技术领域
本发明涉及一种包含非去污剂型磺基甜菜碱(NDSB)的药物组合物。
现有技术
包含活性药物成分的药物组合物是众所周知的。所述的常见药物组合 物包含各种可药用的赋形剂，这些可药用的赋形剂因其不同的性质(例如稳 定活性药物成分、调节和/或维持pH、影响活性药物成分的溶解度、维持 药物组合物的等渗性等等)使得活性药物成分可以以药物组合物的形式被 应用。已经对可药用的赋形剂进行了广泛描述；例如可参见药用赋形剂手 册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，Ainley Wade和Paul J. Weller，American Pharmaceutical Association，1994。
已经描述了有治疗活性的蛋白可作为药物组合物中的活性药物成分。 这些药物组合物还包含各种因其性质使得可以制备稳定的包含有治疗活性 蛋白的药物组合物的赋形剂。对该类药物组合物进行了广泛描述；例如可 参见Yu-Chang John Wang和Musetta A.Hanson(1988)，J of Parenteral Science & Technology，42：S4-S26；Wong D.和Parasrampuria J.(1997)， Biopharm：November 52-61。
在EP 373679中公开了包含治疗性蛋白——粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)的稳定药物组合物，并且在其中描述了主要在具有低电导率和2.75 至4.0的酸性pH的溶液中来稳定G-CSF。为了改善其稳定性，向其中加 入各种糖、氨基酸、聚合物和去污剂。其特别强调了包含G-CSF的组合物 的pH应低于4以降低聚集体的形成和增加该方法的稳定性。在pH超过 4.0时形成聚集体和稳定性降低与得自现有技术的数据(Kuzniar等人(2001)， Pharm Dev Technol 6(3)：441-7；Bartkowski等(2002)，J Protein Chem 21(3)：137-43；Narhi等人(1991)，J Protein Chem 10(4)：359-367；Wang W (1999)，Int J Pharmaceut 185：129-188)是一致的。
在专利和科技文献中的其它药物组合物中描述了通过添加各种稳定 剂，如例如硫酸根离子(EP 1129720)、各种防腐剂、氨基酸和表面活性的 混合物(EP 607156)、存在表面活性剂情况下的各种缓冲系统(磷酸盐、枸橼 酸盐、精氨酸、醋酸盐)(EP 674525)、高分子化合物，如羟丙基纤维素、聚 乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等(GB 2193621)、表面活性剂(EP 1060746)、各种缓冲系统(TRIS、HEPES、TRICINE)(EP 0988861)、糖类， 如纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、棉子糖、海藻糖等(EP 0674524)、以 及一种或多种氨基酸(EP 1197221、WO51629、EP 1260230和EP 1329224、 EP 0975335)来获得G-CSF的稳定性。虽然对于包含G-CSF的药物组合物 而言优选低离子强度，但是在已经描述的用于稳定G-CSF的大多数情况中 均使用了各种表面活性剂和其它稳定剂来稳定G-CSF。此外，在大多数情 况中，为了维持pH还使用各种缓冲系统。
在文献中描述了在蛋白复性中使用非去污剂型磺基甜菜碱类物质 (NDSB)作为增溶剂(以约1M溶液的高浓度被使用)(Chong Y和Chen H. (2000)，Biotechiques 29(6)：1166-7；Vuillard L等人(1995)，Biochem J 305： 337-43；Vuillard L等人(1995)，Electrophoresis 16(3)：295-7；Vuillard L等 人(1998)，Eur J Biochem 256：128-135；Goldberg M E等人(1995)，Folding & Design 1：21-27)。
