技术领域
本发明属于药品领域，涉及一种用于治疗糖尿病视网膜病的银杏叶制剂及其制备方法和用途。
背景技术
银杏(Ginkgo biloba L.)是银杏科银杏属植物，银杏叶是银杏树的干燥叶，性平，味甘、苦、涩，归心、肺经，具有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛的功效。银杏叶的有效成分主要是黄酮类和萜内酯类，此外还含有聚戊烯醇、多糖、烷基酚酸类、甾类和微量元素等。据不完全统计，到目前为止，从银杏叶中分离并进行了结构鉴定的化合物已有200余种。红杉醇又名西曲依醇(Sequoyitol)，广泛分布于多种植物中，尤其在云南红豆杉、美国红豆杉、曼地亚红豆杉、以及云南穂花杉等红豆杉科植物中广泛分布。近年来的研究表明，红杉醇有降血糖的作用。南京中医药大学硕士学位论文《不同来源银杏叶资源化学研究》(2013年6月)从银杏叶中提取分离得到23个化合物，其中的一个化合物为红杉醇。
因此，制备含有红杉醇的银杏叶提取物对于治疗糖尿病的药物的研发具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有红杉醇的银杏叶制剂，进而提供其制备方法与用途。
第一方面，本发明实施例提供一种银杏叶提取物，包括以下成分：松醇，红杉醇，水仙苷。
优选地，本发明上述银杏叶提取物，所述银杏叶提取物中，松醇、红杉醇、水仙苷的重量之比为：21-22：10-11：1。
进一步优选地，本发明上述银杏叶提取物，还包括以下成分：总黄酮醇苷，银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯C。
进一步优选地，本发明上述银杏叶提取物，总黄酮醇苷、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的重量之比为：32-36：7-8：3：4-5。
进一步优选地，本发明上述银杏叶提取物，包括以下成分：松醇21-22重量份，红杉醇10-11重量份，水仙苷1重量份，总黄酮醇苷32-36重量份，银杏内酯A 7-8重量份，银杏内酯B 3重量份，银杏内酯C 4-5重量份。
进一步优选地，本发明上述银杏叶提取物，包括以下成分：松醇21重量份，红杉醇10重量份，水仙苷1重量份，总黄酮醇苷32重量份，银杏内酯A 7重量份，银杏内酯B 3重量份，银杏内酯C 4重量份；或者
松醇22重量份，红杉醇11重量份，水仙苷1重量份，总黄酮醇苷33重量份，银杏内酯A 8重量份，银杏内酯B 3重量份，银杏内酯C 5重量份；或者
松醇21重量份，红杉醇11重量份，水仙苷1重量份，总黄酮醇苷34重量份，银杏内酯A 7重量份，银杏内酯B 3重量份，银杏内酯C 4重量份；或者
松醇22重量份，红杉醇10重量份，水仙苷1重量份，总黄酮醇苷36重量份，银杏内酯A 7重量份，银杏内酯B 3重量份，银杏内酯C 4重量份。
第二方面，本发明实施例还提供一种上述银杏叶提取物的制备方法，所述银杏叶提取物的制备方法包括以下步骤：
醇提：取银杏叶，用乙醇水溶液提取，合并提取液，过滤，滤液浓缩，低温静置，去除上层浮油，取下层液，得溶液A；
水沉：向溶液A中加入水，低温静置，过滤，滤液浓缩，放至室温，得溶液B；
醇沉：向溶液B中加入乙醇水溶液，将醇沉后的溶液依次进行低温静置、过滤和滤液浓缩并重复进行，得溶液C；
离子交换树脂吸附：将溶液C用离子交换树脂吸附处理，收集洗脱液，浓缩，得银杏叶提取物。
优选地，本发明上述银杏叶提取物的制备方法，所述离子交换树脂吸附步骤中，将溶液C先用阳离子交换树脂吸附处理、再用阴离子交换树脂吸附处理。
进一步优选地，本发明上述银杏叶提取物的制备方法，所述银杏叶提取物的制备方法包括以下步骤：
醇提：取银杏叶，以银杏叶重量计，每次加入5-12倍量的体积浓度为80-98％的乙醇水溶液提取0.5-1.5h，加热回流提取1-5次，合并提取液，过滤，滤液浓缩至银杏叶重量的0.1～0.3倍，低温静置45-52h，去除上层浮油，取下层液，得溶液A；
水沉：以银杏叶重量计，向溶液A中加入0.3-0.7倍量的水，低温静置45-52h，过滤，滤液浓缩至银杏叶重量的0.1-0.3倍，放至室温，得溶液B；
