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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510860985.X (22)申请日 2015.11.27 A61K 36/8969(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (71)申请人 余姚市婉珍五金厂 地址 315464 浙江省余姚市黄家埠镇黄家埠 村邵家 22 号 (72)发明人 沈婉珍 (54) 发明名称 一种中药组合提取物及其在制备治疗白血病 中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种中药组合提取物及其在制 备治疗白血病中的应用， 该中药组合提取物由半 枝莲、 玉竹、 灯心草和藏红花经处理、 水蒸气蒸馏、 醇提、 大孔树脂吸附制备而成， 该中药组合。
2、提取物 作为活性成分在制药学上接受附加剂的药物组合 物在制备治疗白血病中的应用。 本发明采用蒸馏、 醇提以及大孔吸附树脂纯化技术对中药组合物进 行处理， 并进行治疗白血病提取物制备研究， 分离 得到了具有治疗白血病活性的提取物， 制备提取 物用于治疗白血病。本发明的中药组合提取物能 够抑制白血病细胞(HL-60细胞)增殖和诱导白血 病细胞(HL-60细胞)凋亡， 因此， 可以用来对白血 病进行治疗。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 CN 105362664 A 2016.03.02 CN 105362664 A 1。
3、/1 页 2 1.一种中药组合提取物， 其特征在于， 由以下重量份的原料制备而成 ： 半枝莲 25 35 份， 玉竹 12 16 份， 灯心草 15 20 份， 藏红花 10 12 份。 2.一种如权利要求 1 所述的中药组合提取物的制备方法， 其特征在于， 具体制备步骤 如下 ： (1) 将各原料分别进行清洗， 并于自然环境下晾干， 使得各原料的含水量保持在 8 12， 按照配比分别进行称取， 分别用粉碎机粉碎成 30 60 目的药材， 然后混合均匀 ； (2) 在上述混合的药材中加入原料 10 12 倍的水浸泡 6 8h， 采用水蒸气蒸馏法提 取挥发油， 提取时间 3 4h， 提取次数 3。
4、 4 次， 收集挥发油， 得提取物 A ； (3)将步骤(2)得到的提取物A用体积浓度为8095的乙醇为溶剂， 加热回流提取， 提取次数为 2 3 次， 每次提取时间为 2 3h， 每次溶剂用量为原料总重量的 6 8 倍， 滤 过， 得提取物 B ； (4) 将步骤 (3) 得到的提取物 B 浓缩至相对密度 d 1.10 1.20， 滤过， 药液通过大 孔吸附树脂， 再用浓度 60 75的乙醇溶液洗脱， 收集乙醇洗脱液， 浓缩干燥， 得本发明中 药组合提取物。 3.根据权利要求 2 所述的中药组合提取物的制备方法， 其特征在于， 所述大孔吸附树 脂为 LSA-21 大孔吸附树脂、 DM130 。
5、大孔吸附树脂或 LSA-40 大孔吸附树脂。 4.一种如权利要求 1 所述的中药组合提取物作为活性成分在制药学上接受附加剂的 药物组合物在制备治疗白血病中的应用。 5.根据权利要求 4 所述的应用， 其特征在于， 所述治疗白血病的药物组合物制成固体 制剂或液体制剂， 所述固体制剂为颗粒剂、 片剂、 滴丸剂、 粉针剂或胶囊， 液体制剂为口服 液。 6.根据权利要求 5 所述的应用， 其特征在于， 所述固体制剂中该中药组合提取物的质 量含量为 30 40， 液体制剂中的中药组合提取物质量含量为 21 27。 权 利 要 求 书 CN 105362664 A 2 1/7 页 3 一种中药组合提取物及。
