使第一极轴与第一壁之 间的角 (v1) 为 0°。
磁场产生装置可以为永磁体或电磁体。 磁场产生装置可以为在磁场的施加和移动 期间可以切换极轴的旋转永磁体或电磁体。
磁场必须被移动为使磁颗粒沿装置的第一壁移动。备选地， 使磁场的极性改变一 次或多次可以启动颗粒的旋转。 对于装置的功能而言， 不必需使极轴或场的移动平行于腔。 然而， 磁场必须能够使容纳在毛细通道中的顺磁颗粒沿腔装置的微流体通道的纵向方向移 动。由此， 在根据本发明的方法的优选实施例中， 第一移动方向基本上沿第一极轴 a1 的方 向。此外， 还优选使移动反向。由此， 在根据本发明的方法的优选实施例中， 使移动反向， 其 中该反向移动方向基本上沿第一极轴 a1 的相反方向。 在优选实施例中， 第一磁场产生装置被设置为不围绕第一壁和相对的第二壁。由 此， 可以避免通过由第一磁场产生装置施加的磁力而使磁颗粒团聚在第二壁上。如果团聚 在第二壁上， 当去除磁力时， 将仅仅出现最小的颗粒再分布， 这转而会降低所产生的信号的 质量和数量。 发现在去除第一磁场产生装置之后的磁颗粒的再分布提高了所产生的信号的 强度和可靠性。在一个实施例中， 通过重力实现磁颗粒从第一壁到第二壁的再分布。在另 一实施例中， 使用第二场产生装置。这构成了本发明的方法的主要优点， 特别地， 相对于先 前已知的围绕整个腔的环形磁体而言。
在优选实施例中， 第一磁场产生装置被设置为使磁颗粒被吸引到第一壁并从相对 的第二壁转移 (detract)。在优选实施例中， 第一磁场产生装置被设置为与第一壁直接接 触。在优选实施例中， 第一磁场产生装置被设置为与第一壁直接接触而不与第二壁直接接 触。
在本发明的一个特定实施例中， 腔被形成为在例如 WO06134546A 中描述的腔， 并 包括容纳多个顺磁颗粒的空间、 用于产生磁场的磁场产生装置和用于产生相反磁场的相反 磁场产生装置。
在该特定实施例中， 本发明涉及这样的根据上述的方法， 其包括在步骤 d) 之后的 步骤 e)， 该步骤 e) 为， 通过具有第一和第二彼此间隔的异性磁极并限定了在磁极之间延伸 的第二极轴 a2 的第二磁场产生装置对顺磁颗粒施加第二磁场， 第二磁场产生装置被相对于 第二壁设置为将顺磁颗粒吸引到第二壁。 第一和第二场产生装置的组合可以有利地被用于 促进在因第一磁场而团聚之后的颗粒的再分布。通过将颗粒吸引到相对的第二壁， 可以由 此通过第二场产生装置将之前团聚的并甚至在去除磁场之后潜在地附着到第一壁的颗粒 从第一壁去除。 这构成了本发明的方法的主要优点， 特别地， 相对于先前已知的围绕整个腔 的环形磁体而言。在优选实施中， 第二磁场产生装置被设置为使磁颗粒被吸引到第二壁并 从相对的第一壁转移。 在优选实施例中， 第二磁场产生装置被设置为与第二壁直接接触。 在 优选实施例中， 第二磁场产生装置被设置为与第二壁直接接触而不与第一壁直接接触。
优选地， 在该特定实施例中， 第二壁还包括能够固定接合有分析物的顺磁颗粒的抗体。 本发明不必需将第二磁场的磁极设置为与第二壁形成小于 90°的角 (v2)。然而， 优选根据本发明同样地设置第二磁场， 即， 将第二场产生装置相对于第二壁设置为使第二 极轴 (a2) 与第二壁形成小于 60°的角 (v2)。在一个实施例中， 第二场产生装置被相对于第 二壁设置为使第二极轴与第二壁之间的角 (v1) 在 0°与 60°之间。
在一个实施例中， 第二场产生装置被相对于第二壁设置为使第二极轴与第二壁之 间的角 (v1) 在 0°与 40°之间。
在一个实施例中， 第二场产生装置被相对于第二壁设置为使第二极轴与第二壁之 间的角 (v1) 在 0°与 20°之间。