醇沉：向溶液B中加入体积浓度为90-98％的乙醇水溶液使含醇量至76-84％，将醇沉后的溶液依次进行低温静置、过滤和滤液浓缩并重复进行2-5次，得溶液C；
离子交换树脂吸附：向溶液C加入银杏叶重量的0.1-0.3倍量的水，先用阳离子交换树脂吸附处理3-5次，再用阴离子交换树脂吸附处理3-5次，收集洗脱液，浓缩，得银杏叶提取物。
进一步优选地，本发明上述银杏叶提取物的制备方法，
所述阳离子交换树脂吸附处理步骤中，所述阳离子交换树脂选自D113型阳离子交换树脂，所述阳离子树脂的用量为银杏叶重量的1-3倍量；
所述阴离子交换树脂吸附处理步骤中，所述阴离子交换树脂选自D301型阴离子交换树脂，所述阴离子树脂的用量为银杏叶重量的0.5-1.5倍量。
进一步优选地，本发明上述银杏叶提取物的制备方法，
所述银杏叶提取物的制备方法包括以下步骤：
醇提：取银杏叶，以银杏叶重量计，每次加入8倍量的体积浓度为90％的乙醇水溶液提取1.0h，加热回流提取3次，合并提取液，过滤，滤液浓缩至银杏叶重量的0.2倍，低温静置48h，去除上层浮油，取下层液，得溶液A；
水沉：以银杏叶重量计，向溶液A中加入0.5倍量的水，低温静置48h，过滤，滤液浓缩至银杏叶重量的0.2倍，放至室温，得溶液B；
醇沉：向溶液B中加入体积浓度为94％的乙醇水溶液使含醇量至80％，将醇沉后的溶液依次进行低温静置、过滤和滤液浓缩并重复进行3次，得溶液C；
离子交换树脂吸附：向溶液C加入银杏叶重量的0.2倍量的水，先用银杏叶重量的2.0倍量的D113型阳离子交换树脂吸附处理4次，再用银杏叶重量的1.0倍量的D301型阴离子交换树脂吸附处理4次，收集洗脱液，浓缩，得银杏叶提取物。
第三方面，本发明实施例还提供一种药物制剂，以上述银杏叶提取物或上述制备方法制备得到的银杏叶提取物为活性成分，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的注射剂、溶液剂、合剂、洗剂、涂剂、片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、膜剂、糖浆剂、贴膏剂、软膏剂、栓剂、糊剂、凝胶剂、气雾剂或喷雾剂。
所述常规辅料为：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素纳等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000、PEG4000、虫蜡等。
第四方面，本发明实施例还提供上述银杏叶提取物或上述制备方法制备得到的银杏叶提取物或上述药物制剂在制备治疗糖尿病或糖尿病并发症的药物中的应用。
优选地，上述用途中，所述糖尿病并发症为糖尿病视网膜病。
本发明的技术方案具有如下优点：
(1)本发明研究发现，含有松醇、红杉醇和水仙苷的银杏叶提取物，对糖尿病视网膜病具有治疗作用；
(2)本发明进一步研究发现，含有松醇、红杉醇、水仙苷的重量之比为21-22：10-11：1的银杏叶提取物，对糖尿病视网膜病的治疗作用更显著；
(3)本发明进一步研究发现，以银杏叶为原料，通过醇提、水沉、醇沉、离子交换树脂吸附，可以制备得到松醇、红杉醇和水仙苷的银杏叶提取物。
(4)本发明进一步研究发现，以银杏叶为原料，通过醇提、水沉、醇沉、离子交换树脂吸附，可以制备得到松醇、红杉醇和水仙苷的银杏叶提取物。
(5)本发明进一步研究发现，在离子交换树脂吸附步骤中，先用阳离子交换树脂吸附处理、再用阴离子交换树脂吸附处理，当以D113型为阳离子交换树脂、以D301型为阴离子交换树脂，并进一步优化阳离子交换树脂和阴离子交换树脂的具体吸附条件，可以使得银杏叶提取物中松醇、红杉醇、水仙苷的重量之比为21-22：10-11：1。
具体实施方式
实施例1
本实施例银杏叶提取物的制备方法包括以下步骤：
醇提：取银杏叶，以银杏叶重量计，每次加入8倍量的体积浓度为90％的乙醇水溶液提取1.0h，加热回流提取3次，合并提取液，过滤，滤液浓缩至银杏叶重量的0.2倍，低温静置48h，去除上层浮油，取下层液，得溶液A；