仍然需要提供稳定的药物组合物。在科技或专利文献中都没有发现有 关在药物组合物中使用NDSB的描述。
附图说明
图1：在40℃(±2℃)下储存1个月(40)的本发明样品和参比样品的 SE-HPLC。
图2：在40℃(±2℃)下储存1个月(40)的本发明样品的SE-HPLC。
本发明的描述
在本发明中，发现NDSB可用作药物组合物中的赋形剂。通过使用 NDSB，可以提供稳定的药物组合物。
因此，本发明涉及一种包含NDSB的药物组合物。
本发明第一方面提供了一种包含活性药物成分和非去污剂型磺基甜菜 碱(NDSB)的药物组合物。
本发明的活性药物成分选自治疗上有效的合成或天然有机分子(例如 水溶性差的合成和天然有机分子)和治疗上有效的蛋白(例如水溶性差的和/ 或疏水性蛋白)和/或具有治疗作用的其它活性药物成分。所说的活性药物 成分优选地以有效量被包含。这里所用的术语“治疗有效量的活性药物成 分”指的是具有治疗作用的量的活性药物成分。
本发明的药物组合物包含非去污剂型的磺基甜菜碱(NDSB)。
这里所用的术语“非去污剂型磺基甜菜碱”指的是在水溶液中不形成 胶束的磺基甜菜碱。
在本发明药物组合物的一个优选的实施方案中，NDSB是其中基团 R1、R2、R3和R4-SO-3都被结合到中央氮原子上的季铵盐，并且其中R1 是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基或其衍生物；R2是甲基、乙基、 丙基、丁基、戊基、己基或其衍生物；R3是甲基、乙基、丙基、丁基、戊 基、己基或其衍生物，以及R1、R2和R3的所有组合，R4是(CH2)n，其 中n为1至6；n最优选地为3。
季氮原子也可以是脂族或芳族环结构的一部分。
因此，在本发明药物组合物的一个优选的实施方案中，NDSB是式1 的季铵盐，
式1
其中R1、R2和R3可以相同和/或不同并选自甲基、乙基、丙基、丁基、 戊基、己基或其衍生物，R4是(CH2)n，其中n为1至6；n最优选地为3。
在本发明的药物组合物中，优选使用选自下列的NDSB：二甲基乙基 -(3-磺基丙基)-铵盐(SB195，Vuillard等人(1994)FEBS Letters，353， 294-296；Goldberg等人(1995/1996)Folding & Design，1，21-27)、3-(1-吡啶 基)-1-丙磺酸盐(SB201)、丙磺酸二甲基苄铵(SB256)、二甲基-叔丁基-(3-磺 基丙基)铵盐(SB222t)、3-(1-甲基哌啶)-1-丙磺酸盐(SB221)和二甲基-(2-羟基 乙基)-(磺基丙基)-铵盐(SB211；Vuillard等人(1995)Anal Biochem，230， 290-294)的。还可以以各种可能的组合使用两种或多种所示的NDSB。优选 使用二甲基-叔丁基-(3-磺基丙基)铵盐(SB222t)、二甲基乙基-(3-磺基丙基)- 铵盐(SB195)和3-(1-甲基哌啶)-1-丙磺酸盐(SB221)。最优选使用二甲基-叔 丁基-(3-磺基丙基)铵盐(SB222t)。
所用NDSB的浓度取决于需要调节和/或维持的pH。其浓度范围为1 至1000mM，优选地为5至100mM。本发明药物组合物的pH范围为2至 9，优选地为3至8，并且最优选地为3.5至7.5。
本发明第二方面提供了包含治疗上有效的蛋白和非去污剂型磺基甜菜 碱(NDSB)的药物组合物。