在一个实施例中， 第二场产生装置被相对于第二壁设置为使第二极轴与第二壁之 间的角 (v1) 在 0°与 10°之间。
在一个实施例中， 第二场产生装置被相对于第一壁设置为使第二极轴与第一壁之 间的角 (v1) 为 0°。
优选地， 用诸如抗体的受体来涂覆顺磁颗粒， 受体会接合到所关注的分析物。 优选 地， 液体包含能够接合到顺磁颗粒的分析物。包含能够接合到顺磁颗粒的分析物的液体为 血液。
本发明的发明人所面临的问题是尤其与在极小的液体样品中的颗粒的操纵有关 的问题。 在较大的样品中， 由于样品易于被振荡而由此产生均匀的颗粒分布， 因此不会出现 相同程度的颗粒积聚的问题。 相反， 在小体积样品中， 振荡和另外的机械操纵样品是困难的 或实际上不可能的， 因而不会导致当使用根据本发明的方法所观察到的希望的聚集物的瓦 解。
由此， 在本发明的优选实施例中， 小体积的液体包含能够接合到顺磁颗粒的分析 物， 并具有 0-500μl 的体积， 特别地 0-400μl， 更特别地 0-300μl， 特别地 0-200μl， 更特 别地 0-150μl， 更特别地 0-100μl， 更特别地 0-50μl， 更特别地 0-30μl。
由此， 在优选实施例中， 容纳多个顺磁颗粒的腔适于具有小于 200μl 的体积的样 品。如果在样品被施加到腔时多个顺磁颗粒中的基本上所有颗粒悬浮在样品中， 则该腔适 于具有小于 200μl 的体积的样品。由此， 在本发明的优选实施例中， 要分析的样品优选具 有小于 200μl 的体积。在更优选的实施例中， 要分析的样品具有小于 150μl 的体积， 更 优选地小于 100μl 的体积， 更优选地小于 90μl 的体积， 例如， 小于 80μl， 小于 70μl 或 甚至小于 60μl。在更优选的实施例中， 要分析的样品具有小于 50μl 的体积， 更优选小于 45μl， 更有效小于 40μl。
在一个实施例中， 腔为毛细通道。在优选实施例中， 该腔具有小于 100μl 的体积。 在更优选的实施例中， 该腔具有小于 90μl 的体积， 更优选小于 80μl， 更优选小于 70μl， 例如， 小于 60μl， 小于 50μl 或甚至小于 40μl。 在更优选的实施例中， 该腔具有小于 30μl 的体积， 更优选小于 25μl， 更优选小于 20μl， 例如， 小于 15μl， 小于 10μl 或甚至小于 5μl。
根据本发明的另一实施例， 该方法仅包括步骤 a) 到 d)。已经发现， 为了实现多个 顺磁颗粒的随后的分布， 简单地根据步骤 d) 去除磁场便足够。因此， 不需要附加的再悬浮
步骤来分布颗粒。这极大地简化了本发明的方法， 在微升级别的操作时尤其如此。
根据本发明的又一实施例， 第一场产生装置包括单一磁体。 磁体可以为例如条形。 磁体可以为永磁体或螺线管。这构成了对微流体装置而言容易实施的简单实施例。
优选地， 在包括腔装置和磁装置的系统中实施根据本发明的方法。 由此， 在一个实 施例中， 本发明涉及一种用于使多个顺磁颗粒在腔中团聚并随后分布的系统， 所述系统包 括腔装置以及磁装置， 所述腔装置具有第一壁和相对的第二壁， 所述第一壁和所述第二壁 限定被设置用于接收并容纳所述多个顺磁颗粒的腔， 并且所述磁装置包括 ： a) 接收装置， 其用于接收所述腔装置 ； 以及 b) 用于产生第一磁场的第一磁场产生装置， 所述第一磁场 产生装置具有第一和第二彼此间隔的异性磁极并限定了在所述磁极之间延伸的第一极轴 (a1)， 所述第一场产生装置被相对于在所述接收装置中接收的所述腔装置的所述第一壁设 置， 以便对所述腔中的顺磁颗粒施加所述场并且所述第一极轴 (a1) 与在所述接收装置中接 收的所述腔装置的所述第一壁形成小于 60°的角 (v1)， 并且还包括用于改变所述磁场的装 置。