水沉：以银杏叶重量计，向溶液A中加入0.5倍量的水，低温静置48h，过滤，滤液浓缩至银杏叶重量的0.2倍，放至室温，得溶液B；
醇沉：向溶液B中加入体积浓度为94％的乙醇水溶液使含醇量至80％，将醇沉后的溶液依次进行低温静置、过滤和滤液浓缩并重复进行3次，得溶液C；
离子交换树脂吸附：向溶液C加入银杏叶重量的0.2倍量的水，先用银杏叶重量的2.0倍量的D113型阳离子交换树脂吸附处理4次，再用银杏叶重量的1.0倍量的D301型阴离子交换树脂吸附处理4次，收集洗脱液，浓缩，得银杏叶提取物。
本实施例的银杏叶提取物加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂。
实施例2
本实施例银杏叶提取物的制备方法包括以下步骤：
醇提：取银杏叶，以银杏叶重量计，每次加入5倍量的体积浓度为98％的乙醇水溶液提取0.5h，加热回流提取5次，合并提取液，过滤，滤液浓缩至银杏叶重量的0.1倍，低温静置52h，去除上层浮油，取下层液，得溶液A；
水沉：以银杏叶重量计，向溶液A中加入0.7倍量的水，低温静置45h，过滤，滤液浓缩至银杏叶重量的0.3倍，放至室温，得溶液B；
醇沉：向溶液B中加入体积浓度为90％的乙醇水溶液使含醇量至76％，将醇沉后的溶液依次进行低温静置、过滤和滤液浓缩并重复进行2次，得溶液C；
离子交换树脂吸附：向溶液C加入银杏叶重量的0.3倍量的水，先用银杏叶重量的1倍量的D113型阳离子交换树脂吸附处理5次，再用银杏叶重量的0.5倍量的D301型阴离子交换树脂吸附处理5次，收集洗脱液，浓缩，得银杏叶提取物。
本实施例的银杏叶提取物加入常规辅料，按照常规工艺，制成颗粒剂。
实施例3
本实施例银杏叶提取物的制备方法包括以下步骤：
醇提：取银杏叶，以银杏叶重量计，每次加入12倍量的体积浓度为80％的乙醇水溶液提取1.5h，加热回流提取1次，合并提取液，过滤，滤液浓缩至银杏叶重量的0.3倍，低温静置45h，去除上层浮油，取下层液，得溶液A；
水沉：以银杏叶重量计，向溶液A中加入0.7倍量的水，低温静置45h，过滤，滤液浓缩至银杏叶重量的0.3倍，放至室温，得溶液B；
醇沉：向溶液B中加入体积浓度为90％的乙醇水溶液使含醇量至84％，将醇沉后的溶液依次进行低温静置、过滤和滤液浓缩并重复进行5次，得溶液C；
离子交换树脂吸附：向溶液C加入银杏叶重量的0.1倍量的水，先用银杏叶重量的3倍量的D113型阳离子交换树脂吸附处理3次，再用银杏叶重量的1.5倍量的D301型阴离子交换树脂吸附处理3次，收集洗脱液，浓缩，得银杏叶提取物。
本实施例的银杏叶提取物加入常规辅料，按照常规工艺，制成胶囊剂。
实施例4
本实施例银杏叶提取物的制备方法包括以下步骤：
醇提：取银杏叶，以银杏叶重量计，每次加入6倍量的体积浓度为85％的乙醇水溶液提取0.8h，加热回流提取2次，合并提取液，过滤，滤液浓缩至银杏叶重量的0.2倍，低温静置46h，去除上层浮油，取下层液，得溶液A；
水沉：以银杏叶重量计，向溶液A中加入0.5倍量的水，低温静置46h，过滤，滤液浓缩至银杏叶重量的0.2倍，放至室温，得溶液B；
醇沉：向溶液B中加入体积浓度为95％的乙醇水溶液使含醇量至80％，将醇沉后的溶液依次进行低温静置、过滤和滤液浓缩并重复进行3次，得溶液C；
离子交换树脂吸附：向溶液C加入银杏叶重量的0.2倍量的水，先用银杏叶重量的1.5倍量的D113型阳离子交换树脂吸附处理4次，再用银杏叶重量的0.8倍量的D301型阴离子交换树脂吸附处理4次，收集洗脱液，浓缩，得银杏叶提取物。
本实施例的银杏叶提取物加入常规辅料，按照常规工艺，制成注射剂。
实验例1树脂筛选对比实验
1、实验材料
以实施例1中的溶液C为供试品进行树脂筛选实验；
阳离子交换树脂：D113型、002SC型、732型，均为80-100目。
阴离子交换树脂：D301型、717型、711型，均为80-100目。
2、实验方法