6、其在制备治疗白血病中的应用 技术领域 0001 本发明涉及中药制备技术领域， 具体是一种中药组合提取物及其在制备治疗白血 病中的应用。 背景技术 0002 白血病是起源造血系统的、 以骨髓或其他造血组织中产生和积聚大量幼稚和异常 白细胞为特点的恶性疾病。从形式看白血病细胞大多数是未成熟和形态异常的白细胞 ； 在 功能上， 白血病细胞有着与肿瘤细胞相同的特点 ： 白血病细胞呈肿瘤性增值， 无法控制， 常 导致骨髓造血功能的抑制和衰竭， 致病人出现贫血、 中性粒细胞和血小板减少， 白血病细胞 可浸润全身各种组织与脏器， 使各个脏器的功能受损， 如脾、 肝、 淋巴结、 脑膜、 皮肤等， 产生 肝、 。
7、脾、 淋巴结肿大、 头痛、 颈强直等临床症状和体征 ； 也可表现为局部的肿瘤， 例如浸润骨 膜下时， 可聚集成淡绿色肿块， 俗称绿色瘤， 如乳突绿色瘤、 硬脑膜绿色瘤、 脊椎绿色瘤、 骨 盆绿色瘤等， 并可早于白血病前出现于临床。 由于白血病细胞源于血液系统， 又具有肿瘤细 胞的特点， 所以人们习惯上称他为血癌。白血病的分布是世界性的， 占癌症总发病率的 5 左右， 发病以儿童和青年居多。我国白血病患者约为 3-4 人 /10 万人口， 男性多于女性。在 我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率中自血病占第 6 位 ( 男性 ) 和第 8 位 ( 女性 )， 在儿童及 35岁以下的人群中则占第1位。 白血。
8、病按白细胞发育成熟的程度区分， 可分为急性、 慢性两 种 ； 按白细胞的不同类型来区分， 可分为淋巴细胞型、 粒细胞型、 单核细胞型、 浆细胞型、 巨 核细胞型白血病， 有时也可由两种细胞混合而成， 如粒一单细胞性白血病。 0003 目前白血病的治疗主要依靠化疗， 治疗白血病的药物也比较多， 中药西药均有， 常 见的西药有甲氨蝶呤、 环磷酞胺、 长春新碱、 三尖杉酯碱、 干扰素等， 中成药有珍香胶囊、 复 方斑鳌胶囊等， 这些药物通过不同的机制对白血病进行治疗， 其中有细胞毒性药物、 诱导分 化药物等。 细胞毒性药物虽然可以杀伤大量的白血病细胞， 减少体内的自血病负荷， 但副作 用较多， 如杀。
9、伤、 抑制正常造血细胞， 导致贫血、 出血 ； 抑制正常免疫功能， 机体免疫力下降， 容易合并感染 ； 损伤胃肠道粘膜， 导致厌食恶心、 呕吐 ； 还会影响心肝肾功能， 而且还可使 第二肿瘤发生率增加。此外， 这些药物剂量再大， 也不可能完全杀灭体内的白血病细胞， 而 残留的白血病细胞是疾病复发的根源。 诱导分化治疗是指应用能够促进白血病细胞分化成 熟或能够调节白血病细胞表型以增强其对药物敏感性的诱导分化剂。 目前应用最有效的是 全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病， 全反式维甲酸己成为急性早幼粒细胞白血病诱 导缓解的首选药物。 0004 干扰素是一种单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。分为 、。
10、 、 3 种。自 80 年代以来， 许多研究显示， 干扰素 ( 尤其是 a- 干扰素及 - 干扰素 ) 除具有抗病毒、 免疫调 节的作用外， 还具有明显的抗细胞增值作用。目前干扰素己被用于治疗多种白血病。干扰 素的治疗主要显示对慢粒 ( 慢性期 )、 毛细胞白血病， 慢淋等慢性白血病是有帮助的。由于 干扰素治疗费用昂贵、 大剂量是副作用多 ( 如行动能力降低、 治理减退等 )， 目前国内应用 尚不普遍。 说 明 书 CN 105362664 A 3 2/7 页 4 0005 上述药物有的具有较强的毒性， 在治疗白血病的同时对正常细胞液有杀伤作用， 有的效果不明显， 有的效果虽然好但价格昂贵。 。
