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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710134970.4 (22)申请日 2017.03.08 (71)申请人 上海长海医院 地址 200433 上海市杨浦区长海路168号 (72)发明人 徐明娟 夏蕾蕾 王野 张彩虹 蔡圣芸 严久琼 郝璠 苏晓玲 (74)专利代理机构 上海卓阳知识产权代理事务 所(普通合伙) 31262 代理人 周春洪 (51)Int.Cl. A61K 33/34(2006.01) A61K 9/14(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 氧化亚铜纳。
2、米粒在制备治疗妇科肿瘤的药 物中的应用 (57)摘要 本发明涉及氧化亚铜纳米粒在制备治疗妇 科肿瘤的药物中的应用。 本发明经体外实验证实 氧化亚铜纳米粒可显著抑制宫颈癌细胞和子宫 内膜癌细胞的增殖， 表现出显著的杀伤作用； 经 体内实验证实氧化亚铜纳米粒与化疗药顺铂抑 制肿瘤效果相当， 但不会引起裸鼠体重的下降， 副作用较低。 以上结果提示氧化亚铜纳米粒在制 备治疗妇科肿瘤的药物方面具备深厚潜力。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 107050051 A 2017.08.18 CN 107050051 A 1.氧化亚铜纳米粒在制备治疗妇科肿瘤的药物中的应用。 2.根据权利要求1所述的。
3、应用， 其特征在于， 所述的妇科肿瘤为宫颈癌， 子宫内膜癌或 卵巢癌。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述的妇科肿瘤为宫颈癌或子宫内膜癌。 4.氧化亚铜纳米粒在制备体外抑制宫颈癌细胞增殖的试剂中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述的宫颈癌细胞为SiHa， Caski， MS751或 HeLa细胞。 6.氧化亚铜纳米粒在制备体外抑制子宫内膜癌细胞增殖的试剂中的应用。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述的子宫内膜癌细胞为ECC1或HEC1A细 胞。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107050051 A 2 氧化亚铜纳米粒在制备治疗。
4、妇科肿瘤的药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医药技术领域， 具体地说， 涉及氧化亚铜纳米粒的新用途， 尤其是 在制备治疗妇科肿瘤的药物中的应用。 背景技术 0002 妇科肿瘤是一种多发病， 由于其致病因素较复杂， 癌变组织结构多样， 受神经内分 泌因素影响的不断变化， 所在部位又极易受细菌或病毒感染， 很早就受到人们重视。 妇科生 殖器肿瘤又以子宫颈癌， 卵巢癌， 子宫内膜癌较为常见， 这三种肿瘤并称为妇科生殖系统三 大恶性肿瘤。 宫颈癌(cervical cancer)在女性肿瘤中的发病率排在第二位， 是恶性程度最 高的肿瘤之一， 全球每年有将近50万的妇女被诊断为宫颈癌， 其。
5、中将近一半患者死亡。 由于 宫颈刮片筛查和防癌疫苗的接种， 宫颈癌的发生率显著下降。 但目前宫颈癌在我国的发病 率和死亡率仍占全球四分之一， 严重威胁女性健康。 手术和放化疗是宫颈癌的主要治疗手 段， 手术适用于早期病例， 放疗虽然适合于各期病例， 但可对卵巢和阴道造成功能上的影 响， 严重影响年轻患者的生活质量， 化疗主要应用于宫颈癌局部晚期病例的辅助性治疗和 晚期病例的姑息性治疗。 目前在晚期宫颈癌中广泛应用的顺铂联合紫杉醇或拓扑替康化疗 方案的有效率波动于28 .046 .3之间， 预计总生存期小于12个月。 子宫内膜癌 (endometrial cancer， EC)为女性生殖道常见三。
6、大恶性肿瘤之一。 占女性生殖道恶性肿瘤 2030， 在许多发达国家， 其发病率居妇科恶性肿瘤首位。 中国卫生部20042005年中 国恶性肿瘤死亡抽样回顾调查显示， 子宫恶性肿瘤死亡率为4.32/10万， 位居女性恶性肿瘤 死亡率第七位(2012中国卫生统计年鉴)。 鉴于子宫内膜癌的发病率和死亡率逐年递增， 在 我国EC俨然已经成为一个严重的公共卫生难题。 综上所述， 寻找新的宫颈癌、 子宫内膜癌等 妇科肿瘤的治疗药物具有现实意义。 0003 纳米科学的发展给科学进步注入了新鲜动力， 给包括医学在内的各个学科带来了 深刻的变革。 纳米医学及其分支纳米肿瘤学是纳米科学的子学科， 它们的发展给肿瘤。
