本发明涉及抗病毒组合物。
已知许多天然产物都具有驱虫剂性质。从某些禾本科植物获得的 香茅油就是这些天然产物的一个实例，而印度楝树油则是另一个实 例。以前我们对柠檬桉进行了研究并发现其具有驱虫剂性质。在富含 3，8-松油二醇(PMD)的部分中发现该驱虫性质。这在我们的 GB-A-2282534中已有描述。
在GB-A-1315625中，描述了某些松油二醇(p-menthane diol)(但 不是3，8-松油二醇(p-menthane-3，8-diol，PMD))提供生理性冷却效果的 用途。
EP-B-1204319描述了PMD作为杀菌剂和抗真菌剂的用途。
我们现在令人惊奇地发现，PMD还具有抗病毒性质。
根据本发明的一方面，我们提供PMD在生产用作抗病毒剂的药 物中的用途。
根据本发明的另一方面，我们提供PMD在生产破坏或灭活病毒 的药物中的用途。
根据本发明的另一方面，我们提供PMD在体外用作抗病毒或杀 病毒剂的用途。
根据本发明的另一方面，我们提供PMD在生产用于治疗由具有 脂质包膜的病毒引起的疾病的药物中的用途。
根据本发明的另一方面，我们提供一种面罩，其含有至少一个用 PMD浸渍或喷雾的保护层。
应理解，用于本说明书中的术语“杀病毒的”是指“具有破坏或 灭活病毒的能力”。还该理解，用于本说明书中的术语“抗病毒的” 是指“具有抑制或停止病毒生长和繁殖的能力”。PMD在本发明中 的用途可以是杀病毒的或抗病毒的。
用于本发明中的PMD可得自天然来源或可以是合成的，或是二 者的混合物。优选的天然PMD来源是柠檬桉植物柠檬桉。可以通过 任何途径，例如Zimmerman和English在J.A.C.S.75(1953)pp 2367-2370中描述的途径获得合成的PMD。PMD也是薄荷醇合成中 得到的前体。该前体通常以PMD的特定异构体形式存在。
用于本发明中的PMD可以是该化合物的基本纯的形式，或者是 例如来自天然来源的粗提物。粗提物的实例是通过对柠檬桉油进行酸 修饰从柠檬桉中得到的富含PMD的提取物。还可以通过对以高浓度 存在于柠檬桉油(大约75重量％)中的香茅醛进行环化来制备PMD。 我们从含有PMD两种几何异构体的柠檬桉油中获得了富含PMD的 提取物，通常在该提取物中PMD为约64重量％。所述粗提物还包括 香茅醇和异蒲勒醇以及某些其它少量成分。
因此，根据本发明，涵盖可以以富含PMD提取物的形式来提供 用于本发明的PMD，所述富含PMD的提取物得自天然柠檬桉油。这 类粗提物的一个实例可以以商标“Citriodiol”获得。在本发明中 Citriodiol可用作PMD的来源。
根据本发明使用的组合物通常包含PMD和载体。PMD难溶于 水，所以优选使用油作为载体，或使用用于水基组合物的溶剂例如乙 醇。
已知PMD以两种几何异构体形式存在，即顺式和反式异构体。 PMD总共有8种异构体，如图1所示。本发明包括任何单个的一种 异构体，也包括一种或多种异构体的任意组合。
我们的实验工作基于98％纯的顺式异构体。然而，应理解，所要 求保护的PMD活性对其所有异构体形式而言都是共有的。因此，可 以以单个纯的顺式或反式异构体的形式，或以每种异构体任意适当比 例的异构体混合物的形式使用PMD。PMD通常以顺式∶反式为约2∶1 的混合物形式进行制备，且该混合物是完全可接受的。然而，也可以 使用顺式和反式异构体50∶50的混合物，同样也可以使用其它比例的 混合物。
在一个实施方案中，用于本发明的组合物仅包含一种PMD异构 体和用于其的载体。
在另一个实施方案中，用于本发明的组合物中的顺式∶反式PMD 异构体的相对量根据需要变化。这可以通过预先以适当的比例混合单 独的异构体，或通过调整从天然得到的PMD或从合成来源得到的 PMD混合物的比例来进行。
在测试中，我们发现PMD针对流感是有效的，如PMD对抗流 感病毒A/Sydney/5/97的效果所例证。我们还发现PMD针对Urbani 严重急性呼吸综合征(Urbani SARS)和由1型单纯疱疹病毒(HSV-1)引 起的疱疹是有效的。PMD还可用于治疗2型单纯疱疹病毒(HSV-2)。
因此，在本发明的实施方案中，PMD用于治疗流行性感冒。在 另一个实施方案中，PMD用于治疗由病毒A/Sydney/5/97引起的流感。 在另一个实施方案中，PMD用于治疗Urbani SARS。在另一个实施 方案中，PMD用于治疗由1型单纯疱疹病毒(HSV-1)引起的疱疹。