这里所用的术语“治疗上有效的蛋白”指的是具有治疗作用的蛋白。 本发明药物组合物中所用的治疗上有效的蛋白选自粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)、干扰素类(IFN)，如IFN-α2a、INF-α2b、IFN-β、IFN-γ1b； 白介素类(IL)，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5至IL-10；粒细胞-巨噬 细胞集落刺激因子(GM-CSF)；巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；表皮生长 因子(EGF)；红细胞生成素(EPO)；促卵泡成熟激素(FSH)；人血清白蛋白 (HSA)；脱氧核糖核酸酶(DNAse)；成纤维细胞生长因子(aFGF或bFGF)； 肿瘤坏死因子α(TNF-α)和肿瘤坏死因子β(TNF-β)；降钙素；造血蛋白 (hematoprotein)；纤溶酶原激活物以及其前体(t-PA、尿激酶、尿激酶前体、 链激酶、蛋白C)；细胞因子；TNF配体族(TRAIL、FasL、骨保护素)；可 溶性受体(p55，p75)、生长激素，例如人生长激素、牛生长激素和甲状旁腺 激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素、胰岛素原、胰岛素的亚单位A、 胰岛素的亚单位B；胰高血糖素；血液凝固因子，如，例如第VIII因子、 第IX因子、组织因子、von Willebrand因子；bombasine；凝血酶；脑啡 肽酶；巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；松弛素A亚单位、松弛素B亚单位、 松弛素前体(prorelaxin)；抑制素；活化素(activin)；血管内皮生长因子 (VEGF)；激素受体或生长因子受体；整联蛋白；蛋白A、蛋白D；类风湿 因子；骨衍生神经营养因子(BDNF)、神经妥乐平(neurotropin)-3、-4、-5、 或-6；神经生长因子(NGF)；血小板衍生的生长因子(PDGF)；成纤维细胞 生长因子(aFGF和bFGF)；转化的生长因子(TGF-α和TGF-β)；胰岛素 样生长因子(IGF1和IGF2)；血小板生成素(TPO)；骨形态发生蛋白(BMP)； 超氧化物歧化酶；上述蛋白的生物学活性片断、以及其它治疗上有效的蛋 白。
本发明的治疗上有效的蛋白以治疗有效量使用。
这里所用的术语“蛋白的治疗有效量”指的是具有治疗作用的蛋白的 量。
最优选的活性药物成分是优选以治疗有效量使用的G-CSF。
在本发明中，提供了包含G-CSF和非去污剂型磺基甜菜碱(NDSB)的 药物组合物。
这里所用的术语“G-CSF”指的是调节哺乳动物造血细胞的分化和增 殖以及造血系统成熟细胞的活化的蛋白。其选自：人G-CSF以及下面所定 义的其衍生物及类似物。G-CSF优选指的是通过在大肠杆菌中表达而制备 的重组人G-CSF。
本发明的药物组合物可用于所有类型的G-CSF；其还可用于G-CSF 的衍生形式的分离，例如：蛋氨酰基G-CSF(Met-G-CSF)、糖基化 (glycolised)、酶-和化学改性的(如，例如：聚乙二醇化的)G-CSF、G-CSF 类似物以及包含G-CSF的融合蛋白。
这里所用的术语“G-CSF的治疗有效量”指的是可确保G-CSF的治 疗作用的G-CSF的量。
本发明的药物组合物还任选地包含多元醇。
术语“多元醇”指的是任何多羟基醇，即每个分子包含一个或多个羟 基的化合物。
该多元醇优选选自山梨醇、甘油、肌醇、海藻糖和甘露醇。优选的多 元醇浓度为1％至10％(m/v)。
本发明的药物组合物还任选地包含一种或多种可药用的赋形剂。