用于改变磁场的装置表示例如用于使磁场相对于在接收装置中接收的腔装置移 动的装置、 和 / 或用于去除磁场的装置、 和 / 或用于使磁场的极性反转 (reverse) 的装置。 用于改变磁场的装置可以包括用于施加和去除磁场的装置。 用于改变磁场的装置 也可以包括用于使第一场产生装置沿具有第一极轴的方向的移动分量的第一移动方向移 动的装置。用于改变磁场的装置也可以包括用于使磁场的极性反转的装置。
可以通过用于使第一场产生装置沿具有第一极轴的方向的移动分量的第一移动 方向移动的装置的快速移动来实现磁场的去除。 也可以通过使场产生装置沿垂直方向从腔 移走、 或在电磁体的情况下通过切换电力来实现去除。
在一个实施例中， 根据本发明的系统包括磁装置， 其中， 该磁装置包括用于产生第 二磁场的第二磁场产生装置， 该第二磁场产生装置具有第一和第二彼此间隔的异性磁极并 限定了在磁极之间延伸的第二极轴 (a2)， 第二场产生装置被相对于在接收装置中接收的腔 装置的第二壁设置， 以便对腔中的顺磁颗粒施加第二场， 从而将颗粒吸引到第二壁。
优选地， 如果使用两个或更多的场产生装置， 则至少一个场产生装置被根据本发 明设置。因此， 本发明的一个实施例涉及这样的系统， 其中第一场产生装置被相对于第一 壁设置， 以便在第一极轴与在接收装置中接收的腔装置的第一壁之间形成小于 60°的角 (v1)， 并且可选地， 其中， 相对于第二壁设置第二场产生装置， 以便在第二极轴与在接收装 置中接收的腔装置的第二壁之间形成小于 60°的角 (v2)。
优选地， 如果存在两个或更多的场产生装置， 则它们全部根据本发明来设置。因 此， 在一个实施例中， 相对于第二壁设置第二场产生装置， 以便在第二极轴与第二壁之间的 角 (v1) 在 0°与 60°之间， 例如在 0°与 40°之间， 例如在 0°与 20°之间， 例如在 0°与 10°之间， 例如 0°。
优选地， 腔为这样的毛细通道， 该毛细通道容纳顺磁颗粒并具有连接到样品入口 的第一端部和连接到溶液入口的第二端部。
在本发明的一个实施例中， 本发明的仪器可以被描述为这样的装置和设备， 其包 括： a) 通道装置， 其包括容纳多个顺磁颗粒的纵向毛细通道 ； 以及 b) 磁装置， 其包括用于接 收所述通道装置的接收装置并包括用于产生磁场的磁场产生装置。
此外， 本发明还涉及一种用于检测在包括小于 200μl 液体的样品中是否存在目 标分析物的方法， 包括以下步骤 ：
(a) 提供这样的液体， 该液体包含分析物和能够接合并固定所述分析物的多个顺 磁颗粒 ；
(b) 通过第一场产生装置对包含被固定的分析物的所述顺磁颗粒施加第一磁场， 所述第一场产生装置具有第一和第二彼此间隔的异性磁极并限定了在所述磁极之间延伸 的第一极轴， 所述场产生装置被相对于所述第一壁设置， 以便所述第一极轴 (a1) 与所述第 一壁形成小于 60°的角 (v1) ；
(c) 使所述磁场沿具有所述第一极轴的方向的移动分量的第一移动方向移动， 或 者， 使所述磁场的极性反转 ； 以及
(d) 可选地， 将所述顺磁颗粒移动到包括清洗和 / 或检测液体的分离腔， 或者， 用 清洗和 / 或检测液体置换所述腔中的残留液体 ；
(e) 去除所述磁场 ； 以及
(f) 检测所述分析物。
在步骤 b) 中， 使颗粒团聚， 允许例如通过去除残留的样品材料和用其他溶液或缓 冲剂 (buffer) 置换该残留的样品材料， 或者例如通过将颗粒吸引到包含特定接合物种的 某些颗粒可被接合到的特定表面， 来操纵颗粒和 / 或残留的样品材料。用于检测分析物物 种的装置可以选自表面声波 (SAW) 检测器、 分光光度计、 荧光计、 CCD 传感器芯片、 CCOS 传感 器芯片、 PMT 检测器或任何适宜的光检测器。