取实施例1中的溶液C分别通过树脂进行吸附，按照《中国药典》(2015年版)第一部中【银杏叶提取物】项下的方法吸附后的溶液中总黄酮醇苷、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量进行测定，以观察各指标成分在所检测工序的变化情况。按照如下方法(“一测多评法同时测定舒血宁注射液中6种黄酮类成分”，《中国药师》，2015，18(10)，1652-1656.)对实施例1-3制备得到的银杏叶提取物中水仙苷进行含量测定。(3)按照如下方法对实施例1-3制备得到的银杏叶提取物中松醇和红杉醇进行含量测定：
A、供试品溶液的制备
取银杏叶提取物，加入适量水溶剂，制成浓度为6mg/mL(请补充)的银杏叶提取物溶液，摇匀，滤过，作为供试品溶液；
B、对照品溶液的制备
取松醇适量，加入适量水，制成浓度为1.5mg/mL的松醇的溶液，摇匀，滤过，作为松醇对照品溶液；
取红杉醇适量，加入适量水，制成浓度为0.5mg/mL的红杉醇的溶液，摇匀，滤过，作为红杉醇对照品溶液；
C、色谱条件
以C18为色谱柱，以氨丙基键合硅胶为填充剂，以COSMOSIL5NH2-MS(250mm*4.6mm)为色谱柱，以乙腈：水体积比为90.5：9.5的混合溶液为流动相，柱温为30℃，检测波长为210nm，流速为1.5mL/min，以蒸发光散射检测器检测，漂移管温度为105℃，增益值为1，载气压力为3.0Bar；
D、测定
分别吸取供试品溶液8μL、松醇对照品溶液3μL和红杉醇对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定。
3、实验结果
具体实验结果如表1-3所示。
表1阳离子交换树脂筛选对比实验
由表1可知，将实施例1中的溶液C仅仅通过阳离子交换树脂，与通过002SC型、732型阳离子交换树脂吸附相比，实施例1中的溶液C通过D113型阳离子交换树脂吸附后的溶液中红杉醇、松醇、水仙苷、总黄酮醇苷、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量均更高。
表2阴离子交换树脂筛选对比实验
由表2可知，将实施例1中的溶液C仅仅通过阴离子交换树脂，与通过717型、711型阴离子交换树脂吸附相比，实施例1中的溶液C通过D301型阴离子交换树脂吸附后的溶液中红杉醇、松醇、水仙苷、总黄酮醇苷、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量均更高。
表3通过的离子交换树脂的先后顺序对比实验
由表3可知，将实施例1中的溶液C先通过D113型阳离子交换树脂吸附、再通过D301型阴离子交换树脂吸附后的溶液中红杉醇、松醇、总黄酮醇苷、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量均更高。
4、实验结论
将本发明的溶液C先通过D113型阳离子交换树脂吸附、再通过D202型阴离子交换树脂吸附后，可以提高制备得到的银杏叶提取物中红杉醇、松醇、水仙苷、总黄酮醇苷、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量。
实验例2含量测定
(1)按照《中国药典》(2015年版)第一部中【银杏叶提取物】项下的方法对实施例1-3制备得到的银杏叶提取物中总黄酮醇苷、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量进行测定。(2)按照如下方法(“一测多评法同时测定舒血宁注射液中6种黄酮类成分”，《中国药师》，2015，18(10)，1652-1656.)对实施例1-3制备得到的银杏叶提取物中水仙苷进行含量测定。
(3)按照如下方法对实施例1-3制备得到的银杏叶提取物中松醇和红杉醇进行含量测定：
A、供试品溶液的制备
取银杏叶提取物，加入适量水溶剂，制成浓度为6mg/mL的银杏叶提取物溶液，摇匀，滤过，作为供试品溶液；
B、对照品溶液的制备
取松醇适量，加入适量水，制成浓度为1.5mg/mL的松醇的溶液，摇匀，滤过，作为松醇对照品溶液；
取红杉醇适量，加入适量水，制成浓度为0.5mg/mL的红杉醇的溶液，摇匀，滤过，作为红杉醇对照品溶液；
C、色谱条件
以C18为色谱柱，以氨丙基键合硅胶为填充剂，以COSMOSIL5NH2-MS(250mm*4.6mm)为色谱柱，以乙腈：水体积比为90.5：9.5的混合溶液为流动相，柱温为30℃，检测波长为210nm，流速为1.5mL/min，以蒸发光散射检测器检测，漂移管温度为105℃，增益值为1，载气压力为3.0Bar；