该可药用的赋形剂选自金属阳离子清除剂(例如EDTA以及类似的螯 合剂)、溶剂和自由基清除剂(例如DMSO)、各种酸(例如醋酸、枸橼酸、甲 磺酸、磷酸、盐酸等)、各种碱(例如NaOH或有机N碱，例如Good′s缓 冲剂，如TRIS、TES、HEPES)、各种缓冲系统(例如醋酸/醋酸盐、谷氨 酸/谷氨酸盐、马来酸/马来酸盐、枸橼酸/枸橼酸盐、磷酸/磷酸盐等)、用于 维持溶液的等渗性的各种可药用的赋形剂(例如无机盐，如CaCl2和NaCl)、 蛋白稳定剂，选自表面活性物质，如：二醇和甘油酯类、聚乙二醇酯类和 醚类、脱水山梨醇衍生物或聚山梨醇酯类(聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、 氨基酸、泊洛沙姆(Pluronic F68)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等。可药用的赋 形剂优选地选自EDTA和DMSO。
本发明药物组合物中的NDSB可以与一种或多种上述可药用的赋形剂 相结合。
这里所用的术语“稳定剂”指的是可以稳定活性药物成分(例如蛋白， 例如G-CSF)的可药用的赋形剂。
这里所用的术语“蛋白稳定剂”指的是可以稳定蛋白(例如G-CSF)的 可药用的赋形剂。
这里所用的术语“蛋白稳定性”(例如G-CSF)指的是维持蛋白(例如 G-CSF)的含量以及维持蛋白(例如G-CSF)的生物学活性。其中，下面的过 程可降低蛋白(例如G-CSF)的稳定性：蛋白被吸附到容器壁上、蛋白的变 性或降解、以及形成聚集体，例如蛋白二聚物(例如G-CSF二聚物)和/或蛋 白多聚体(例如G-CSF多聚体)和/或具有较高分子量的类似分子。这些过程 可能是由于许多因素造成的，例如温度增加、容器不合适、使用了不合适 的蛋白稳定剂、接触了光、冷冻/解冻、制造方法不合适和/或储存不当。
本发明的药物组合物可在高于冰箱温度(2-8℃)的温度下稳定蛋白(例 如G-CSF)，并且也能在室温下(即低于25℃)并且甚至能在更高的温度(例 如约40℃)下稳定蛋白。
本发明的药物组合物可仅包含一种可药用的赋形剂，即NDSB来稳定 蛋白(例如G-CSF)和维持该溶液的适宜的pH。
因此，本发明另一方面提供了一种包含活性药物成分(如上所述)和作 为唯一的另外的赋形剂的NDSB的药物组合物。
药物组合物中的NDSB代表了一种可以稳定蛋白并因此可代替用于其 它药物组合物的蛋白稳定剂(例如糖类、氨基酸等)的保护性分子以及可以 调节该溶液的适宜的pH并且因此可以代替用于在其它药物组合物中调节 溶液的适宜pH的酸(例如醋酸、枸橼酸、甲磺酸、磷酸、盐酸等)的分子。 NDSB也可维持适宜的pH并因此可代替其它药物组合物中所用的各种缓 冲系统和/或其组合(例如醋酸/醋酸盐、谷氨酸/谷氨酸盐、马来酸/马来酸盐、 枸橼酸/枸橼酸盐、磷酸/磷酸盐等)。与使用两种或多种具有不同功能的分 子相比，使用一种具有一些不同功能的分子在制备的经济性、降低成本、 以及更容易更迅速地制备所说的药物组合物方面更加有利，并且因为吸收 到体内的额外的物质更少，所以对于患者本身而言也更有利。NDSB的特 性代表了一种另外的优点，因为它是对光、温度、各种氧化剂(例如空气中 的氧)以及水解不敏感的简单分子，是无化学反应性的分子，在宽pH区域 中具有两性离子性，这意味着在很宽pH范围中的相互作用机理基本不变。
本发明的一个方面是NDSB在药物组合物中作为稳定剂的应用。
本发明的一个方面是NDSB在药物组合物中作为蛋白稳定剂的应用。
本发明的一个方面是NDSB在药物组合物中作为pH调节剂的应用。
本发明的一个方面是NDSB在药物组合物中作为缓冲剂的应用。
本发明优选的药物组合物是液体药物组合物；但是，这并不限制NDSB 在本发明的包含蛋白的冷冻干燥的药物组合物中的应用。
本发明的药物组合物可以通过皮下、静脉内或肌内途径进行胃肠外给 药而无需进行重组、稀释或另外的在先制备(其可导致药物活性成分例如蛋 白如G-CSF的活性降低并且在给药时会导致另外的技术问题)。
本发明的药物组合物优选不包含可能含有病毒污染物的人血清蛋白。 这样便降低了由于使用人血清白蛋白而可能发生的各种变态反应的概率。 其是在可药用并且不会造成不希望的副作用的等渗溶液中进行制备的。