11、中药在白血病治疗上以表现出一定的效果， 并且由于中药毒性低， 副作用少而越来越受到关注。因此研究出治疗白血病的中药存在很 大的价值， 以及存在很好的推广应用。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种中药组合提取物及其在制备治疗白血病中的应用， 以 解决上述背景技术中提出的问题。 0007 为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案 ： 0008 一种中药组合提取物， 由以下重量份的原料制备而成 ： 半枝莲 25 35 份， 玉竹 12 16 份， 灯心草 15 20 份， 藏红花 10 12 份。 0009 一种中药组合提取物的制备方法， 具体制备步骤如下 ： 0010 (1) 将各原料分。
12、别进行清洗， 并于自然环境下晾干， 使得各原料的含水量保持在 8 12， 按照配比分别进行称取， 分别用粉碎机粉碎成 30 60 目的药材， 然后混合均匀 ； 0011 (2) 在上述混合的药材中加入原料 10 12 倍的水浸泡 6 8h， 采用水蒸气蒸馏 法提取挥发油， 提取时间 3 4h， 提取次数 3 4 次， 收集挥发油， 得提取物 A ； 0012 (3) 将步骤 (2) 得到的提取物 A 用体积浓度为 80 95的乙醇为溶剂， 加热回流 提取， 提取次数为 2 3 次， 每次提取时间为 2 3h， 每次溶剂用量为原料总重量的 6 8 倍， 滤过， 得提取物 B ； 0013 (4)。
13、 将步骤 (3) 得到的提取物 B 浓缩至相对密度 d 1.10 1.20， 滤过， 药液通 过大孔吸附树脂， 再用浓度 60 75的乙醇溶液洗脱， 收集乙醇洗脱液， 浓缩干燥， 得本发 明中药组合提取物。 0014 作为本发明进一步的方案 ： 所述大孔吸附树脂为 LSA-21 大孔吸附树脂、 DM130 大 孔吸附树脂或 LSA-40 大孔吸附树脂。 0015 一种所述的中药组合提取物作为活性成分在制药学上接受附加剂的药物组合物 在制备治疗白血病中的应用。 0016 作为本发明进一步的方案 ： 所述治疗白血病药物制成固体制剂或液体制剂， 所述 固体制剂为颗粒剂、 片剂、 滴丸剂、 粉针剂或胶。
14、囊， 液体制剂为口服液。 0017 作为本发明再进一步的方案 ： 所述固体制剂中该中药组合提取物的质量含量为 30 36， 液体制剂中的中药组合提取物质量含量为 15 25。 0018 与现有技术相比， 本发明的有益效果是 ： 本发明采用蒸馏、 醇提以及大孔吸附树脂 纯化技术对中药组合物进行处理， 并进行治疗白血病提取物制备研究， 分离得到了具有治 疗白血病活性的提取物， 制备提取物用于治疗白血病。本发明的中药组合提取物能够有效 抑制白血病细胞 (HL-60 细胞 ) 增殖和诱导白血病细胞 (HL-60 细胞 ) 凋亡， 因此可以用来 对白血病进行治疗。 具体实施方式 0019 下面将结合本发。
15、明实施例， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的 说 明 书 CN 105362664 A 4 3/7 页 5 实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都 属于本发明保护的范围。 0020 实施例 1 0021 中药组合提取物， 由以下重量的原料制备而成 ： 半枝莲 25kg， 玉竹 16kg， 灯心草 15kg， 藏红花 12kg。 0022 上述中药组合提取物的制备方法， 具体制备步骤如下 ： 0023 (1) 将各原料分别进行清洗， 并于自然环境下。