包括A/Sydney/5/97以及属于A型和B型流感病毒在内的流感病 毒、Urbani SARS和1型单纯疱疹病毒都具有脂质包膜。其它具有脂 质包膜的病毒的实例包括冠状病毒(Urbani SARS是其中之一)、2-型 单纯疱疹病毒(HSV-2)、人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒、丙型 肝炎病毒、西尼罗病毒、疱疹性口腔炎病毒、辛德毕斯病毒和仙台病 毒。
本发明的用途可适用于进行表面消毒，例如在医院的房间或病房 中进行表面消毒。在这些情况下，将PMD施用于所述表面。优选地， PMD在溶液中或以于适宜的液体载体中的乳液存在。最希望地，将 PMD配制成供喷雾施用。例如，可将PMD或Citriodiol溶解于适宜 的溶剂或溶剂混合物中。例如，在一个实施方案中，可以以鼻喷雾剂 的形式提供PMD；在另一个实施方案中，可以以用于电话的喷雾剂 的形式提供PMD。
在一种施用模式中，所述喷雾是静电喷雾。对静电喷雾而言，如 对本领域技术人员而言清楚的那样，所述溶剂或溶剂系统将需要适于 静电喷雾。优选使用导电和非导电溶剂的混合物来获得对所述喷雾喷 嘴具有适当电阻率的可喷雾溶液，但是也可以使用适宜的一种溶剂。 含有PMD的所述组合物的荷电颗粒作为细雾喷出，且因为所有的颗 粒都带有相似的电荷，例如正电荷，所以它们相互排斥，但是吸引在 带相反电荷的表面上。通过这一喷雾手段，可在表面上获得所述组合 物非常好的覆盖。用于对本发明的组合物进行静电喷雾的装置是本领 域技术人员已知的。
为提高荷电颗粒覆盖皮肤表面的可能性，可对所述静电喷雾喷嘴 进行所需要的调节以对厨柜或容器的内部进行喷雾，如同将手引入其 中一样。
还可以使用静电喷雾或简单的雾化喷雾，例如用于将含有PMD 的组合物分配到个体手(或其它部分)上。例如，分配器的启动可以通 过红外传感器的方式，因此所述个体不需要接触表面，从而没有病毒 向其手或从其手转移的风险。当抗病毒剂的基本均一的覆盖特别重要 时，例如在手术前“彻底清洗”过程中对外科医生而言，可以有利地 使用对手的喷雾施用。
根据本发明，除了溶剂和/或其它液体载体之外，通过喷雾等施 用于表面的液体还可包含对于目的所需或期望的其它成分。因此，还 可以包含第二种或另外的抗病毒剂，也可以包含表面活性剂、香味剂 等。一般而言，所述组合物与用于所述目的的已知组合物是一样的， 只是其另外含有PMD或者以PMD全部或部分取代一种或多种其它 成分。
具有抗病毒效果所需要的PMD量可以随病毒不同以及与病毒接 触时间不同而变化较大。因此，我们证明10秒的接触时间，针对 A/Sydney/5/97流感病毒，至少1％w/v浓度的PMD期望具有显著的 抗病毒作用，而对Urbani SARS而言，甚至0.25％，接触10秒也是 有效的。相反，在我们的实验室测试中，对于5分钟的延长接触时间， 至少需要1％/w/v PMD期望对疱疹病毒HSV-1具有显著的效果。因 此需要进行常规实验来确定对任何特定病毒的最适PMD浓度和最适 接触时间。
PMD还可以作为抗病毒剂包含在家用洗涤剂、清洁剂和乳膏， 例如洗衣粉或调理剂以及护手凝胶中。此外，PMD还可包含在用于 所述目的的其它标准或已知组合物中。PMD可以是额外成分或标准 成分的部分或完全替代。所述组合物可能已经含有抗病毒剂，将PMD 加入获得额外的抗病毒效果。
此外，可以将PMD浸渍入易于病毒感染并使居民具有感染风险 的家用物件，例如抹布、塑料肥皂器皿、用于制备食物的表面中。
为这些目的，可在生产所述物件中将PMD包含在例如用于塑料 模压等的混合物中，或可在生产后例如通过将抹布浸泡在PMD中来 将其施用于物件上。PMD在物件表面的存在将提供所需要的抗病毒 效果。对工作表面而言这是尤其有用的，不过这些表面也可以通过喷 雾等用PMD进行常规处理。
因此，根据本发明的另一方面，提供了在表面上破坏或灭活病毒 的方法，其包括对其施用PMD，其中所述表面不是人体或动物体表 面。所述表面可以在房屋或建筑物的墙壁、地板、天花板或其它结构 部分上；或在设备或仪器上；或可以是工作表面。可以通过喷雾或静 电沉积施用PMD或PMD组合物。所述表面可以是手套的表面。
根据本发明的另一方面，提供PMD在家用产品，例如洗涤剂、 清洁剂或乳膏中的用途，以提供抗病毒或杀病毒性质。
根据本发明的另一方面，提供PMD作为抗病毒剂或杀病毒剂在 消毒手术洗涤液中的用途。
可以在生产中将PMD喷雾到面罩材料上或将PMD浸渍入这些 材料中以防止活的病毒颗粒朝向或远离所述个体的进出。因此，可保 护所述个体免受来自其它感染个体传来的病毒感染，或可使用所述面 罩防止其本人传染给其它人。针对那些通过液滴喷雾或气雾传播的病 毒而言，这是尤其有效的。PMD喷雾可施用于所述面罩的外侧或内 侧或两侧。在由可更换的过滤器制造的面罩中，可以相似地在生产中 对所述过滤器进行喷雾或浸渍以使得以最经济有效的方法进行补充。 这将特别适用于现在被设计得非常吸引人的面罩，并通过可更换的过 滤器重复使用。还有可能对公共使用频繁的宾馆或飞机或其它交通工 具中的空调系统内的过滤器进行浸渍。
