丹参配方颗粒在制备预防和治疗艾滋病脑病药物方面的应用.pdf

本发明属于制药技术领域，具体涉及丹参配方颗粒在制备预防和治疗艾滋病脑病及HIV‑1Tat蛋白所致神经损伤药物方面的应用。本发明用HIV‑1Tat蛋白损伤类神经细胞系PC12和小鼠脑片上的神经细胞，用不同浓度的丹参配方颗粒进行保护，分别用MTT实验、LDH检测和Tunel实验检测丹参配方颗粒减少Tat蛋白所致神经细胞死亡的效果；用Dil金颗粒散射标记树突棘，检测丹参配方颗粒减少Tat蛋白损伤神经细胞突触连接功能的效果。通过实验结果的统计学分析，发现丹参配方颗粒对Tat蛋白所致的神经细胞损伤具有很好的保护效果，可用于制备预防和治疗艾滋病脑病及Tat蛋白所致神经损伤的药物。

1.丹参配方颗粒在制备预防和治疗艾滋病脑病药物方面的应用。 2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述丹参配方颗粒在制备预防和治疗HIV-1Tat蛋白所致神经损伤药物方面的应用。

技术领域

本发明属于制药技术领域，具体涉及一种传统中药丹参配方颗粒的一个新用途，即该中药在制备预防和治疗艾滋病脑病药物方面的应用，尤其是在预防和治疗HIV-1Tat蛋白所致神经损伤药物方面的应用。

背景技术

艾滋病脑病，现在又称为HIV相关神经认知功能紊乱（HAND，HIV-assotiated neurocognitive disorders），以运动、行为和认知障碍为特征，近期根据病情严重程度被分为三种形式：无症状神经认知功能损伤（Asymptomatic neurocognitive impairment,ANI），轻度神经认知功能紊乱 (mild neurocognitive disorder, MND)和HIV相关痴呆( HIV associated dementia, HAD)。

HIV-1造成神经损伤的详细机制有待深入研究，但可以肯定的是HIV-1具有神经毒性的蛋白通过直接或间接的形式损伤神经元是HAND发病的根本原因。HIV在感染15天后就可进入CNS（central nervous system，CNS），穿越血脑屏障的单核细胞释放病毒颗粒，然后感染脑内的小胶质细胞和星形胶质细胞。与CNS病毒载量相比，HAD症状与神经元丢失、损伤关系更紧密（Kaul M, HIV-1 infection and AIDS: consequences for the central nervous system. [J].Cell Death Differ 2005; 12 (Suppl 1) ），其损伤可分为直接损伤和间接损伤。直接损伤指HIV蛋白可以直接诱导神经元凋亡，减少神经树突和树突棘数量、损伤突触连接；间接损伤指由HIV感染的小胶质细胞或星形胶质细胞损伤神经元功能和神经再生（Kathryn A. HIV-Associated Neurocognitive Disorder: Pathogenesis and Therapeutic Opportunities. J neurimmune pharamac，2010，5:294-309; Hazleton JE. Novel mechanisms of central nervous system damage in HIV infection.HIV AIDS (Auckl). 2010，2:39-49.）。神经再生与HAND发生也有关系；宿主因素对HAND发生也有影响。

Tat是HIV-1 基因组编码的蛋白，具有神经毒性，是诱导HAND发生的重要因素。Tat可以通过N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体诱导神经元凋亡（Eugenin EA. HIV-tat induces formation of an LRP-PSD-95-NMDAR-nNOS complex that promotes apoptosis in neurons and astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 2007，104(9):3438–3443）；Tat还可以诱导星形胶质细胞凋亡，而星形胶质细胞对神经元有支持、营养和保护作用，其丢失和无能对神经损伤有重要作用；另外，Tat和HIV编码的Gp120蛋白能够刺激小胶质细胞和星形胶质细胞释放TNF-α、IL-1β破坏血脑屏障使更多的病毒或感染细胞进入脑内。Gp120且能通过神经元表面的CXCR4和CCR5直接诱导其凋亡； HIV的LTR，Nef，Vpr都有神经毒性，但现有研究结果表明其神经毒性可能远小于Tat和Gp120（Jayadev S. Host and viral factors influencing the pathogenesis of HIV-associated neurocognitive disorders.J Neuroimmune Pharmacol. 2009，4(2):175-89）。