在优选实施例中， 包括含有多个顺磁颗粒的液体的腔为具有小于 1mm2、 优选 2 0.1-0.7mm 的截面积的毛细通道。 在一个实施例中， 毛细通道的宽度和高度分别为约 1.0mm 和约 0.2mm。毛细通道的长度为 5-50mm。在一个实施例中， 毛细通道的长度为 5-20mm。在 一个实施例中， 毛细通道的长度为 12-20mm。
在又一实施例中， 本发明涉及将本发明的系统用于定量检测在样品中是否存在目 标分析物的用途。
实例
实例， 当检测人血浆中的脑钠肽 (BNP) 时的 CV 值
鉴定的原理
BNP 鉴 定 是 使 用 直 接 化 学 发 光 技 术 和 恒 定 量 的 两 个 单 克 隆 抗 体 的 双 面 夹 心 免 疫 鉴 定。 第 一 抗 体 ( 示 踪 物 ) 为 专 用 于 BNP 的 环 结 构 的 HRP 标 记 的 单 克 隆 鼠 抗 人 (anti-human)BNP 抗体 (KY)。固相中的第二抗体为专用于 BNP 的 C 封端部分的生物素化的 (biotinylated) 单克隆鼠抗人抗体， 其被耦合到抗生蛋白链菌素 (streptavidin) 涂覆的 顺磁颗粒。血浆样品中存在的 BNP 的量与通过光电倍增管 (PMT， Hamamatsu) 检测的相对光 单位 (RLU) 的量之间存在直接关系。
腔装置和毛细通道的预处理
18 个腔装置 ( 参见图 1 和 2) 被制造为黑色， 但用透明 ABS( 丙烯腈丁二烯苯乙烯 ) 聚合物制造装置的检测窗口 (14)。 腔装置的总长度、 高度和厚度分别为约 70、 35 和 2mm。 毛 细通道 (3， 5， 6) 的总长度为约 40mm， 整个通道 (3， 5， 6) 的宽度为约 1.0mm。通道的第一部 分 (3) 的深度为约 0.2mm， 通道的所有其他部分 (5， 6) 的深度为约 0.5mm。在 2- 丙醇的 50体积％水溶液中超声清洗通道装置并对其进行电晕放电处理 (25W/2s)， 以在分配顺磁颗粒 之前增加亲水性。
在电晕放电处理之后， 制造单克隆鼠抗体 ( 对抗 BNP 的抗体 ) 涂覆的顺磁颗粒在 缓冲剂 (TBS ： 0.05 重量％的鼠 IgG， 0.05 重量％的牛 γ 球蛋白， 5 重量％的蔗糖， 5 重量％ 的 BSA， 0.05 体积％的吐温 (Tween)， 1 重量％的聚氧乙烯 -10- 十三基醚以及 0.1 重量％的 Proclin 300( 防腐剂 )) 中的溶液， 并利用分配器 (Nanodrop ExtY) 将约 1μl 的该溶液施 加到通道， 以使仅仅通道的第一部分 (3) 被该溶液覆盖。静置溶液约 15 分钟以完全干燥。 然后用压敏粘合膜 (PSA) 密封该装置。
进行鉴定
向每个都共价地耦合到约一个辣根过氧化物酶分子的单克隆鼠 BNP 抗体 “KY” 的 溶液添加具有 20pg/mL 的 BNP 浓度的人血浆。BNP 和鼠抗体 KY 现在在溶液中专门耦合。在 约 1 分钟的反应时间之后， 人血浆溶液被引入通过第一端部 (1)。 血浆现在溶剂腔中的糖基 质， 由此使顺磁颗粒在腔中重新悬浮。
该 18 个腔装置被分为两组， 每组 9 个。
现在将磁体 A( 参见图 5)(A 组 ) 或磁体 B( 参见图 5)(B 组 ) 放置在 PSA 的顶上并 在腔 (3) 之上机械地往复移动。
在磁体 A 组中， 磁场的两个磁极都被设置为直接垂直于腔装置中的液体的流动方 向。在磁体 B 组中， 磁场的磁极被设置为使它们被沿毛细通道的纵向方向观察时彼此间隔。 相对于腔的第一角 (v1) 为 0 度 ( 图 5A 和 5B)。