根据本发明的面罩可以是常规用于保护使用者免受周围空气中 有害物质侵害的任何面罩。通常，所述面罩包括至少一个过滤层以及 将所述面罩固定于使用者面部的装置。在一个实施方案中，所述固定 装置可包括适合伸展围绕使用者背部或头部，或适合固定在使用者耳 部的带子；所述带子可以是弹性材料，所以所述面罩可容易地适合于 多种不同个体。所述面罩可以具有多于一层的过滤层。
在许多情况下，期望在面罩中包含柔性的鼻条。鼻条的目的是使 面罩的形状符合鼻子的轮廓，以降低空气绕过面罩材料的可能性。通 过确保佩戴者通过面罩材料呼吸，具有这种条的面罩更有效地防止液 滴的进出。所述条可以是由铝形成的，通常的长度为约50mm。
虽然PMD浸渍的面罩的主要用途是提供针对病毒的防护，但是 要注意PMD也是抗细菌剂和抗真菌剂(参见EP-B-1204319)，因此所 述面罩也可以有效地防止细菌或真菌物质的进出。
本发明还提供制备有效防止病毒进出的面罩的方法，所述方法包 括用PMD或含有PMD的组合物喷雾所述面罩或浸渍所述面罩。
此外，还可以将PMD加入预湿的揩巾中用于例如清洁面罩、马 桶坐圈、门把手或电梯按钮。
含有PMD的组合物还可用于医学中。因此，本发明包括用于抗 病毒或杀病毒的含有PMD和药学可接受的载体的药物制剂。例如， 所述药物组合物可施用于破损皮肤或内部粘膜。其还可以是于润喉片 或锭剂或其它用于摄入的制品中的成分。在医学用途中，可以将PMD 与载体配制成乳膏，或者如上所述配制成润喉片或锭剂。为控制或消 除可以引起常规全身效应的病毒，可将含有PMD的组合物施用于鼻 的可接近的内表面。为这些目的，PMD可配制成鼻喷雾剂。另一个 特定的医学用途是在手术例如对腹膜腔进行手术期间冲洗伤口中使 用。
在一种有利的制剂中，PMD与石油膏一起配制成软膏，优选适 用于局部给药的软膏。
如对本领域技术人员而言清楚的，作为抗病毒或杀病毒剂的 PMD具有众多的医学用途。一般而言，不要求对于这些目的的新制 剂：因为采取已知或标准的组合物并将PMD包含在内是足够且令人 满意的。或者，可用PMD适宜地替代一种或多种成分。本领域技术 人员将清楚地知道各种组合物的组成，因此在此并不需要进一步的赘 述。
PMD是以商品名“MosiguardTM”销售的驱虫剂中的活性成分。 已经进行了大量的测试来向管理机构证明含有约64％PMD的 CitriodiolTM是无毒的。Mosiguard驱虫剂已销售约10年，还没有其明 显毒性的报道。因此，可能PMD的医学用途可以是局部或全身的。 可以通过口服剂型或肠胃外途径，例如通过静脉内、肌内或皮下注射 进行全身给药。
通常，根据本发明将PMD用于多种载体中，所述载体取决于所 欲用的特定用途。该载体可以包括例如固体、液体、乳液、泡沫剂和 凝胶。
通常的载体包括水溶液或醇溶液、油、脂肪、脂肪酸酯、长链醇 和硅油、微细固体如淀粉或滑石、纤维素材料以及气雾剂抛射剂。局 部组合物包括例如香料、散剂及其它化妆品、洗剂、擦剂、油和软膏。 化妆品一般包括例如美容水、剃须皂、唇膏、乳膏、泡沫剂、花露水、 除臭剂、止汗剂、固体古龙香水(solid cologne)、香皂、沐浴油和沐浴 盐、洗发剂、面霜和护手霜、擦拭纸、漱口水、滴眼剂。药物和联合 组合物包括例如软膏、洗剂、血管收缩剂和润喉片。将对存在于所述 组合物中的PMD的量进行选择以得到所期望的效果，但是我们认为 一般高至5.0wt％，优选0.25wt％至5.0wt％将是令人满意的。可以 使用更高的量。特别优选的浓度是1.0wt％至3.0wt％，尤其是约2 wt％。
可以从富含PMD的物质例如桉树植物的叶子中获得富含PMD 的提取物。富含PMD的优选来源可通过将得自植物的柠檬桉油和稀 硫酸(通常5％硫酸)一起搅拌来获得，如前述在我们的GB-A-2282534 中所解释的。
为更充分地理解本发明，仅以例示的方式给出以下实施例。
现参照附图进行描述，其中：
图1例示PMD的八种异构体。
图2例示用不同浓度的PMD处理后不同接触时间的HSV-1病毒 的病毒滴度的对数降低。
图3例示用不同浓度的PMD处理后不同接触时间的Urbani SARS病毒的病毒滴度的对数降低。
图4例示用不同浓度的PMD处理后不同接触时间的 A/Sydeny/5/97病毒的病毒滴度的对数降低。