在高效抗反转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy，HAART）推广前，15%HIV晚期感染者发生HAD，50%以上感染者发生某种形式HAND。HARRT治疗被广泛应用后，仍有50%感染者发生HAND。2010年针对1555名HIV感染者的调查表明，排除严重复合病例，ANI发病率为33%，MND 12%，HAD 2%（Heaton RK. HIV-associated neurocognitive disorders persist in the era of potent antiretroviral therapy: CHARTER Study.Neurology. 2010， 75(23):2087-2096）。HAART治疗降低了HAD发生率，但确诊后其死亡率很高（Lescure FX. Incidence and impact on mortality of severene urocognitive disorders in persons with and without HIV infection:a Danish nationwide cohort study.Clin Infect Dis. 2011 ，52(2):235-43），是艾滋病死亡一个独立的重要危险因素。在澳大利亚的调查表明，1993-1995年，HAD确诊后患者的平均生存期为11.9个月,中国患者HAD确诊后，平均生存期仅为4.7个月。

HARRT治疗延长了HIV感染者的生命，但感染者生命的延长以及HIV感染者的增加也使HAND患者数量逐步增加。目前，HAND仍没有特异、有效的治疗药物。为了延长HIV感染者生命、改善HIV感染者生活质量，必须针对感染所致神经损伤研发特异性药物。许多学者认为虽然有效HARRT治疗是必需的，但应辅以针对神经功能紊乱的治疗（Kathryn A. HIV-Associated Neurocognitive Disorder: Pathogenesis and Therapeutic Opportunities. J neurimmune pharamac，2010，5:294-309）。虽然已有新药用于HAND临床试验，有的效果令人失望，有的仍在实验进行（Kathryn A. HIV-Associated Neurocognitive Disorder: Pathogenesis and Therapeutic Opportunities. J neurimmune pharamac，2010，5:294-309）。

PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株，是一种类神经元细胞系，具有与神经元类似的生长特性，常用于神经退行性疾病的药物筛选、效果评价及机制研究。

中药丹参（Salvia miltiorrhiza）为唇形科鼠尾草属植物干燥的根及根茎，性微苦微寒，主要具有组织再生、活气化瘀、保肝消痛、安神宁心等功效。现代药理学研究表明：丹参具有清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应，发挥抗氧化作用。丹参的活性成分包括脂溶性的丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、红根草邻醌及丹参二醇和水溶性成分丹酚酸A、丹酚酸B、原儿茶醛等。其中丹参水溶性成分丹酚酸A能够显著地清除氧自由基。

丹参配方颗粒属于中药配方颗粒的一种，中药配方颗粒是依据原国家药品监督管理局印发《中药配方颗粒管理暂行规定》，由具备资质的企业依照《中国药典》现行版一部及部颁标准中药材项下炮制方法制备的中药提取颗粒剂，属于中药饮片管理范畴。目前，广州一方等多家单位获得批号生产丹参配方颗粒。

目前，虽有丹参和丹酚酸C抗HIV效果的报道，但抗HIV是指控制HIV在细胞内的复制以及在细胞间传播，这和本发明申请防治HIV所编码蛋白的神经毒性有根本不同。HIV是一种反转录病毒，可以整合到宿主细胞的基因组上，即使在病毒不复制时，甚至不存在具有感染能力的病毒颗粒时，其整合到宿主细胞基因组上的基因依然可以表达具有神经毒性的病毒蛋白，导致不同形式的HAND，而至今人们还没有找到能够清除整合有HIV基因组细胞的药物。由以上分析可以看出，HIV感染和HAND虽然有联系，但HAND有其独立的发病机制，是一个相对独立的神经识别与记忆障碍的疾病，减少HIV Tat蛋白的神经毒性将能够在一定程度上治疗HAND。有关丹参配方颗粒对HIV-1 Tat蛋白所致神经损伤的保护或在HAND治疗中的应用至今国内外并无相关报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种丹参配方颗粒在制备预防和治疗艾滋病脑病药物方面的应用，尤其是在预防和治疗HIV-1Tat蛋白所致神经损伤药物方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