7、治疗 及抗肿瘤药物研发提供了可行的方法和思路。 脂质体靶向给药系统、 磁性纳米粒给药体系、 量子点、 纳米分子成像技术以及无机纳米药物是抗肿瘤纳米药物的前沿研究对象。 其中， 抗 肿瘤无机纳米药物既可以经改造成为载药体系， 也可以作为抗肿瘤药物靶向肿瘤组织， 表 现出许多独特的作用， 有许多有趣的科学问题亟待研究。 棒状纳米金、 星型纳米金、 纳米氧 化锌、 纳米金铁复合材料等多种无机纳米药物表现出显著的抗肿瘤作用， 且具有独特的亚 细胞结构的靶向作用， 可以选择性地靶向肿瘤细胞的细胞核、 线粒体等结构， 在细胞水平和 实验动物水平均表现出良好的肿瘤治疗应用前景。 对于无机纳米药物的作用机制研。
8、究发 现， 金纳米粒(Au NPs)可通过抑制MAPK信号通路抑制肿瘤的转移与增殖； 纳米TiO2可上调 Bak/Bax的比值； Mn纳米粒可上调转铁蛋白的表达； 超磁性铁纳米粒通过激活 -catenin、 cancer/testis抗原、 间质金属蛋白酶MMP-2等蛋白的表达参与人间充质干细胞的分化调 控， 还可与c-erbB-2受体结合靶向乳腺癌细胞； ZnO纳米粒可抑制Akt、 Erk1/2的磷酸化， 激 活JNK、 P38。 其中 -catenin、 Akt、 Erk、 MMP等蛋白与肿瘤的转移密切相关。 说 明 书 1/4 页 3 CN 107050051 A 3 0004 氧化亚铜。
9、纳米粒(Cuprous Oxide Nanoparticles， CONPs)为一种含铜纳米药物。 中国专利文献CN201610307984.7， 公开日2016.08.10， 公开了氧化亚铜纳米粒在制备治疗 肾癌药物中的应用， 所述肾癌是透明细胞型肾癌、 颗粒细胞型肾癌、 混合细胞型肾癌、 未分 化细胞型肾癌。 中国专利文献CN201610308780.5， 公开日2016.08.10， 公开了氧化亚铜纳米 粒在制备治疗前列腺癌药物中的应用。 目前未知氧化亚铜纳米粒对于妇科肿瘤是否具备治 疗效果。 发明内容 0005 本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供氧化亚铜纳米粒的新用途。 000。
10、6 本发明第一方面提供了氧化亚铜纳米粒在制备治疗妇科肿瘤的药物中的应用。 0007 作为本发明的一个优选例， 所述的妇科肿瘤为宫颈癌， 子宫内膜癌或卵巢癌。 0008 更优地， 所述的妇科肿瘤为宫颈癌或子宫内膜癌。 0009 本发明另一方面提供了氧化亚铜纳米粒在制备体外抑制宫颈癌细胞增殖的试剂 中的应用。 0010 作为本发明的一个优选例， 所述的宫颈癌细胞为SiHa， Caski， MS751或HeLa细胞。 0011 本发明再一方面提供了氧化亚铜纳米粒在制备体外抑制子宫内膜癌细胞增殖的 试剂中的应用。 0012 作为本发明的一个优选例， 所述的子宫内膜癌细胞为ECC1或HEC1A细胞。 0。
11、013 本文中， 所述的 “药物” 是指能影响机体生理、 生化和病理过程， 用以临床上预防、 诊断、 治疗疾病和计划生育的化学物质。 所述的 “试剂” 又可称作生物化学试剂或试药， 是专 用于实现化学反应、 分析化验、 研究试验、 教学实验、 化学配方使用的纯净化学品。 本发明的 氧化亚铜纳米粒可与药用载体共同制成药物组合物以便于给药， 所述药用载体包括生理适 合的任何和所有的溶剂、 分散介质、 包衣剂、 等渗和吸收延缓试剂等， 给药途径可以是静脉 内的、 肌肉的、 皮下的、 肠胃内的、 脊柱的或表皮的等。 0014 本发明优点在于： 本发明经体外实验证实CONPs可显著抑制宫颈癌细胞和子宫内。
12、 膜癌细胞的增殖， 表现出显著的杀伤作用； 又经体内实验证实CONPs与化疗药顺铂抑制肿瘤 效果相当， 但不会引起裸鼠体重的下降， 具备较低的副作用。 本发明扩大了CONPs的用途， 应 用范围将不仅限于肾癌、 前列腺癌等， 还可用于与之发病诱因、 发病机制均不同的妇科肿瘤 如宫颈癌、 子宫内膜癌的治疗； 另一方面， CONPs对于上述细胞的体外杀伤作用有助于研究 相应肿瘤的发生发展机制， 以及不同肿瘤之间的比较， 或用作对照品用于评价其他类受试 品对癌细胞的增殖抑制作用。 附图说明 0015 图1： CONPs可显著抑制宫颈癌细胞的增殖。 0016 图2： CONPs可显著抑制子宫内膜癌癌细。
13、胞的增殖。 0017 图3： CONPs可显著抑制宫颈癌瘤体的生长。 具体实施方式 0018 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。 说 明 书 2/4 页 4 CN 107050051 A 4 0019 实施例1 0020 一、 材料 0021 SiHa， Caski， MS751， HeLa， ECC1， HEC1A： 中科院细胞库引进。 0022 DMEM、 胎牛血清FBS： Gibco公司。 0023 裸鼠： 上海华东师范大学动物房购买。 0024 CONPs： 自行制备， 具体方法参见文献： YWang,XYZi,J Su,et al.Cuprous oxide nano。