在本发明的药物组合物中，蛋白的治疗有效量相当于市售蛋白的治疗 有效量。在使用G-CSF的情况中，G-CSF的治疗有效量选自0.3mg/ml至 1.2mg/ml，但是本发明不受该范围的限制。
本发明的药物组合物可用于制备治疗用的药物并用于治疗上面所列举 的治疗上有效的蛋白的适应症。
本发明的药物组合物还可用于治疗G-CSF的所有适应症和制备用于 治疗G-CSF的适应症的药物。所述的适应症可选自：嗜中性白细胞减少症 以及其临床后遗症、降低化疗后发热性嗜中性白细胞减少症方面的住院率、 调动造血干细胞、选择性输入供体白细胞、慢性嗜中性白细胞减少症、中 性白细胞减少性和非中性白细胞减少性感染、移植接受者、慢性炎性疾病、 败血症和脓毒性休克、降低中性白细胞减少性和非中性白细胞减少性感染 的风险、发病率、死亡率和住院天数、预防中性白细胞减少症和非中性白 细胞减少症患者的感染和感染并发症、预防医院内感染和降低医院内感染 的死亡率和频率、肠应用于新生儿、增强新生儿免疫系统、改善重症监护 病房患者和病危患者的临床结果、烧伤、皮肤溃疡和损害的接种和管理、 增强化疗和/或放疗、各类血细胞减少、增加抗炎性细胞因子、通过预防性 使用G-CSF降低高剂量化疗间隔、增强光动力学疗法的抗肿瘤作用、由各 种脑功能障碍造成的疾病的预防和控制、治疗血栓性疾病以及其并发症和 红细胞生成的辐射后恢复。
本发明的一个方面是NDSB用于制备药物组合物的应用。
本发明的药物组合物可以被填充到选自安瓿、注射器和小瓶的药物包 装中。该药物包装使得可以以0.2ml至2ml(每个剂量)的体积被应用。
此外，本发明的目的还在于制备本发明药物组合物的方法。用于制备 本发明药物组合物的方法包括将NDSB与治疗有效量的活性药物成分(例 如蛋白，例如G-CSF)进行混合。
用下面的非限制性实施例对本发明进行详细说明。这些实施例特别是 涉及本发明的优选实施方案。
实施例
分析方法
用下面的方法来对本发明的药物组合物进行分析：分子排阻高效液相 色谱法(SE-HPLC)、反相HPLC(RP-HPLC)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺 凝胶电泳(SDS-PAGE)和体外的生物学活性测量。
SE-HPLC
用SE-HPLC来测定G-CSF聚集体、特别是二聚物和更高的聚集体的 浓度。测定二聚物和更高的聚集体的检测限为0.01％。
高效液相色谱法(HPLC)包括：UV检测器，在线脱气装置，二元泵组 件和恒温的自动进样器(例如Waters Alliance HPLC systems)。所说的分析 是在下面的条件下进行的：
色谱条件：
柱：TSK G3000SW，10μm，300×7.5mm内径
柱温：30℃
流动相：磷酸盐缓冲液，pH 7.0(5mM磷酸钠，50mM NaCl)
流速：0.8ml/min，恒溶剂洗脱方式
检测：UV-检测器，波长为215nm
注射体积：20μl(注射蛋白的量：6-12μg)
自动进样器温度：+2至+8℃
运行时间：20分钟。
RP-HPLC
用RP-HPLC来测定G-CSF含量和对根据疏水性程度而变化的杂质进 行定量。
该HPLC系统包括：UV检测器，在线脱气装置，二元泵组件和恒温 进样装置以及恒温柱部件(例如Waters Alliance HPLC系统)。该分析是在 下面的条件下进行的：
色谱条件：
柱：YMC-Pack ODS-AQ，200，球形，3μm，150×4.6mm内径
柱温：65℃
流动相：相A：0.1％三氟乙酸(TFA)和50％乙腈(ACN)的水溶液 相B：0.1％TFA和95％CAN，在用于HPLC的水中的溶液
流速：1.0mL/min，梯度： 时间[分钟] 流动相B[％] 0.0 8 4.0 8 19.0 28 19.1 100 21.0 100 21.1 8 25.0 8
检测：UV-检测器，波长为215nm
注射体积：10μL(蛋白的注射量：3-6μg)
自动进样器温度：+2至+8℃
运行时间：25分钟
SDS-PAGE