进行了三组实验：第一组实验是针对流感病毒A/Sydney/5/97(实 验1)；第二组实验是针对三种病毒，即A/Sydney/5/97、Urbani SARS 和HSV-1(实验2)；而第三组实验是当施用于面罩时，PMD针对流 感A病毒和Urbani SARS病毒的杀病毒活性。
实验1
方法1
PMD急性毒性测定的方法
测定在细胞维持培养基中的下述浓度的PMD对MDCK细胞的 细胞系的毒性：
●2.5mg/ml(0.25％w/v)
●5mg/ml(0.5％w/v)
●20mg/ml(2％w/v)
采用相同的方法(步骤2-6)，但是用细胞维持培养基替换PMD对 仅有细胞的对照进行实验。
使用毒性诱导CPE(致细胞病变效应)观测来确定毒性，使用显微 技术进行肉眼计数。毒性诱导CPE特征为破裂或圆形的细胞，所述 细胞与其相邻细胞分离，或以细胞碎片存在。毒性诱导CPE计数作 正的(观察到毒性)或负的(未观察到毒性)。
(1)将200μl各种PMD稀释液加入200μl细胞(2×106细胞/ml) 中，并在室温下温育反应5分钟。
(2)通过加入3.6ml适合于所述细胞系的细胞维持培养基以终止 反应。
注：反应终止是由于加入细胞维持培养基，其将反应物稀释10 倍。
(3)将100μl所述终止反应物加入48孔板上的相关孔中，并在 37℃、5％CO2下温育24小时。
注：测定剩余终止反应物的pH水平。
(4)将48孔板中的细胞用胰酶消化，并使用锥虫蓝染料对活细 胞进行计数。与仅有细胞的对照相比，使用活细胞的百分数来确定 PMD的毒性浓度。
方法2
PMD杀病毒测定的方法
使用四种不同浓度的PMD进行杀病毒测定，该四种浓度都未表 现出毒性(基于1中所述的方法获得)。
该四种浓度如下：
●2％w/v(20mg/ml)
●0.5％w/v(5mg/ml)
●0.25％w/v(2.5mg/ml)
●0.1％w/v(1mg/ml)
病毒储备液以大于104TCID50/ml的滴度使用。
适宜的阳性抗病毒对照化合物是柠檬酸。
通过感染诱导CPE观测来确定病毒感染的存在与否，使用显微 技术进行肉眼计数。感染诱导CPE在病毒间有差异，但一般的特征 是与保持其相邻的细胞相连的气球状或圆形细胞。其计数作正的(感 染明显)或负的(感染不明显)。
(1)根据现有的Retroscreen Virology Ltd.SOP将MDCK细胞在 96孔板上培养。
(2)将40μl A/Sydney/5/97病毒加入360μl各种PMD稀释液和 柠檬酸中。
注：在这一步骤中将病毒稀释10倍。
(3)将反应物在室温下温育以下接触时间：
●10秒
●30秒
●1分钟
●5分钟
(4)在每个接触时间点，加入3.6ml适合于所述细胞系的感染培 养基以终止反应。
注：反应终止是由于加入了感染培养基，其将所述反应物稀释 10倍。
(5)将100μl所述终止反应物加入96孔板的第1列(在第1点中 制备)中，并以1/10的稀释系列在培养板上对其进行滴定。
注：剩余的终止反应物用于测定pH水平。
(6)将所述细胞在37℃、5％CO2下培养3-5天。
(7)每天对所述板进行CPE计数以确定感染存在与否。还确定病 毒滴度的下降(作为PMD和阳性对照化合物、柠檬酸的抗病毒活性的 结果)。
结果表明对MDCK细胞使用流感病毒A/Sydney/5/97，如细胞存 活所证明的，用于培养基中的2％w/v PMD没有病毒复制。在较低浓 度(0.5％、0.25％和0.1％)下细胞被杀死，这表明在这些水平没有杀病 毒效应。
实验2
方法1
PMD急性毒性测定的方法
用于该研究的病毒为：
●HSV-1(1型单纯疱疹病毒)
●Urbani SARS
●A/Sydney/5/97(人流感病毒H3N2)
以下列浓度对PMD进行测试：
●2％w/v(20mg/ml)
●1％w/v(10mg/ml)
●0.5％w/v(5mg/ml)
●0.25％w/v(2.5mg/ml)
适用于每种病毒的细胞系在表1中显示。 表1：病毒及其适宜的细胞系 病毒 细胞系 HSV-1 Vero Urbani SARS C1008 A/Sydney/5/97 MDCK
在100％异丙基中配制每种浓度的PMD，随后加入足量的细胞感 染培养基，使得异丙基的终浓度总是10％。
通过考虑在毒性测定(步骤1)和杀病毒测定(步骤4)中出现的化合 物的起始稀释度配制不同的浓度。对这两种测定的稀释倍数分别为2 和1.1。表2详细地给出了用于这两种测定的起始PMD浓度。 表2：毒性测定和杀病毒测定的起始PMD浓度 以及用于每种测定的化合物的稀释倍数 PMD终浓度 (％w/v) PMD起始浓度(％w/v) 毒性测定 杀病毒测定 0.25 0.5 0.28 0.5 1 0.56 1 2 1.11 2 4 2.22