丹参配方颗粒在制备预防和治疗艾滋病脑病药物方面的应用。

具体的，所述丹参配方颗粒在制备预防和治疗HIV-1Tat蛋白所致神经损伤药物方面的应用。

本发明的创新点在于发现了传统中药丹参配方颗粒的一种新用途，其对HIV-1 编码Tat蛋白所致神经损伤具有保护作用，可用于制备预防和治疗HAND的药物和保健品。

本发明将HIV-1Tat蛋白损伤类神经细胞系PC12和小鼠脑片上的神经细胞，用不同浓度的丹参配方颗粒进行保护，分别用MTT实验、LDH检测和Tunel标记实验检测丹参配方颗粒减少Tat蛋白所致神经元死亡的效果；用Dil金颗粒散射标记树突棘，检测丹参配方颗粒减少Tat蛋白损伤神经突触连接功能的效果。通过对对照组、Tat蛋白模型组和丹参配方颗粒药物保护组实验结果的统计学分析，发现丹参配方颗粒对Tat蛋白所致的神经元损伤具有很好的保护效果。

中国专利 “丹酚酸A冻干粉针用于制备抑制脑组织神经元损伤或死亡药物的用途”（申请号201210488012.4）中提到：丹参的水溶性成分丹酚酸A能够对脑血栓或脑血栓再灌注所致神经元的凋亡具有保护功能，然而该专利主要以人为制造脑血栓及脑血栓再灌注为模型，其所致神经损伤的机制在于脑血栓所致缺血、缺氧和出血。本专利申请与其不同在于： 1）Tat蛋白所致神经损伤机制及HAND发病机制与脑血栓所致神经损伤机制不同。脑血栓的诱因很多，形成栓塞的机制复杂，但其损伤神经的机制却较为明确，如同其申请书所述在于缺血、缺氧与出血；而Tat蛋白神经损伤及HAND发病机制非常复杂，至今未明，但显然和缺血缺氧所致神经损伤不同，如HAND发病与HIV蛋白影响神经元再生有关，与诱导胶质细胞凋亡也有关系。2）中国专利申请201210488012.4针对的是多因素导致的一种共同病理现象；本专利申请所述丹参配方颗粒的新用途具有明确的作用靶点和疾病种类。3）至今没有证据证明：HIV Tat蛋白或其它HIV蛋白能够导致脑血栓并进而损伤脑神经。4）本专利申请发现丹酚酸A可以增加被Tat蛋白减少的树突棘数量，保护突触连接功能；而中国专利申请201210488012.4仅仅以脑血栓缺血和再灌注所致神经损伤为模型，检测对其所致神经元凋亡的保护，没有对增加树突棘数量和保护突触连接功能进行分析。5）本专利申请发现了丹参配方颗粒具有控制Tat蛋白神经毒性的功能，丹参的药用成分非常复杂，发挥控制Tat蛋白神经毒性的有效成分可能是丹酚酸A，也可能是其它成分，如丹参酮ⅡA、红根草邻醌及原儿茶醛等。基于以上分析，可以发现本发明专利申请的是丹参配方颗粒一个完全不同的新药用功能。

艾滋病脑病（HAND）是世界公认的一个重大医学课题，其发病机制、诊断和治疗的研究都具有重要意义。本发明发现我国传统中药丹参配方颗粒对该病具有较好的治疗效果，将有可能在一定程度上解决这一重大问题，具有国际意义。如能公开并授权，将再次显示我国传统中药的优势和独特之处。

附图说明

图1为不同浓度丹参配方颗粒对PC12细胞存活率的影响（，n=3）；

图2为丹参配方颗粒对Tat蛋白损伤PC12细胞的保护作用（，n=3）；图中：##P<0.01与对照组相比；*P<0.05；* *P<0.01与Tat蛋白模型组相比；

图3为LDH法检测培养上清中乳酸脱氢酶活性（，n=3）；图中：##P<0.01与对照组相比；* *P<0.01与Tat蛋白模型组相比；

图4为Tunel检测丹参配方颗粒对Tat蛋白损伤脑片神经细胞的保护；图中A为对照组；B为Tat蛋白模型组；C为药物保护组；标尺=100μm；

图5为Tunel检测丹参配方颗粒对Tat蛋白损伤脑片神经细胞的保护（，n=3）；图中：##P<0.01与对照组相比；* *P<0.01与Tat蛋白模型组相比；

图6为DiI金颗粒散射标记树突棘的数量；图中A为对照组；B为Tat蛋白模型组；C为药物保护组；标尺=4μm；

图7为DiI金颗粒散射标记树突棘密度的数量（，n=3）；图中：##P<0.01与对照组相比；* *P<0.01与Tat蛋白模型组相比。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