用SDS-PAGE来对存在的蛋白二聚物和其它聚集形式(三聚物和高分 子量形式)进行检测。
上样的样品是在不含还原剂的上样缓冲液中制备的。
垂直的SDS-PAGE，NuPAGE Bis-Tris 12％凝胶8×8cm，厚1.0mm， 15个泳道(Invitrogen)，位于MOPS SDS电泳缓冲液(Invitrogen)中。
电泳在200V的恒定电压下运行1小时。将样品用Commassie蓝色 (0.1％Phast Gel Blue R 350，位于30％甲醇中)染色。
G-CSF的体外生物学活性试验
G-CSF的生物学活性是用已知的方法(Hammerling，U.等人，J Pharm Biomed Anal 13，9-20(1995))通过以刺激细胞增生(NFS-60细胞)为基础的 方法并使用国际标准的人重组G-CSF(88/502，酵母细胞衍生的；NIBSC Potters Bar，Hertfordshire，UK；见Mire-Sluis，A.R.等人J Immunol Methods 179，117-126(1995)来进行测定的。
pH值的测量
用MA 5741(Iskra)pH计和Biotrode(Hamilton)电极来测量pH。用 适宜的新鲜校准缓冲液将所说的pH计校准至3.0至5.0的pH范围。pH 是在25℃下进行测量的。pH测量的标准偏差为pH值的0.003(0.3％)。
测定药物组合物中G-CSF稳定性的条件：
4℃：在冰箱温度(范围为+4℃至+6℃)下储存在冰箱中
40℃：储存在40℃±2℃下
25℃：在25℃至30℃的室温下储存在1ml的填充注射器中，同时以 75rpm在振动器Vibromix 314EVT上振摇。
实施例1：稳定性试验
制备下面的液体药物组合物：
FP1 0.3mg/ml G-CSF，39mM NDSB，5mM Na EDTA，pH 4.4
FP2 0.3mg/ml G-CSF，39mM NDSB，5mM Na EDTA，5％ DMSO pH 4.4
FP3 0.3mg/ml G-CSF，7mM NDSB，5％山梨醇，pH 4.4
FP4 0.6mg/ml G-CSF，6mM NDSB，8％山梨醇，pH 4.6
FP5 0.6mg/ml G-CSF，13mM NDSB，8％山梨醇，pH 4.3
FP6 0.6mg/ml G-CSF，10mM NDSB，8％山梨醇，pH 4.5
FP7 0.6mg/ml G-CSF，10mM NDSB，5％山梨醇，pH 4.4
FP8 0.6mg/ml G-CSF，10mM NDSB，10％山梨醇，pH 4.4
FP9 0.6mg/ml G-CSF，10mM NDSB，8％肌醇，pH 4.4
FP10 0.6mg/ml G-CSF，10mM NDSB，8％海藻糖，pH 4.4
FP11 0.6mg/ml G-CSF，50mM NDSB，8％山梨醇，pH 4.9。
参比药物组合物：
A(S16-10ACT)：0.3mg/ml G-CSF，10mM醋酸，5％(m/v)山梨醇， 0.004％吐温80，用NaOH将其pH调至4.0(等同于Neupogen)。
将G-CSF浓度为0.6mg/ml的样品在40℃下储存1个月。
用SE-HPLC对其进行分析；将6μg G-CSF上样到该柱上。图1显示 了相应的结果(AU＝吸收单位)。
图1的图例说明：
1 FP1
2 FP2
R S16-10ACT
将G-CSF的浓度为0.6mg/ml的样品在40℃下储存1个月。用 SE-HPLC对这些样品进行分析；上样到柱上的G-CSF为6μg。结果如图 2(AU＝吸收单位)所示。
图2的图例说明：
4 FP4
5 FP5
9 FP9
稳定性试验的结果