对所述三种细胞系中的每一种进行所述四种PMD浓度中的每一 种浓度的测试。
根据相同的方法进行“仅有细胞”的对照实验，不过用感染培养 基替换PMD(步骤1)。
毒性测定的方法如下：
(1)将2×106细胞/ml的细胞(200μl)加入PMD(200μl)中，并将 反应物在室温下温育5分钟。
(2)通过加入适合于所述细胞系的感染培养基(3.6ml)以终止反 应。
(3)将所述终止反应物(100μl)加入24孔板中的相关孔中，重复3 次。
(4)将所述细胞在37℃、5％CO2下温育24小时。
(5)温育完成后，对细胞进行胰酶消化，将合适的3个复孔合并 在一起，并使用锥虫蓝染料对活细胞进行计数。
(6)与对照细胞相比，通过计算测试细胞中的活细胞百分数来确 定PMD的毒性。
不同浓度的PMD的毒性测定结果显示在表3中。 表3：用10％异丙基或3种不同浓度的PMD处理的 3种不同细胞系的细胞存活百分数 细胞系 *细胞存活百分数(％) 10％异丙基 PMD浓度(％w/v) 0.25 0.5 2 C1008 100 80 60 100 MDCK 40 40 100 85 Vero 100 65 65 100
*所述值对于最接近5的进5
对10％异丙基的毒性进行测试以排除其在PMD的最终制剂中作 为毒性成分的可能。
在该测定法中未对1％w/v PMD的浓度进行测试。
方法2
PMD杀病毒测定的方法
在杀病毒测定法中使用两类对照：
●阳性抗病毒对照化合物(详见表4)
●稀释液对照-10％异丙基—在每种PMD浓度制备中用作溶 剂。因此，必须确保该试剂针对任何病毒都不具有杀病毒活性。 表4：用于杀病毒测定的病毒及其适宜的阳性对照化合物 病毒 阳性对照化合物 HSV-1 100％DMSO Urbani SARS 1％Triton-X A/Sydney/5/97 柠檬酸盐缓冲液，pH 3.5
测试非毒性PMD浓度针对所述三种病毒中的每一种的杀病毒活 性。
每种病毒储备液以至少103 TCID50/ml的滴度使用。
杀病毒测定的方法如下：
96孔板的制备
1)将每种细胞系(3×105细胞/ml)接种于96孔板上并温育24小时 或直至它们达到80％汇合。
2)去除培养板中的维持培养基并用PBS洗涤所述单层细胞。
3)向培养板中加入适合于每种细胞系的感染培养基(100μl)。
杀病毒反应物的制备
4)如方法1中所述，向每种浓度的PMD(360μl)中加入病毒(40 μl)。
5)将测试反应物在室温下温育以下接触时间：
●10秒
●30秒
●60秒(1分钟)
●300秒(5分钟)
6)在每个接触时间之后，加入适合于所述细胞系的感染培养基 (3.6ml)以终止反应。
滴定和温育
7)去除在96孔板的第一列孔中的感染培养基(在步骤1-3中制 备)，并用终止反应物(110μl)代替，重复两次进行铺板。
8)然后以10倍稀释系列在培养板上对终止反应物进行滴定。
9)将细胞在37℃、5％CO2下温育5天。
10)从感染后3天每天进行CPE计数，直到感染后5天。此外， 在感染后5天仅对A/Sydney/5/97杀病毒测定进行血细胞凝集反应测 定。
11)通过与“仅有病毒”的对照进行比较，计算每种浓度的PMD 以及对照化合物在每个时间点病毒滴度的任何降低。
12)还对抗病毒对照物质和10％异丙基进行了该测定，接触时间 为5分钟。
表5、6和7分别显示对HSV-1、Urbani SARS病毒和 A/Sydney/5/97的杀病毒测定结果。
该结果显示在不同浓度的PMD存在下对于不同的接触时间每种 病毒的病毒滴度的对数下降。
1 log10 TCID50/ml或更大的下降被认为对于该测定法是具有显著 性的(Oxford，J.S.等，1994)，其相当于病毒滴度下降90％。 表5：用不同浓度的PMD处理后不同接触时间的 HSV-1病毒滴度的对数下降 PMD浓度 (％w/v) 病毒滴度的对数下降(-log10 TCID50/ml) PMD接触时间(秒) 10 30 60 300 0.25 0 0 0 0.5 0.5 0 0 0 0 1 0 0.5 0.5 1.5 2 0 0 0.5 2.5
1分钟
5分钟
表6：用不同浓度的PMD处理后不同接触时间的 Urbani SARS的病毒滴度的对数下降 PMD浓度 (％w/v) 病毒滴度的对数下降(-log10 TCID50/ml) PMD接触时间(秒) 10 30 60 300 0.25 1 2 1.5 2 0.5 1.5 2.5 2.5 2.5 1 2 1.5 2 1.5 2 1.5 1 1.5 1.5
1分钟
5分钟
