技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及黄芩素在制备防治伊立替康诱导的化疗性肠炎药物中的应用。
背景技术
伊立替康(CPT-11)是喜树碱的半合成衍生物，能特异性地与拓扑异构酶I结合，使DNA双链结构破坏，导致细胞死亡，起到抗肿瘤作用。伊立替康常用于标准方案化疗后复发的转移性结直肠癌的治疗，此外，对肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌等也有一定疗效。临床应用虽然广泛，但其诱发的迟发性腹泻严重限制其临床应用。目前临床上针对CPT-11引发的迟发性腹泻用药主要以洛哌丁胺、奥曲肽抑制胃肠蠕动、减少蛋白酶和胃泌素为主。然而，长期服用这类药物会出现过敏性休克、麻痹性肠梗阻、尿潴留等不良反应，严重影响患者的治疗顺应性，因此常常限制伊立替康的临床应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了黄芩素在制备防治伊立替康诱导的化疗性肠炎药物中的应用，能够有效地预防和治疗服用伊立替康诱导的化疗性肠炎。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种黄芩素在制备防治伊立替康诱导的化疗性肠炎的药物中的应用。
优选的，所述化疗性肠炎体现在肠道损伤；所述肠道损伤包括肠粘膜受损、绒毛细胞受损和肠粘膜屏障功能遭到破坏中的一种或几种。
优选的，所述绒毛细胞受损包括粘膜层变薄和/或绒毛长度变短。
优选的，所述黄芩素能够降低肠道中炎症因子的水平。
优选的，所述炎症因子包括TNF-α、IL-6和IL-1β中的一种或几种。
优选的，所述防治伊立替康诱导的化疗性肠炎的药物的剂型包括液体制剂、颗粒剂、冲剂、片剂或胶丸。
优选的，所述防治伊立替康诱导的化疗性肠炎的药物包括黄芩素在药学上可接受的辅料；
所述防治伊立替康诱导的化疗性肠炎的药物中黄芩素的有效含量为98％以上。
本发明提供了黄芩素在制备防治伊立替康诱导的化疗性肠炎药物中的应用。在本发明中，所述黄芩素能够降低小肠结肠中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，减轻药物对肠道的损伤，保护肠道粘膜，从而能够有效预防和治疗伊立替康诱导的化疗性肠炎。
附图说明
图1为小鼠造模技术路线、小鼠体重和疾病活动指数的结果；其中1-(A)为伊立替康诱导的化疗性肠炎小鼠造模并给药干预的技术路线图；1-(B)为肠炎小鼠体重变化曲线图；1-(C)为肠炎小鼠活动指数图；
图2为小鼠空肠、结肠病理切片、病理打分、绒毛长度/粘膜厚度统计及空肠、结肠形态及长度统计结果；其中2-(A)为空肠及结肠病理切片结果；2-(B)为空肠及结肠病理评分结果；2-(C)为小肠绒毛长度、结肠粘膜厚度统计图；2-(D)为不同组小鼠小肠性状图及长度统计图；2-(E)为不同组小鼠结肠性状图及长度统计图；
图3为小鼠空肠和结肠中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的基因表达水平结果；其中3-(A)为不同组空肠及结肠组织IL-1β的mRNA相对表达情况；3-(B)为不同组空肠及结肠组织IL-6的mRNA相对表达情况；3-(C)为不同组空肠及结肠组织TNF-α的mRNA相对表达情况。
具体实施方式
本发明提供了一种黄芩素在制备防治伊立替康诱导的化疗性肠炎的药物中的应用。
在本发明中，所述化疗性肠炎体现在肠道损伤；所述肠道损伤优选包括肠粘膜受损、绒毛细胞受损和肠粘膜屏障功能遭到破坏中的一种或几种，更优选包括肠粘膜受损、绒毛细胞受损和肠粘膜屏障功能遭到破坏。