（一）主要试剂、细胞和仪器

HIV-1 Tat蛋白购自深圳柏万森生物贸易有限公司（美国Prospec公司生产，批号:212PCLADEB28）；中药丹参配方颗粒购自广东一方制药有限公司（产品批号:1002014；用灭菌水配制成所需浓度）。大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株（PC12）购自中国科学院上海细胞所。MTT 购自Sigma公司（产品批号:MTBF7873V）；LDH（乳酸脱氢酶）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Tunel检测试剂盒购于美国promega公司（批号:0000073091）。灭活胎牛血清（批号:111023）购于杭州四季青生物工程材料有限公司；马血清（批号:841843）和DMEM培养基(批号:823186)及MEM培养基(批号:793870)均购自Gibco公司；其它试剂均为分析纯。酶标仪（美国BIOTEK公司）；奥林巴斯显微成像系统(Olympus，FV10)；Mcllwain组织自动切片机（CAMPDEN，220-240）；震荡切片机（LR59590，USA）。

（二）实验方法

1、实验设计与分组

实验共分为对照组、Tat蛋白模型组、药物作用组和药物保护组四个组，具体见表1。

表1 实验分组与设计

组别 培养液成份 对照组 培养基 Tat蛋白模型组 培养基+ Tat蛋白 药物作用组 培养基+丹参配方颗粒 药物保护组 培养基+ Tat蛋白+丹参配方颗粒

2、 MTT法检测丹参配方颗粒对PC12细胞存活率的影响

PC12细胞于含10%灭活胎牛血清、100U·mL-1青霉素和100μg·mL-1链霉素的DMEM培养基中，在37℃，5% CO2的培养箱中进行常规培养。取上述对数生长期的细胞，以5×103个/孔接种于96孔板中，细胞贴壁培养24h后，根据实验分组设计，药物作用组和药物保护组加入不同浓度的丹参配方颗粒；继续培养4h后，药物保护组和Tat蛋白模型组中加入Tat蛋白使其浓度为160µmol·mL-1；再继续培养24h，每孔加入20µl MTT（5mg·mL-1），37℃孵育4h，吸弃培养液，每孔加入150µl DMSO，振荡10min，采用酶标仪在570nm处检测OD值，从而计算出各组的活细胞数量。实验重复3次。

细胞存活率=（各组细胞A570/正常细胞A570）×100%。

、PC12细胞培养上清LDH检测

PC12细胞于含10%灭活胎牛血清、100U·mL-1青霉素和100μg·mL-1链霉素的DMEM培养基中，在37℃，5% CO2的培养箱中进行常规培养。待其生长至对数生长期，用胰酶消化，以5×103个/孔接种于96孔板中，细胞培养24h后，根据实验分组设计，药物保护组加入不同浓度的丹参配方颗粒，继续培养4h后，药物保护组和Tat蛋白模型组中加入Tat蛋白使其浓度为160µmol·mL-1；再继续培养24h，检测细胞培养上清中的LDH酶活性（细胞死亡时细胞内的LDH释放）。按照LDH试剂盒说明书进行操作，采用酶联免疫检测仪在450nm处检测OD值，并计算不同组别的LDH酶活性。实验重复3次。

、脑片上神经细胞凋亡检测

C57BL/6J小鼠麻醉，处死。取脑分离海马，用Mcllwain自动切片机沿冠状切面切片，厚350µm。将切片放在Millipore培养膜上，置于加有1mL培养液（50%MEM+25%Hank’s+25%马血清）的6孔培养板中。根据实验分组与设计，在药物保护组的培养基中加入丹参配方颗粒使其浓度为125μg·ml-1，于5% CO2、37℃的培养箱中培养4h；然后分别向Tat蛋白模型组和药物保护组加入Tat蛋白使其浓度为320µmol·ml-1，继续培养2d（1d更换一次培养液）。取出脑片，4%多聚甲醛4℃固定1d，振荡切片机再次切片，厚度为40µm。按照Tunel检测试剂盒操作检测神经细胞凋亡，简单步骤如下：将脑片放入20μg/ml的蛋白酶K溶液中室温孵育8min，PBS洗涤后置于载玻片上，加入平衡缓冲液室温放置10min，加入Tunel反应液，37℃避光放置60min，加入2×SSC，室温放置15min，PBS洗涤，DAPI甘油封片，激光共聚焦下观察拍照，统计，分析。