表7：用不同浓度的PMD处理后不同接触时间的 A/Sydney/5/97的病毒滴度的对数下降 PMD浓度 (％w/v) 病毒滴度的对数下降(-log10 TCID50/ml) PMD接触时间(秒) 10 30 60 300 0.25 0.4 1.9 1.9 1.4 0.5 0.4 1.9 2.4 1.9 1 1.9 2.4 2.4 2.4 2 1.9 2.4 2.4 2.4
1分钟
5分钟
不同浓度的PMD的杀死率如图8所例示。
没有给出0.25％w/v和O.5％w/v浓度的PMD针对HSV-1的杀 死率是因为该病毒的杀病毒测定结果显示所述化合物在这些浓度时 没有表现出任何的抗病毒活性。
表8：不同浓度的PMD对Urbani SARS病毒、A/Sydney/5/97病毒 和HSV-1病毒的杀死率 PMD浓度 (％w/v) 杀死率(-log10 TCID50/ml/分钟) HSV-1 Urbani SARS A/Sydney/5/97 0.25 - 4.0 4.5 0.5 - 6.0 4.8 1 0.3 6.0 12.0 2 0.5 6.0 12.0
杀死率值是从图2、图3和图4作图得到的线的梯度计算而来， 这些线图示地分别代表对HSV-1、Urbani SARS病毒和A/Sydney/5/97 进行杀病毒测定得到的结果。这些图显示在不同浓度的PMD存在下 随时间这些病毒的病毒滴度的对数降低。
图3和图4没有显示5分钟接触时间的数据点，因为在这一时间 点时所述结果已到平台期并且没有显示进一步显著的改变。
在大约1-log10 TCID50/ml点或之后对所述线梯度进行测定是因 为认为在该点之前的数据对所述杀病毒测定没有显著性。
结果
HSV-1杀病毒测定
表5中的结果表明PMD针对HSV-1的杀病毒活性具有时间和浓 度依赖性。
仅在5分钟接触时间时对1％w/v和2％w/v浓度观察到病毒滴 度有显著性降低。对所有其它浓度和接触时间而言，没有观察到显著 的病毒滴度降低。
虽然PMD针对HSV-1的杀死率没有对Urbani SARS和 A/Sydney/5/97病毒的杀死率那么高，但其遵循随PMD浓度增高而杀 死率增高的相同趋势。如表8中所示，当浓度从1％w/v增加至2％w/v 时，PMD对HSV-1的杀死率几乎加倍。
在1分钟和5分钟时间点之间对HSV-1的杀死率进行测定。图2 例示1分钟和5分钟的时间点之间对数降低的逐渐增加。
Urbani SARS杀病毒测定
表6表明在所有接触时间所有四种浓度的PMD表现出病毒滴度 的显著降低。其还表明所述化合物针对所述病毒既没有表现出时间依 赖性也没有表现出浓度依赖性的活性。
如表8所示，PMD针对Urbani SARS病毒的杀死率是高的。然 而，无论是增加PMD的浓度还是接触时间都没有提高PMD作为杀 病毒剂的效果，因为每种浓度产生相似的杀死率。
A/Sydney/5/97杀病毒测定
表7中的结果表明除了在10秒接触时间时在0.25％w/v和0.5％ w/v外，PMD在所有测试浓度下均显著地降低A/Sydney/5/97感染。
在所有接触时间点1％w/v和2％w/v浓度降低病毒滴度1.9-2.4 log10 TCID50/ml，而两种较低浓度则仅在30秒至5分钟的接触时间时 实现该效果。
表8显示在1分钟内A/Sydney/5/97的杀死率。所有浓度的PMD 的杀死率都是高的，几乎从0.5％w/v浓度至1％w/v浓度增至三倍。
实验3
将Mosi-guardTM用作PMD来源。
用于测试的四种面罩为：
■GR8-1：Tecnol″Fluidshield″PFR95(N95 Particulate Filter Respirator)由Kimberley-Clarke Corp.生产
■GR8-2：由Kyrura Co.生产的日本面罩
■GR8-3：中国面罩，薄纱型(gauze type)
■GR8-4：中国面罩，薄纱型
面罩GR8-3和GR8-4购自中国北京的当地商店。
该实验中使用的对照为：
■仅有细胞的对照---(在没有病毒存在下)仅用感染培养基 (A/Sydney/5/97杀病毒测定)或细胞维持培养基(Urbani SARS杀病毒 测定)温育的细胞。这是对于tCPE(毒性细胞致病作用)和vCPE(病毒 性细胞致病作用)的阴性对照。其也是细胞质量的指示剂。
■细胞毒性对照---(在没有病毒存在下)用经Mosi-guardTM处理的 面罩过滤的感染培养基(A/Sydney/5/97杀病毒测定中使用的vera细胞) 或细胞维持培养基(Urbani SARS杀病毒测定中使用的C1008细胞)温 育的细胞。这是对于由Mosi-guardTM引起的tCPE的阳性对照。