在本发明中，所述绒毛细胞受损优选包括粘膜层变薄和/或绒毛长度变短，更优选包括粘膜层变薄和绒毛长度变短。
在本发明中，所述防治伊立替康诱导的化疗性肠炎的药物的剂型优选包括液体制剂、颗粒剂、冲剂、片剂或胶丸。
在本发明中，所述防治伊立替康诱导的化疗性肠炎的药物优选包括黄芩素在药学上可接受的辅料；所述防治伊立替康诱导的化疗性肠炎的药物中黄芩素的有效含量优选为98％以上。
在本发明中，所述黄芩素能够降低肠道中炎症因子的水平。
在本发明中，所述炎症因子优选包括IL-1β、IL-6和TNF-α中的一种或几种，更优选包括IL-1β、IL-6和TNF-α。
在本发明中，为了能够表征黄芩素降低炎症因子的效果，在服用药物后优选通过检测空肠或结肠中炎症因子的基因表达，来确定炎症因子的水平。
本发明在检测空肠或结肠中炎症因子的基因表达水平前，优选进行造模，所述造模的方法优选包括以下步骤：
1)造模药伊立替康的配置:先将全量20％～30％的注射用水与5.8μL L-(+)-乳酸混匀预热至75℃～85℃制成乳酸溶液，倒入称量好的135mg CPT-11·HCl·3H2O，迅速加入注射用水至全量的95％并充分搅拌，随后加入0.303g D-山梨糖醇搅拌直至完全溶解，pH调节剂调pH至3.2～3.6，加注射用水至全量即30mL，所得黄色澄清溶液即为4.5mg/mL的伊立替康溶液(CPT-11)，0.22μm微孔滤膜过滤，上述各步骤均在避光的条件下操作，于4℃避光短期内保存备用；
2)将所述步骤1)得到的伊立替康溶液对小鼠进行腹腔注射，每天注射一次，10天即得模型小鼠。
在本发明中，所述步骤1)中的伊立替康质量浓度优选为4.5mg/mL。本发明对所述伊立替康的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。在本发明实施例中具体为购买于天津西玛公司。
在本发明中，对小鼠进行腹腔注射前优选对小鼠常规饲喂5～9天，更优选为6～8天，最优选为7天。在本发明中，所述小鼠优选为SPF级C57/B6J小鼠；所述小鼠优选为雄性；所述小鼠的体重优选为18～22g，更优选为19～21g，最优选为20g；所述小鼠的周龄优选为8～10周，更优选为9周。本发明对小鼠的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的实验小鼠即可，在本发明实施例中具体来源于北京维通利华实验动物技术有限公司。
在本发明中，所述常规饲喂的温度优选为22～24℃，更优选为23℃；所述常规饲喂的湿度优选为50～70％，更优选为55～65％，最优选为60％；所述常规饲喂在光暗交替中进行，先光照12h后再黑暗12h，本发明对所述光照的强度没有特殊限定，采用本领域技术人员常规饲养小鼠采用的光照强度即可。
在本发明中，所述伊立替康溶液优选每2天重新配制，重新配置后再对小鼠进行腹腔注射。
本发明对造模的小鼠优选从开始腹腔注射前两天(预防性给药组)开始给药及腹腔注射当天开始给药(治疗性给药组)，低剂量组灌胃给予10～30mg/kg黄芩素(一天两次，BID)，高剂量组灌胃给予30～50mg/kg黄芩素(一天两次，BID)，腹腔注射伊立替康10天后处死小鼠。
在本发明中，所述给予造模的小鼠黄芩素的低剂量优选为10～30mg/kg，更优选为15～25mg/kg，最优选为20mg/kg；高剂量优选为30～50mg/kg，更优选为35～45mg/kg，最优选为40mg/kg。所述黄芩素溶解使用的溶剂优选为CMC-Na溶液，所述CMC-Na溶液的质量浓度优选为0.3～0.7％，更优选为0.4～0.6％，最优选为0.5％。本发明对所述黄芩素的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可，在本发明实施例中具体购买于罗恩试剂公司，所述黄芩素的纯度>98％。