磁体的该运动持续约 200 秒。在该时长期间， BNP 分子形成了在抗体 KY 与专门耦 合到顺磁颗粒的抗体之间的夹层。
清洗缓冲剂 (TBS ： 0.05 重量％的 BSA， 0.05 体积％的吐温， 以及 0.01 重量％的凯 松 (Kathon) 或 0.1 重量％的 ProClin 300) 被置入通过入口 (8， 25， 26) 并填充测量区域、 清洗腔以及约 50％的废物腔。然后， 使磁体缓慢地从腔 (3) 移动到清洗腔 (5)， 其移动方式 使得当到达清洗腔 (5) 时所有悬浮的顺磁颗粒与磁体紧密接触。现在使磁体在清洗腔 (5) 的端部之间往复 ( 从 (4a) 到 (6) 以及从 (6) 到 (4a)) 移动约 20s， 其移动方式使得在转折 点处最小量的顺磁颗粒保持与磁体紧密接触。现在将磁体非常快速地移动远离腔装置， 并 且顺磁颗粒通过重力而落到腔的底部。重复该清洗循环一次。
然后， 将磁体从毛细腔 (5) 移动到腔 (6) 的检测部分的测量区域 (14) 的中心， 其 移动方式使得在到达测量区域 (14) 的中心时悬浮的所有颗粒与磁体紧密接触。当与 HRP 接触会产生光子的化学发光基板 ( 来自 Pierce prod.37074 的 Supersignal Elisa Femto Maximum Sensitivity Substrate) 被加入， 以完全填充测量区域 (6， 14)、 清洗腔 (5) 以及 约 50％的废物腔 (27)。然后使磁体在测量区域的端部之间 ((6) 的整个长度 ) 往复移动约 8s， 其移动方式使得在转折点处最小量的顺磁颗粒保持与磁体紧密接触。现在将磁体非常 快速地移动远离毛细腔， 并且顺磁颗粒通过重力而落到腔的底部。
一旦磁体非常快速地移动远离测量区域， 位于测量区域下方的 PMT 开启， 并执行 120s 的对通过窗口的光子数目的测量。
在下面的表 1 中示例出两种实验的结果。
表1： 在 40 秒的测量之后的测得的相对光单位 (RLU)， 其被表达为 RLU 的平均值、标准偏差以及 CV 值
磁体 A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 平均值 标准偏差 CV 值
279622 308120 215242 110194 171108 171836 179160 134124 355194 213844 78236 36.6％ 磁体 B 395732 357968 386774 444728 425300 386988 376776 402616 422506 399932 25435 6.4％结果和结论
结果表明， 与实验 A 相比， 实验 B 中的信号高了约 1.9 倍， 并且标准偏差低了 3.1 倍。这导致实验 B 中的信号与实验 A 相比降低了约 5.7 倍的显著较小的 CV 值 ( 标准偏差 / 平均值 )。两种实验的曲线的特性也不同。在实验 A 中， 最大 RLU 值在约 7s 之后达到， 并 保持在最大水平直到 15s， 导致约 8s 的平台。在实验 B 中， 最大 RLU 值在约 20s 之后达到， 并保持在最大水平直到 40s， 导致约 20s 的平台。
所有上述特征反映出在团簇中的顺磁颗粒的特性 ( 实验 A) 与在较小的团簇中和 作为单独颗粒的顺磁颗粒的特性之间的预期的差异。 由此， 在后一情况下， 预期光信号的屏 蔽较小， 因而导致较高的信号， 顺磁颗粒的沉淀 (sedimentation) 被降低， 并且顺磁颗粒的 沉淀减慢， 这为最大 RLU 值带来更长的平台相。
该实验清楚地证明， 当使用其场线基本上垂直于流动方向而移动的磁场时， 与场 线基本上平行于流动方向的情况相比显著改善了信号强度和 CV 值。