在40℃下储存了1个月的样品FP1和FP2的SE-HPLC分析表明这些 样品是稳定的，没有发现聚集体和疏水性降解产物的含量增加(表1，图1)。 其稳定性与参比样品(AS16-10ACT)(其等同于可以从市场上获得的包含 G-CSF的药物组合物(Neupogen，G-CSF＝0.3mg/ml))相当。还用RP-HPLC 分析证明了其稳定性，RP-HPLC分析表明在储存期后杂质或蛋白含量基 本不变。这些结果与SDS-PAGE分析的结果(该结果没有表示出来)和生物 学活性的体外测量结果相一致。在这些研究中所用的G-CSF的体外生物学 活性达到了国际标准的水平(Cat.no.88/502；NIBSC，UK)。在试验条件下， 在储存后样品FP1和FP2的体外生物学活性没有变化(结果未表示出)。
表1 NDSB pH 赋形剂 储存 期 温度 二聚物 (SE-HPLC) 更高的聚 集体 (SE-HPLC) AS16-10ACT c＝0.3mg/ml - 4.0 吐温80 山梨醇 1m 40℃ 0.00％ 0.13％ FP1 39mM 4.4 EDTA 1m 40℃ 0.00％ 0.18％ FP2 39mM 4.4 EDTA DMSO 1m 40℃ 0.00％ 0.23％ FP3 7mM 4.4 山梨醇 1m 40℃ 0.00％ 1.02％
m：月；％：相对于G-CSF的总量而言二聚物/更高聚集体的量；c＝G-CSF 浓度。
这些结果表明，包含NDSB的药物组合物的稳定性与参比样品 (AS16-10ACT)相当。更高的NDSB浓度显示了对稳定性更有利的作用。
对在25℃下储存了1星期和1个月的FP4至FP11的样品进行的 SE-HPLC分析表明这些样品是稳定的，聚集体含量和疏水性降解产物没有 显著增加(表2，图2)。其稳定性与参比样品(AS16-10ACT)相当，所说的参 比样品等同于市场上的包含G-CSF的药物组合物(Neupogen，G-CSF＝ 0.3mg/ml)。还用RP-HPLC分析证明了其稳定性，该RP-HPLC分析表明 在储存期后杂质和蛋白含量基本没有变化。这些结果与SDS-PAGE分析结 果(这些结果没有表示出来)和体外生物学活性测量的结果相一致。在这些 研究中所用的G-CSF的体外生物学活性达到了国际标准的水平(Cat.no. 88/502；NIBSC，UK)。在研究条件下储存后，样品FP4至FP11的生物学 活性发生了变化(结果未表示出来)。
表2 样品 pH 赋形 剂 储存 期 温度 二聚物 (SE-HPLC) 更高的聚 集体 (SE-HPLC) 蛋白含量 (RP-HPLC) FP4 6mM NDSB 4.6 山梨 醇 8％ 1w 40℃ 0.07％ 0.21％ 99.4％ 1m 40℃ 0.00％ 1.8％ 95.3％ 1w 振摇 25℃ 0.03％ 0.07％ 99.6％ FP5 13mM NDSB 4.3 山梨 醇 8％ 1w 40℃ 0.10％ 0.18％ 96.5％ 1m 40℃ 0.00％ 1.63％ 93.9％ 1w 振摇 25℃ 0.00％ 0.07％ 97.4％ FP6 6mM NDSB 4.5 山梨 醇 8％ 1w 40℃ 0.13％ 0.18％ 98.8％ 1m 40℃ 0.00％ 1.82％ 96.0％ 1w 振摇 25℃ 0.05％ 0.07％ 99.2％ FP7 10mM NDSB 4.4 山梨 醇 5％ 1w 40℃ 0.18％ 0.17％ 98.6％ 1m 40℃ 0.00％ 1.18％ 95.1％ 1w 振摇 25℃ 0.02％ 0.04％ 99.4％ FP8 10mM NDSB 4.4 山梨 醇 10％ 1w 40℃ 0.11％ 0.18％ 98.4％ 1m 40℃ 0.00％ 1.9％ 95.8％ 1w 振摇 25℃ 0.03％ 0.08％ 99.6％ FP9 10mM NDSB 4.4 肌醇 8％ 1w 40℃ 0.10％ 0.09％ 98.4％ 1m 40℃ 0.00％ 0.97％ 95.6％ 1w 振摇 25℃ 0.16％ 0.08％ 99.4％ FP10 10mM NDSB 4.4 海藻 糖 8％ 1w 40℃ 0.35％ 0.25％ 98.4％ 1m 40℃ 0.00％ 2.08％ 95.2％ 1w 振摇 25℃ 0.50％ 0.11％ 99.0％ FP11 50mM NDSB 4.9，用 NaOH 调pH 山梨 醇 8％ 1w 40℃ 0.16％ 0.05％ 97.0％ 1m 40℃ 0.14％ 0.85％ 89.1％ 1w 振摇 25℃ 0.05％ 0.05％ 99.1％