本发明将小鼠处死后，取空肠和结肠，按照Takara总RNA提取试剂盒的说明书提取RNA，再按照RT-PCR试剂盒的说明书将mRNA逆转录为cDNA，再按照Thermal Cycler DiceTM Real Time System(TakaRa Code:TP800)使用说明书进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件优选包括：
预变性：95℃，30s；
PCR反应：95℃，10s；60℃，30s；72℃，30s；40个循环；
熔解曲线分析：95℃，15s；70℃，15s。
本发明对所述Takara总RNA提取试剂盒和RT-PCR试剂盒的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可，在本发明实施例中具体购买于Takara(大连宝生物，Japan)。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
伊立替康肠炎小鼠造模：C57/B6J小鼠在动物房饲养7天后，每天腹腔注射给予小鼠45mg/kg的伊立替康，每2天更换重新配制的伊立替康溶液，持续10天，每天称量小鼠体重。然后将小鼠随机分为七组：空白组、模型组、治疗性低剂量组、治疗性高剂量组、预防性低剂量组、预防性高剂量组、环丙沙星组。预防性给药在造模前三天开始给药干预，治疗性给药自造模当天开始给药干预：治疗性低剂量组及预防性低剂量组均灌胃给予20mg/kg黄芩素(一天两次，Bid)，治疗性高剂量组及预防性高剂量组灌胃均给予40mg/kg黄芩素(一天两次，Bid)，溶剂均为0.5％CMC-Na；环丙沙星组灌胃给予20mg/kg环丙沙星(一天两次，Bid)，溶剂为生理盐水；模型组灌胃给予同剂量0.5％CMC-Na溶液。第11天脱颈处死小鼠。
每日称量小鼠的体重以及每日观察小鼠的活动情况，测定结果见图1。
由图1可以看出，黄芩素可以显著改善由肠炎造成的小鼠体重下降情况。模型组体重下降为原来的72.6％，而黄芩素干预后体重情况有所改善，治疗性低剂量为原来的75.2％、治疗性高剂量为原来的82.3％、预防性低剂量为原来的79.4％、预防性高剂量为原来的87.6％；根据肠炎小鼠活动指数图的结果显示模型组小鼠疾病活动指数为7，而黄芩素干预后有不同程度的降低。
实验结果表明，模型组小鼠体重明显低于对照组(P<0.001)，黄芩素和阳性药环丙沙星给药干预后可显著升高模型组小鼠体重(P<0.001)。此外，黄芩素给药干预后，模型组小鼠疾病活动指数可明显降低。
实施例2
CPT-11肠炎小鼠造模方法、饲喂小鼠方法和处死小鼠方法详见实施例1。在超净台中剖取空肠、结肠组织，量取小肠及结肠长度并拍照。取空肠下端及结肠远端0.5cm用生理盐水冲洗干净，质量浓度为4％多聚甲醛固定24h后脱水、石蜡包埋，切片，做HE染色，其中脱水、石蜡包埋、切片和HE染色采用常规方法即可，病理切片结果见图2。
组织学评分：在显微镜下观察，根据文献制定组织学评分标准：
①病变范围：无，0分；1～25％，1分；26～50％，2分；51～75％，3分；76～100％，4分；
②病变深度：无，0分；黏膜上层，1分；黏膜固有层，2分；黏膜层和黏膜下层，3分；肌层及浆膜层，4分；
③隐窝损害程度：无，0分；小部分隐窝、表面上皮缺失，1分；部分隐窝、表面上皮缺失，2分；大部分隐窝、表面上皮缺失，3分；全部分隐窝、表面上皮缺失，4分；
④炎症细胞浸润程度：无，0分；轻微，1分；轻度，2分；中度，3分；重度，4分；
⑤纤维组织增生程度：无，0分；轻微，1分；轻度，2分；中度，3分；重度，4分。