、树突棘定量分析

C57BL/6J小鼠麻醉，处死。取脑分离海马，用Mcllwain自动切片机沿冠状切面切片，厚350µm。将切片放在Millipore培养膜上，置于加有1mL培养液（50%MEM+25%Hank’s+25%马血清）的6孔培养板中。根据实验分组与设计，在药物保护组的培养基中加入丹参配方颗粒使其浓度为125μg·ml-1，于5% CO2、37℃的培养箱中培养4h；然后分别向Tat蛋白模型组和药物保护组加入Tat蛋白使其浓度为320µmol·ml-1，继续培养2d（1d更换一次培养液）。取出脑片， 4%多聚甲醛4℃固定1d，振荡切片机再次切片，厚度为40µm。参照Deng JB等（Deng JB, Yu DM, Wu P. Introduction of DiI diolistic assayto label the nervous cell and glia [J]. Acta Anat Sin (解剖学杂志), 2006, 37: 596−598.）的方法，利用DiI散射标记树突棘，简单步骤为：将需要标记的脑片放入6 孔培养板内，每孔5片，吸掉培养孔中的缓冲液,使切片处于近干状态。将DiI-金颗粒弹头放置于基因枪内，在氦气（180 P.S.i.）驱动下，将Dil-金颗粒散射到切片表面。经过DiI金颗粒散射后的切片用0.1mol·L−1 PBS漂洗3次后，保留于0.1mol·L−1PBS中，置于4℃冰箱内孵育24h。孵育后的切片用DAPI甘油封片，激光共聚焦下观察拍照。

（三）实验结果

1、MTT结果

1.1 不同浓度丹参配方颗粒对PC12细胞存活率的影响

丹参配方颗粒对PC12细胞的存活率没有影响，不同浓度的丹参配方颗粒药物作用组与对照组对比，细胞存活率没有统计学差异（P>0.05），结果见图1。

1.2 丹参配方颗粒对Tat蛋白损伤PC12细胞的保护

四个不同浓度丹参配方颗粒药物保护组（56.80±5.94%、66.92±0.79%、65.94±4.50%、70.51±3.67%）与Tat蛋白模型组（47.80±4.75%）相比，PC12细胞的存活率有明显提升（P<0.05），说明丹参配方颗粒对Tat蛋白所致的PC12细胞损伤有保护作用，且丹参配方颗粒浓度为125μg·ml-1时保护效果最好，详见图2。

2、LDH结果

当细胞受到损伤后LDH将释放到培养液中，培养上清中LDH活性检测结果显示Tat蛋白模型组培养液中的LDH活性（265.92±7.29）与对照组（89.26±9.29）相比，差异显著（P<0.01）；四个不同浓度的丹参配方颗粒药物保护组（251.30±8.10、185.42±14.77、115.07±6.74、81.19±12.58）与Tat蛋白模型组相比，有统计学差异（P<0.05），见图3。

3、Tunel检测结果

海马脑片经Tat蛋白诱导后与对照组相比，凋亡细胞明显增多（P<0.05）；经浓度为125μg·mL-1丹参配方颗粒保护后，与Tat蛋白模型组相比，凋亡细胞有明显减少（P<0.05），具体见图4和图5。

4、DiI金颗粒散射标记检测树突棘的数量

海马脑片经Tat蛋白诱导后与对照组相比，树突单位长度上树突棘的数量明显减少（P<0.05）；经浓度为125μg·ml-1丹参配方颗粒保护后药物保护组树突单位长度的树突棘数量与Tat蛋白模型组相比，树突棘密度增加，数量明显增多（P<0.05），具体见图 6和图7。

综上说明，传统中药丹参配方颗粒对于HIV-1Tat蛋白所致神经损伤具有很好的保护作用，可用于制备预防和治疗艾滋病脑病（HAND）的药物和保健品。