14、particles selectively induce apoptosis of tumor cells.International Journal of Nanomedicine,2012,7(8):2641-2652。 0025 顺铂(DDP)： Sigma公司。 0026 二、 方法 0027 1、 细胞实验 0028 选择SiHa， Caski， MS751， HeLa宫颈癌细胞系， ECC1， HEC1A子宫内膜癌细胞系为研 究对象， 使用DMEM培养基培养， 细胞培养基添加10FBS和1青霉素-链霉素， 取96孔板， 每 孔加入200 l的细胞悬液， 每孔3000个细胞， 孵育过。
15、夜， 弃培养基， 按浓度梯度加入CONPs， 除 对照组以外， 实验组浓度梯度设定为1.25 g/ml、 2.5 g/ml、 5 g/ml、 10 g/ml每个浓度梯度 设置5个复孔， 在72h弃去加入药物的培养基， 按10:1的比例每孔加入10 l的CCK8溶液和100 l培养基配好的混合液， 37孵箱避光孵育4h， 用酶标仪在450nm处测定细胞吸光度， 按照 抑制率()(1实验组平均A值/对照组平均A值)100的公式计算出抑制率， 通过 SPSS16.0计算出IC50， 利用GraphPad Prism5进行量效柱状图绘制。 0029 2、 动物实验 0030 选择MS751宫颈癌细胞系。
16、进行裸鼠皮下成瘤实验， 每只裸鼠皮下注射2106细胞， 待裸鼠皮下瘤长至57mm时分别予以处理。 共分为4组， control组： 皮下注射50 l 5GS+ 腹腔注射100 l 5GS； CONPs： 皮下注射50 l CONPs(4mg/kg)； 顺铂组(DDP)： 腹腔注射100 l顺铂(2mg/kg)； CONPs+顺铂组： 皮下注射50 l CONPs(4mg/kg)+腹腔注射100 l顺铂(2mg/ kg)。 14d后裸鼠处死， 测量裸鼠体重及肿瘤重量， 利用GraphPadPrism5进行量效柱状图绘 制。 三、 结果 0031 1、 细胞实验结果 0032 不同浓度的CONPs。
17、处理培养于96孔板的宫颈癌细胞72小时之后， 采用CCK8法检测 CONPs对细胞增殖的影响。 检测结果显示， 48h时间节点， CONPs对宫颈癌细胞系SiHa， Caski， MS751， HeLa细胞的半效抑制浓度IC50依次为5.76 g/ml、 3.48 g/ml、 5.27 g/ml、 3.04 g/ ml。 72h时间节点， CONPs对宫颈癌细胞系SiHa， Caski， MS751， HeLa细胞的半效抑制浓度IC50 依次为5.61 g/ml、 1.23 g/ml、 1.35 g/ml、 0.92 g/ml。 结果显示， CONPs可以显著抑制宫颈 癌细胞系的增殖(图1)。。
18、 0033 不同浓度的CONPs处理培养于96孔板的子宫内膜癌细胞72小时之后， 采用CCK8法 检测CONPs对细胞增殖的影响。 检测结果显示， 48h时间节点， CONPs对子宫内膜癌细胞系 HEC1A， ECC1细胞的半效抑制浓度IC50依次为5.328 g/ml、 3.767 g/ml。 72h时间节点， CONPs 对子宫内膜癌细胞系HEC1A， ECC1细胞的半效抑制浓度IC50依次为4.162 g/ml、 2.310 g/ ml。 结果显示， CONPs可以显著抑制子宫内膜癌细胞系的增殖(图2)。 0034 2、 动物实验结果 说 明 书 3/4 页 5 CN 107050051。
19、 A 5 0035 裸鼠皮下成瘤实验结果表明， CONPs较对照组可显著抑制肿瘤的增长(P0.0001)， 并且并未引起裸鼠体重的下降。 顺铂组较对照组虽可显著抑制肿瘤的增长(P0.0001)， 但 可引起裸鼠体重的显著下降(P0.0001)。 CONPs较顺铂组相比， 抑制肿瘤效果无差异(P 0.8127)， 但顺铂组裸鼠体重较CONPs组有显著下降(P0.0001)(图3)。 这一结果为进一步临 床应用打下坚实基础。 0036 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员， 在不脱离本发明方法的前提下， 还可以做出若干改进和补充， 这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。 说 明 书 4/4 页 6 CN 107050051 A 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 7 CN 107050051 A 7 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 8 CN 107050051 A 8 。