根据图2可以得出，(A)是空肠及结肠病理切片结果可以得出：HE染色结果显示模型组出现不同程度的病变，黄芩素和环丙沙星组病变程度均明显改善，其中高剂量组尤其明显。(B)是空肠及结肠病理损伤评分统计结果，结果显示治疗低剂量组组织学评分为5.00分、治疗高剂量组为3.75分，预防低剂量组组织学评分为4.75分、治疗高剂量组为4.00分，环丙沙星组为2.00分均明显低于模型组的9.67分。(C)是空肠绒毛长度及结肠粘膜厚度统计图，结果表明模型组小鼠空肠绒毛长度相对于对照组更短及结肠粘膜厚度相较于对照组变薄，而黄芩素给药干预后对此现象有所改善，(D)是不同组小鼠小肠性状图及长度统计图，结果表明模型组小鼠小肠相对于对照组红肿程度更为明显，长度更短，黄芩素给药后对此现象有所改善，且呈剂量依赖，小鼠小肠长度统计图结果显示模型组小鼠结肠长度约为27.23cm，而黄芩素干预组小鼠小肠明显增长，预防性给药组尤为明显，且呈剂量依赖，(E)是不同组小鼠结肠性状图及长度统计图，结果表明模型组小鼠结肠相对于其他组红肿程度更为明显，长度更短，黄芩素给药后的小鼠结肠对此现象有所改善，且呈剂量依赖；小鼠结肠长度统计图结果显示模型组小鼠结肠长度约为5.72cm，而黄芩素干预组小鼠结肠明显增长，且呈剂量依赖。
根据病理切片结果可以得出，模型组出现不同程度的表层上皮细胞脱落、炎性细胞浸润、隐窝损伤及纤维组织增生等病变，黄芩素明显减轻CPT-11诱导的化疗性肠炎病理改变程度(P<0.01)，此外，黄芩素组的小肠及结肠长度、小肠绒毛长度、结肠粘膜厚度均相对于模型组明显增长(P<0.001)。
实施例3
空肠及结肠组织炎症因子基因表达：
CPT-11肠炎小鼠造模方法、饲喂小鼠方法和处死小鼠方法详见实施例1。剖取空肠及结肠组织，冲洗干净后，称取50mg，加入适量Trizol，按照Takara总RNA提取试剂盒操作提取RNA，并进行RNA定量。按照RT-PCR试剂盒说明书，将mRNA逆转录为cDNA。按照Thermal Cycler DiceTM Real Time System(TakaRa Code：TP800)使用说明书要求进行PCR实验操作，结果见图3。定量PCR反应条件为：
Stage1：预变性：95℃，30sec；
Stage2：PCR反应：95℃，10sec；60℃，30sec；72℃，30sec；40cycles；
Stage3：融解曲线分析：95℃，15sec；70℃，15sec。
根据图3可以得出，(A)是不同组空肠及结肠组织IL-1βmRNA相对表达水平情况，结果显示黄芩素干预后相对于模型组mRNA表达水平显著下调，(B)是不同组空肠及结肠组织IL-6的mRNA相对表达水平情况，结果显示黄芩素干预后相对于模型组mRNA表达水平显著下调，(C)是不同组空肠及结肠组织TNF-α的mRNA相对表达水平情况，结果显示预防性给高剂量黄芩素后相对于模型组mRNA表达水平显著下调。
实验结果表明，CPT-11造模后小鼠空肠及结肠IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达水平升高明显(P<0.01)；与模型组相比，黄岑素给药干预可以显著下调IL-1β、IL-6表达水平(P<0.01)，对于TNF-α的下调也比较明显(P<0.05)。
实验结果表明，黄芩素能够显著降低肠道中炎症因子IL-1β，IL-6和TNF-α的基因水平。
由以上实施例可以得出，黄芩素可以通过降低肠道中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，减轻药物对肠道的损伤，保护肠道粘膜，从而能够有效预防和治疗伊立替康诱导的化疗性肠炎。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。