■仅有病毒的对照---用未经面罩过滤的病毒温育的细胞。这是对 于vCPE的阳性对照。其也是储备液滴度的指示剂。
■仅有面罩的对照---用未经Mosi-guardTM处理的面罩过滤的病毒 温育的细胞。这是对于病毒吸附面罩的阳性对照。
■抗病毒对照---用未经面罩过滤的病毒温育但用pH 3.5柠檬酸 盐缓冲液(流感A/Sydney/5/97杀病毒测定)或1％triton X-100/20％乙 醇/PBS(Urbani SARS杀病毒测定)进行过预处理的细胞。其是测物品 的阳性对照。
用于本研究的病毒及其适宜的细胞系显示在表9中。它们由 Retroscreen Virology Ltd病毒储藏和细胞培养物储存机构供应。
表9病毒及其适宜的细胞系 病毒 储备液滴度 (TCID50/ml)∞ 细胞系 流感A/Sydney/5/97 103 Vero Urbani SARS病毒 104 C1008
∞来自于病毒对照滴度
方法
该方法分两阶段：
■第一阶段---针对流感A/Sydney/5/97进行测试确定温育时间和 Mosi-guardTM喷雾的适宜的数量以在针对Urbani SARS病毒的测试中 使用。
■第二阶段---使用由第一阶段方法验证的比例测试Urbani SARS 病毒。
第一阶段
vero细胞的制备
1)将细胞(100μl/孔)以1×105细胞/ml接种于96孔板上并在37 ℃下温育～24小时。
2)去除培养板上的维持培养基并用PBS(100μl/孔)洗涤单层细 胞两次。
3)向外侧的孔中加入PBS(200μl/孔)并向其余的孔中加入感染 培养基(100μl/孔)。
Mosi-cuardTM的加入和温育
4)从～15cm的距离处用Mosi-guardTM对每个面罩喷雾1次。
5)将每个面罩放置在单个高压灭菌的纸袋中并在37℃下温育～ 8小时。
病毒的过滤和滴定
6)从每个面罩上剪下测量为2cm直径的喷雾区并将其插入过滤 器架(25mm直径，Swin-LokTM塑料过滤器架)中。
7)使用由150g质量施加的压力通过每个面罩过滤病毒(2ml)。 这通过在注射器上放置150g重量来进行。
8)将过滤的病毒(111μl/孔)和病毒对照加入96孔板中，重复四 次，并以10倍稀释系列在培养板上对其进行顺序滴定。病毒对照由 病毒储备液组成，将其直接加入培养板中。
9)将培养板在37℃下温育4-5天。
10)在滴定后3-5天进行vCPE计数。
血细胞凝集反应测定
11)在温育最后一天，按照Retroscreen Virology Ltd SOP VA018-02对所有培养板进行HA(血细胞凝集反应)测定。
第二阶段
以与第一阶段相同的方式进行，除以下不同以外：
■使用C1008细胞，并以1.5×105细胞/ml进行接种(步骤1)。
■用Mosi-guardTM对面罩喷雾3次(步骤1)。
■不用PBS洗涤细胞，随后也不使用感染培养基(步骤2和3)。 在标准细胞维持培养基存在下可发生Urbani SARS病毒感染。
■因为Urbani SARS病毒不具有对流感病毒特异的血凝素蛋白， 所以没有进行HA测定(步骤11)。仅进行了vCPE观测。
结果
细胞毒性测定
使用Mosi-guardTM对四种不同类型的面罩喷雾一次，然后在37 ℃下温育～8小时。将适合于所述细胞系的细胞培养基通过每个面罩 的部分进行过滤，并将滤液接种在vero和C1008细胞中，然后以10 倍稀释系列在培养板上对其进行顺序滴定。将这些细胞温育1天 (C1008细胞)和3天(vera细胞)，然后对它们进行观察和tCPE计数。 这些结果分别显示在表10和11中。
表10在对每种面罩进行Mosi-guardTM 1×喷雾后
对C1008进行细胞毒性测定 稀释系列 (10-x) 在37℃处理后1天tCPE计数 面罩 GR8-1 GR8-2 GR8-3 GR8-4 0 1 2 3 4 5 T T - - - - T - - - - - T - - - - - T - - - - -
T观察到毒性
-未观察到毒性
表11在对每种面罩进行Mosi-guardTM 1×喷雾后
对vero细胞的细胞毒性测定 稀释系列 (10-x) 在37℃下处理后3天的tCPE计数 面罩 GR8-1 GR8-2 GR8-3 GR8-4 0 1 2 3 4 5 T - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
T观察到毒性
-未观察到毒性
流感A/Sydney/5/97的杀病毒测定
下表显示在通过用Mosi-guardTM喷雾一次处理或未处理的不同 类型的面罩过滤后，然后在37℃下温育～8小时后流感A/Sydney/5/97 病毒的病毒滴度的对数降低。