w：星期，m：月；％：相对于G-CSF的总量而言二聚物/更高聚集体的量； ％多元醇：m/v。
表2的结果表明加入NDSB的药物组合物是稳定的。与参比样品相比 注意到接触更极端条件(1个月，40℃)的样品的稳定性略微降低(表1)。稳 定性略微降低还可能是由于高于4.0的pH对G-CSF不利所导致的，这一 点也可以从现有技术中得到证明。参比样品是用pH 4.0来进行制备的。
实施例2
本发明G-CSF药物组合物的组成
本发明药物组合物的组成如表3所示。
表3 样品 G-CSF含量(mg/ml) 无活性的成分 pH FP1 0.3 39mM NDSB，5mM Na EDTA，5％DMSO 4.4 FP2 0.3 39mM NDSB，5mM Na EDTA 4.4 FP3 0.3 7mM NDSB，8％山梨醇 4.4 FP4 0.6 6mM NDSB，8％山梨醇 4.6 FP5 0.6 13mM NDSB，8％山梨醇 4.3 FP6 0.6 10mM NDSB，8％山梨醇 4.5 FP7 0.6 10mM NDSB，5％山梨醇 4.4 FP8 0.6 10mM NDSB，10％山梨醇 4.4 FP9 0.6 10mM NDSB，8％肌醇 4.4 FP10 0.6 10mM NDSB，8％海藻糖 4.4
原药浓缩物(bulk concentrate)的制备
通过在大肠杆菌中表达来生产用于制备原药浓缩物的G-CSF的原料。
原药浓缩物是在含有纯酸(醋酸或HCl)的pH为4.4的溶液中以 1.5mg/ml的G-CSF浓度来制备的。所说原药浓缩物的SE-HPLC分析表明 二聚物和更高聚集体的含量低于检测限。用RP-HPLC分析测定的杂质分 析范围为2-4％。(新鲜Neupogen样品的RP-HPLC分析表明具有与之相 当数量的杂质)。
物质品质：
NDSB：分析级NDSB-195(Calbiochem)，山梨醇：欧洲药典质量；甘 油：Merck；分析级；肌醇：肌醇(myo-inositol)(Fluka：＞99.5％HPLC)，海 藻糖(Fluka：＞99.5％HPLC)，EDTA(Sigma：99％)，DMSO(Merck： ＞99.5％)，吐温80(Sigma，低过氧化物水平，包含BHT作为抗氧剂)；注射 用水：欧洲药典质量；分析用水：Milli-Q(Millipore)。
参比药物组合物的制备
A(S16-10ACT)：汇集包含G-CSF单体的凝胶过滤的级分并代之以在 注射用水中包含10mM醋酸和5％山梨醇的缓冲液。用NaOH将该缓冲液 的pH调至3.96。用三个Ultracel-5PLCCC膜在LabscaleTM TFF System/Millipore上进行置换。向其中加入吐温80直至得到0.004％的浓度。 在置换后最终溶液的pH为4.0，浓度为0.304mg/ml。
本发明药物组合物的制备：
一般方法：
本发明的药物组合物是通过用预先用0.2PES/Nalgene滤器进行了过 滤的无菌缓冲液对原药浓缩物进行稀释来制备的。G-CSF的终浓度分别为 0.3mg/ml或0.6mg/ml。
将药物组合物FP1和FP2填充到由1型无色水解玻璃制成的进行了洗 涤、灭菌的2ml小瓶中并用配有铝帽的溴丁橡胶塞封闭。
将其它药物组合物(FP3至FP11)(手工)填充到注射器(体积为1.3- 1.4ml)中从而使得塞子周围的空气数量最少。
FP1、FP2、FP3：向1份原药浓缩物中加入4份适宜的缓冲溶液。得 到表3所示的终浓度。不再对pH进行调节。
FP4-FP11：向4份浓缩物中加入6份含有适宜缓冲剂的溶液。得到表 3所示的终浓度。不再对pH进行调节。