16、晾干， 使得各原料的含水量保持在 8 12， 按照配比分别进行称取， 分别用粉碎机粉碎成 50 目的药材， 然后混合均匀 ； 0024 (2)在上述混合的药材中加入原料10倍的水浸泡6h， 采用水蒸气蒸馏法提取挥发 油， 提取时间 3h， 提取次数 4 次， 收集挥发油， 得提取物 A ； 0025 (3) 将步骤 (2) 得到的提取物 A 用体积浓度为 95的乙醇为溶剂， 加热回流提取， 提取次数为 2 次， 每次提取时间为 3h， 每次溶剂用量为原料总重量的 6 倍， 滤过， 得提取物 B ； 0026 (4) 将步骤 (3) 得到的提取物 B 浓缩至相对密度 d 1.10 1.20， 滤。
17、过， 药液通 过 LSA-21 大孔吸附树脂， 再用浓度 60的乙醇溶液洗脱， 收集乙醇洗脱液， 浓缩干燥， 得本 发明中药组合提取物。 0027 实施例 2 0028 中药组合提取物， 由以下重量的原料制备而成 ： 半枝莲 30kg， 玉竹 14kg， 灯心草 18kg， 藏红花 11kg。 0029 上述中药组合提取物的制备方法， 具体制备步骤如下 ： 0030 (1) 将各原料分别进行清洗， 并于自然环境下晾干， 使得各原料的含水量保持在 8 12， 按照配比分别进行称取， 分别用粉碎机粉碎成 50 目的药材， 然后混合均匀 ； 0031 (2)在上述混合的药材中加入原料11倍的水浸泡7。
18、h， 采用水蒸气蒸馏法提取挥发 油， 提取时间 3.5h， 提取次数 4 次， 收集挥发油， 得提取物 A ； 0032 (3) 将步骤 (2) 得到的提取物 A 用体积浓度为 95的乙醇为溶剂， 加热回流提取， 提取次数为3次， 每次提取时间为2.5h， 每次溶剂用量为原料总重量的7倍， 滤过， 得提取物 B ； 0033 (4) 将步骤 (3) 得到的提取物 B 浓缩至相对密度 d 1.10 1.20， 滤过， 药液通 过 DM130 大孔吸附树脂， 再用浓度 60的乙醇溶液洗脱， 收集乙醇洗脱液， 浓缩干燥， 得本 发明中药组合提取物。 0034 实施例 3 0035 中药组合提取物， 。
19、由以下重量的原料制备而成 ： 半枝莲 35kg， 玉竹 12kg， 灯心草 20kg， 藏红花 10kg。 0036 上述中药组合提取物的制备方法， 具体制备步骤如下 ： 0037 (1) 将各原料分别进行清洗， 并于自然环境下晾干， 使得各原料的含水量保持在 8 12， 按照配比分别进行称取， 分别用粉碎机粉碎成 50 目的药材， 然后混合均匀 ； 0038 (2)在上述混合的药材中加入原料12倍的水浸泡8h， 采用水蒸气蒸馏法提取挥发 油， 提取时间 4h， 提取次数 4 次， 收集挥发油， 得提取物 A ； 0039 (3) 将步骤 (2) 得到的提取物 A 用体积浓度为 95的乙醇为溶。
20、剂， 加热回流提取， 说 明 书 CN 105362664 A 5 4/7 页 6 提取次数为 2 次， 每次提取时间为 3h， 每次溶剂用量为原料总重量的 8 倍， 滤过， 得提取物 B ； 0040 (4) 将步骤 (3) 得到的提取物 B 浓缩至相对密度 d 1.10 1.20， 滤过， 药液通 过 LSA-40 大孔吸附树脂， 再用浓度 60的乙醇溶液洗脱， 收集乙醇洗脱液， 浓缩干燥， 得本 发明中药组合提取物。 0041 实施例 4 0042 中药组合提取物片剂的制备， 取实施例1中药组合提取物300g， 加入淀粉120g， 混 匀， 制粒， 干燥， 过筛， 加微晶纤维素 30g，。