对于该测定法认为≥1-log10 TCID50/ml的降低(Oxford，J.S.等， (1994)Antiv Chem Chemother 5(4)：176-81)是具有显著性的，其相当于 病毒滴度降低≥90％。
在这一模型中认为该测定的灵敏度阈值为0.25-log10 TCID50/ml。
表12 用经Mosi-guardTM处理的面罩过滤后
流感A/Sydney/5/97病毒滴度的对数降低 面罩 病毒滴度(log10 TCID50/ml) 病毒滴度的 对数降低 (-log10 TCID50/ml) 用Mosi-guard处理 病毒对照 GR8-1 GR8-2 GR8-3 GR8-4 1.25 2.50 2.50 2.50 2.50 3.50 3.50 3.50 1.25 1.00 1.00 1.00
直接加入培养板中的病毒储备液
表13 用未经Mosi-guardTM处理的面罩过滤后
流感A/Sydney/5/97病毒滴度的对数降低 面罩 病毒滴度(log10 TCID50/ml) 病毒滴度的 对数降低 (-log10 TCID50/ml) 用Mosi-guard处理 病毒对照 GR8-1 GR8-2 GR8-3 GR8-4 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 ＜0.25 ＜0.25 ＜0.25 ＜0.25
直接加入培养板中的病毒储备液
Urbani SARS病毒的杀病毒测定
表14和表15显示在通过用Mosi-guardTM喷雾三次处理或未处理 的一种类型的面罩过滤后，然后在37℃下温育～8小时后Urbani SARS病毒的病毒滴度的对数降低。
对于该测定法认为≥1-log10 TCID50/ml的降低(Oxford，J.S.等， (1994)Antiv Chem Chemother 5(4)：176-81)是具有显著性的，其相当于 病毒滴度降低≥90％。
在这一模型中认为该测定的灵敏度阈值为0.25-log10 TCID50/ml。
表14 用经Mosi-guardTM处理的面罩过滤后
Urbani SARS病毒滴度的对数降低 面罩 病毒滴度(log10 TCID50/ml) 病毒滴度的对数降低 (-log10 TCID50/ml) 使用Mosi-guard处理 病毒对照 GR8-1 2.75 4.00 1.25
实际值是负的，但在所述测定系统的变异性之内
直接加入培养板中的病毒储备液
表l5用未经Mosi-guardTM处理的面罩过滤后
Urbani SARS病毒的病毒滴度的对数降低 面罩 病毒滴度 (log10 TCID50/ml) 病毒滴度的对数降低 (-log10 TCID50/ml) 使用Mosi-guard处理 病毒对照 GR8-1 3.75 3.75 ＜0.25
实际值是负的，但在所述测定系统的变异性之内
直接加入培养板中的病毒储备液
讨论
细胞毒性测定
vero细胞毒性测定的结果(表11)表明对于未稀释的浓度从面罩 GR8-1收集到的滤液表现出毒性。从面罩GR8-2、GRS-3和GR8-4 收集到的滤液针对vero细胞未表现出任何的毒性。
C1008细胞毒性测定的结果(表12)表明从面罩GR8-1、GR8-2、 GR8-3和GR8-4收集到的滤液在未稀释的浓度下表现出毒性。从面 罩GR8-1收集到的滤液在稀释10倍下也表现出毒性。
流感A/Sydney/5/97的杀病毒测定
流感A/Sydney/5/97的杀病毒测定的结果(表12)表明在每种面罩 上Mosi-guardTM喷雾一次足以将病毒滴度降低至少1-log10TCID50/ml。除此之外，该结果还表明针对流感A/Sydney/5/97在37 ℃下温育8小时以后Mosi-guardTM依然具有抗病毒活性。
面罩对照的结果显示在表13中，其表明通过面罩过滤病毒的处 理并没有引起病毒滴度可检测的降低，因此并没有发生病毒对面罩的 明显吸附。
Urbani SARS杀病毒测定
Urbani SARS杀病毒测定的结果(表14)表明在面罩GR8-1上 Mosi-guardTM喷雾三次足以将病毒滴度降低1.25-log10 TCID50/ml。除 此之外，该结果还表明针对Urbani SARS病毒，在37℃下温育8小 时以后Mosi-guardTM依然具有具有抗病毒活性。
面罩对照的结果显示在表15中。从面罩GR8-1收集到的滤液并 没有表现出病毒滴度可检测的降低。这表明对照面罩在过滤处理中并 没有明显地吸附病毒。
应理解可在所附权利要求的范围内对本发明进行修改。