D、测定
分别吸取供试品溶液8μL、松醇对照品溶液3μL和红杉醇对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定。
具体实验结果如表4所示。
表4银杏叶提取物中各成分的含量测定结果
项目 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 总黄酮醇苷(％) 32 33 34 36 银杏内酯A(％) 7 8 7 7 银杏内酯B(％) 3 3 3 3 银杏内酯C(％) 4 5 4 4 松醇(％) 21 22 21 22 红杉醇(％) 10 11 11 10 水仙苷(％) 1 1 1 1
实验例3本发明银杏叶提取物对糖尿病视网膜病的治疗效果的研究
1、实验方法
1.1实验病例选择
DR分期标准：Ⅰ期：视网膜有微血管瘤或并有小出血点；Ⅱ期：视网膜有黄白色“硬性渗出”或并有出现班；Ⅲ期：视网膜有白色“软性渗出”；Ⅳ期：视网膜有新生血和玻璃体出血；Ⅴ期：视网膜有新生血管和纤维增殖；Ⅵ期：视网膜有新生血管和纤维增殖并有视网膜脱离。
1.2实验分组
XX医院内分泌科门诊符合2型糖尿病诊断的病人90例，年龄33～72岁，均为单纯型临床分期为Ⅰ～Ⅲ期的糖尿病视网膜病(DR)患者。上述病人均无其他视网膜疾病、青光眼、视神经疾病、心脑血管、出血性疾病、肝肾功能衰竭等等疾病。
将上述90例患者随机分为3组，分别为：实验组组、对照组1-2组，每组各30例。三组病人的年龄、糖尿病病程、血糖、血脂、糖化血红蛋白及视力、DR分期情况相比，差异无统计学意义(P>0.05)，三组患者具有可比性。
1.3治疗方法
三组患者均口服降糖药二甲双胍使空腹血糖<7mmol/L和餐后血糖11mmol/L。在此基础上，实验组：口服实施例3制备的银杏叶提取物的胶囊剂，每日3次，每次100mg(按照活性成分的含量计，即：银杏叶提取物100mg)。
对照组1组：口服多贝斯，每日3次，每次500mg(按照活性成分的含量计，即：羟苯磺酸钙100mg)。
对照组2组：口服自制的药物组合物的胶囊剂，每日3次，每次81mg(按照活性成分的含量计，即：总黄酮醇苷34mg+银杏内酯A 7mg+银杏内酯B3mg+银杏内酯C 4mg+松醇21mg+红杉醇11mg+水仙苷1mg)。
各组均连续治疗3个月。各组治疗前后均观察并记录症状改善程度，同时观察药物不良反应。
1.4疗效判定标准
视力通过视力表按照如下标准评判：显效：视力提高≥4行；有效：视力提高≥2行；稳定：视力不变；加重：视力减退≥2行。视网膜病变改善情况通过观察病人治疗前后视网膜微血管瘤、出血斑减少的数量，按照如下标准进行评判：显效：视网膜微血管瘤、出血斑减少≥50％；有效：视网膜微血管瘤、出血斑减少<50％；稳定：视网膜微血管瘤、出血斑无减少；加重：视网膜微血管瘤、出血斑增多。
1.5统计学方法
组间比较采用t检验，率的比较采用X2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2、实验结果
治疗3个月后，具体实验结果如表1所示。按照如下公式计算总有效率：总有效率＝(显效例数+有效例数)/患者例数*100％。
表5三组临床疗效的具体实验结果
组别 患者例数 显效例数 有效例数 稳定例数 加重例数 总有效率 治疗组 30 6 17 7 0 76.7％ 对照组1组 30 4 11 15 0 50.0％ 对照组2组 30 4 19 7 0 76.7％
由表5可知，(1)治疗1个月后，治疗组与对照1组疗效差异有统计学意义，治疗组疗效明显优于对照组1组疗效。(2)治疗1个月后，治疗组与对照组2组的疗效相当。
此外，实验过程中，三组均未见明显不良反应，这表明本发明银杏叶提取物的安全性较好。
3、实验结论
本发明的银杏叶提取物对糖尿病视网膜病具有显著的治疗作用；而且，安全性较好，未见明显不良反应。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。