21、 硬脂酸镁 3.5g， 混匀， 压制成 1000 片， 即得中药组 合提取物片剂。 0043 实施例 5 0044 中药组合提取物颗粒剂的制备， 取实施例2中药组合提取物310g， 加入糊精100g， 混匀， 制粒， 干燥， 整粒， 即得中药组合提取物颗粒剂。 0045 实施例 6 0046 中药组合提取物胶囊的制备， 取实施例 3 白花油麻藤提取物 295g， 加入淀粉 85g， 混匀， 制粒， 干燥， 整粒， 装胶囊 1000 粒， 即得中药组合提取物胶囊。 0047 对比例 1 0048 原料为实施例 2 中的三种 ： 半枝莲 35kg， 玉竹 12kg， 灯心草 20kg， 并按照实施。
22、例 2 的制备方法制备中药组合提取物。 0049 对比例 2 0050 原料为实施例 2 中的三种 ： 半枝莲 35kg， 玉竹 12kg， 藏红花 10kg， 并按照实施例 2 的制备方法制备中药组合提取物。 0051 对比例 3 0052 原料为实施例 2 中的三种 ： 半枝莲 35kg， 灯心草 20kg， 藏红花 10kg， 并按照实施例 2 的制备方法制备中药组合提取物。 0053 对比例 4 0054 原料为实施例 2 中的三种 ： 玉竹 12kg， 灯心草 20kg， 藏红花 10kg， 并按照实施例 2 的制备方法制备中药组合提取物。 0055 对比例 5 0056 原料为实施。
23、例2中的两种 ： 半枝莲35kg， 灯心草20kg， 并按照实施例2的制备方法 制备中药组合提取物。 0057 对比例 6 0058 原料为实施例2中的两种 ： 玉竹12kg， 藏红花10kg， 并按照实施例2的制备方法制 备中药组合提取物。 0059 实验例 1 ： 中药组合提取物抑制 HL-60 细胞增殖和诱导 HL-60 细胞凋亡试验 0060 1、 材料和方法 0061 1.1 材料 0062 RPM 工 1640 培养基购于 Gibco 公司 ； 四甲基偶氮哩盐 (MTT)、 罗丹明 123 为 Sigma 公司产品 ； Caspase-3， 9 分光光度法检测试剂盒购自南京凯基生物。
24、有限公司 ； 其他化学试 剂均为国产分析纯。 说 明 书 CN 105362664 A 6 5/7 页 7 0063 1.2 细胞培养 0064 人早幼粒细胞性白血病细胞株 HL-60 购于中科院上海细胞生物研究所， 培养于含 10胎牛血清的 RPMI1640 培养液中， 青霉素 100kU/L， 链霉素 100mg/L， 37， 5 CO2， 饱和 湿度培养箱内培养， 取对数生长期细胞进行实验。 0065 1.3 人外周血单个核细胞 (PBMC) 的分离 0066 无菌采集健康供者静脉血， 肝素抗凝 ( 每毫升全血加 0.1ml 的 200U/ml 肝素钠溶 液 )， PBS 等倍稀释血液，。
25、 1 4 加入人淋巴细胞分离液， 2000rpm 离心 20min， 收集乳白层后 用无血清 RPMI-1640 培养基 1500rpm 10min 离心洗涤 2 次， 获得单个核细胞， 台盼蓝拒染率 大于 95， 重悬于 10 FCS 的 RPMI-1640 培养基中备用。 0067 1.4 中药各提取物对 HL-60 细胞和人 PBMC 生长的影响 0068 接种 HL-60 细胞和人 PBMC 与 96 孔板， 每孔 2104个细胞 (100ul)。37， 5 CO2条件下培养 24h 后， 实验组依次加 50ug/mL 的中药组合提取物， 中药组合提取物分别为 实施例 1-6 和对比例。
26、 1-6， 继续分别培养 24、 48、 72h 后， 终止培养， 设只加培养液的对照组， 每个剂量组设 4 个复孔。实验结束前 4h， 每孔加入 20ul MTT 溶液 (5g/L)， 继续孵育 4h， 终 止培养， 小心吸弃上清液， 每孔加入 150uL DMSO， 震荡 10min， 选择 570nm 波长， 在自动酶联 检测仪上测定各孔吸光度 (A) 值， 重复实验 3 次， 并计算其生长抑制率 (CI)。 0069 CI ( 阴性对照组 A 值 - 实验组 A 值 )/ 阴性对照组 A 值 100。 0070 1.5 流式细胞术测定细胞凋亡率 0071 收集 50ug/mL 实施例 。
27、1-6 和对比例 1-6 中药组合提取物处理 48h 的各组细胞， PBS 洗涤2次， 加入预冷的70乙醇于-20固定24h， 离心洗涤后加入200uLPI染液， 50ul RNA 酶， 4避光放置 20min， 1500rpm 离心 5min。调整细胞浓度为 1105个 /ml-110 6个 /ml， 上流式细胞仪分析， 激发光源为氢离子激光， 激发波长为 488nm。 0072 1.6 统计学分析本实验结果应用统计分析 0073 软件 SPSS13.0 处理， 组间比较采用单因素方差分析。 0074 2、 结果 0075 2.1 各中药组合提取物对 HL-60 细胞及 PBMC 生长的影响。
28、 0076 对照组 HL-60 细胞生长活跃， 经 50ug/mL 的实施例 1-6 和对比例 1-6 中药组合提 取物处理 24、 48、 72h 后， HL-60 细胞生长均不同程度的减慢， 并呈时间、 浓度依赖性。在相 同浓度下， 培养 72h 各中药组合提取物对人 PBMC 几乎无抑制作用， 与 HL-60 细胞比较有显 著性差异 (P 0.05)( 见表 1)。 0077 表 1 各中药组合提取物对 HL-60 细胞增殖的影响 (n 4) 0078 说 明 书 CN 105362664 A 7 6/7 页 8 0079 注 ： 与 24h 比较 *p 0.05 料 p 0.01 ； 。
29、与 48h 比较 p 0.05 p 0.01 ； 与 72h 比较 p 0.05 p 0.01。 0080 2.2 流式细胞术检测 HL-60 细胞凋亡 0081 HL-60细胞与各中药组合提取物作用48h后， 经流式细胞仪分析， 结果显示G， 期峰 前均出现了代表细胞凋亡的亚二倍体峰， 其中 50.0ug/mL 各中药组合提取物作用 48h 凋亡 率达到 (36.47 士 4.66) 表 2)。 0082 表 2 各中药组合提取物作用 48h 后对 HL-60 细胞凋亡率的影响 (n 3) 0083 组别剂量 (g/mL)凋亡率 / 实施例 15046.251.56 实施例 25052.66。
30、3.84 实施例 35048.281.29 说 明 书 CN 105362664 A 8 7/7 页 9 实施例 45047.523.46 实施例 55049.963.20 实施例 65046.524.24 对比例 15020.862.17 对比例 25022.631.26 对比例 35020.820.95 对比例 45019.203.42 对比例 5506.211.27 对比例 6505.651.27 对照组500.280.15 阴性对照00.120.10 0084 注 ： 与阴性对照组比较 *p 0.05， *p 0.01 0085 结论 ： 实施例1-6的中药组合提取物能够抑制白血病细胞(HL-60细胞)增殖和诱 导白血病细胞 (HL-60 细胞 ) 凋亡， 因此可以用来对白血病进行治疗。 0086 对于本领域技术人员而言， 显然本发明不限于上述示范性实施例的细节， 而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下， 能够以其他的具体形式实现本发明。 因此， 无论 从哪一点来看， 均应将实施例看作是示范性的， 而且是非限制性的， 本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定， 因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。 说 明 书 CN 105362664 A 9 。