本发明专利申请是申请日为2014年6月18日、申请号为201410272698.2、名称为 纳米乳疫苗辅剂的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种新型纳米乳疫苗辅剂的制备方法。
背景技术
疫苗辅剂又称免疫佐剂(Adjuvant)，是一类单独使用时一般无免疫原性，但与抗原物 质合并使用时能增强抗原物质免疫原性，增强机体免疫应答，或改变机体免疫应答类型的物 质。辅剂本质上是一类非特异性免疫增强剂，临床上常在疫苗免疫前单独接种或与疫苗混合 后同时接种。辅剂使用在二次免疫后，其免疫的增强作用更加明显。实践证明，疫苗与辅剂 的联合应用，不仅可以显著提高疫苗的免疫效果，还可以减低动物机体的免疫耐受性。
现在商业生产上主要有以下几种辅剂，铝盐，改进的微生物产物，脂质体和乳剂。其中铝辅剂主要有氢氧化铝，磷酸铝等，是全世界应用最广泛的辅剂。但该辅剂有很多局限性，如吸附效果低下，需要的量大等。随着现代生物工程基因工程的迅速发展，传统的灭活或活体疫苗的重要性已逐渐降低，然而由基因工程重组抗原或化学合成多肽组成的现代疫苗普遍存在免疫原性弱等问题，因此迫切需要安全又有强活性的辅剂来增强其效力。为改变这种免疫辅剂研究发展的落后局面，在许多发达国家已经开始进行新型辅剂的研究，其中就包含某些纳米乳辅剂的研发。市面上现有的乳剂佐剂以MF59，AS04等为代表，是一类油包水或水包油型乳化剂。对乳剂辅剂的研究表明这是一种不亚于铝辅剂的新型辅剂，其在几个临床前开发和临床试验中表现得甚至更加优异，乙肝、丙肝及HIV亚单位抗原等也在应用新型佐剂进行了大规模的临床实验，比如AS04作为乙肝疫苗佐剂，在欧盟已经取得了上市许可。特别是基于MF59乳剂辅剂的流感疫苗Fluad已经上市10年，这是一种利用超高压力匀化作用制备的疫苗辅剂，但这种高能的工艺有很多缺陷，主要表现在：需要特殊的设备进行纳米化如高压均质机，较长的工艺操作时间，大量能量需求和高成本。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种性能优良且成本低的疫苗辅剂的制备方法，以克服上述缺 点。
为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现：
一种纳米乳疫苗辅剂的制备方法，包括以下步骤：
a.粗乳制备：混合角鲨烯，表面活性剂和辅助表面活性剂在缓冲液中，快速混合搅拌 进行初步乳化，整个体系中，HLB值为8-12，表面活性剂总量范围为8％-20％，水油比例 为0.2-0.8；
b.进一步乳化：将步骤a制得的粗乳在一定搅拌速度下进行加热，以进一步乳化；
c.相转变和纳米乳的形成：将步骤b中的混合物加热至相转变温度以上，然后进行 降温，形成纳米级乳液，得到纳米乳疫苗辅剂。
本发明通过相转变温度(phaseinversiontemperature(PIT))法制备新型纳米乳疫 苗辅剂，关键因素需要确定合适的表面活性剂和合适的HLB值，这样才能在油表面形成支 架结构，由水相包裹，形成均匀的纳米级(130～165nm范围)的水油颗粒，并且结构稳定； 其次表面活性剂总量需要控制，否则会影响产品的安全性；最后必须有合适的水和油的比例， 这样才能确保合适的水油的包裹。最后通过实验设计找到一种合适的相转变温度表面活性 剂，确定合适的相转变温度法工艺流程，确定纳米乳化疫苗辅剂的主要质控项目和标准。
其中本发明的核心技术包括：
1、表面活性剂的选择
通过预测试发现纳米乳剂可以使用相转变温度法得以实现，本发明可以使用不同的 Tween(20，40，60，65，80and85)和不同的Span(20，40，60，65，80and85)，使用不 同的组合，用相转变温度法均可制备出纳米辅剂，但Tween80和Span80作为表面活性 剂效果最好，因此使用Tween80和Span80作为首选表面活性剂，但并不局限于Tween 80和Span80。
2、HLB(HydrophileLipophilicBalance，亲水亲油平衡性)的选择
当确定一种油相(如角鲨烯)后，乳剂的类型和稳定性将取决于表面活性剂与油和水的 相互作用。亲水表面活性剂与水相相互作用较强，倾向于形成水包油型乳剂；反之亦然。在 温度高于相转变温度时，表面活性剂与水的氢键断裂脱水，就导致了表面活性剂变得更亲脂， 于是乳剂的相转变就发生了。根据Tween和Span家族的结构和HLB值，经过设计试验， 找到一个形成乳剂的最优HLB值。对于角鲨烯这种油相，最终确定8-12均可制备纳米乳 辅剂，HLB值大约在9.5左右时可得到最小粒径的乳剂。
3、表面活性剂最低比例的确定
通过设计试验，找到能够形成均一粒径的最低表面活性剂比例，确定形成均一粒径的最 低表面活性剂比例为8％。当高于8％时，表面活性剂浓度越高，粒径就越小，有利于提高 其生物利用率，制剂的均匀性，分散性和吸收性。但表面活性剂比例越小，对疫苗辅剂来说 意味着更安全。综合考量最终确定表面活性剂总量范围为8-20％。
最终本发明成功的用PIT法制备了一种以角鲨烯为油相的纳米乳剂，在方法开发的过程 中，我们确认PIT表面活性剂和辅助表面活性剂的选择是方法成败的关键。同时本发明也定 义了HLB值和油/水比例的最佳操作边界。对另外一些参数，包括表面活性剂比例，水相和 冷却方法也进行了优化。
具体的，水油比例为0.2-0.8，优选的，所述水油比例范围为0.4。
优选的，所述水相的缓冲液pH值为中性。
最终本发明确定的具体工艺参数和流程为：以角鲨烯为油相，与吐温和司盘两种表面活 性剂混合，另加入pH约为中性的缓冲剂(PBS，Tris，Citric，或Acetate等)为水相。整 个体系中，HLB范围在8-12，表面活性剂总量范围为8-20％，水油比例范围在0.2-0.8， 搅拌15-20分钟同时加热至55-70℃。将温度保持在55-70℃，继续搅拌5-10分钟后将热 的乳剂迅速转移至4-8℃的大量前述缓冲剂(为起始体积的5-10倍)中稀释，同时不停搅 拌。继续搅拌10-30分钟得到纳米乳疫苗辅剂。反应结束时测得所得物的电导率接近于WFI 的电导率，表明制得的纳米乳水相完全包裹油相。将获得的纳米乳疫苗辅剂分装保存于 2-8℃冷库中。
总之，本发明的有益效果为：
本发明首次开发出利用相转变温度(phaseinversiontemperature(PIT))法制备新 型纳米乳疫苗辅剂的工艺。本发明所阐述的相转变温度法是基于温度能改变PIT表面活性剂 的亲水亲油平衡性。在温度低于相转变温度时，表面活性剂正向卷曲，形成水包油型乳剂； 而当温度高于相转变温度时，表面活性剂则反向卷曲，形成油包水型乳剂。快速的降温使得 表面活性剂迅速变为亲水，从而使之迅速而自发的从油相向水相转移。这种迅速的转移产生 很高的内部紊流能，于是乳滴就被这种能量分散成了纳米级别。因此采用PIT法不需要使用 复杂的仪器设备，不需要高能输入，不需要高浓度的表面活性剂，也不需要使用有机溶剂， 使用该方法，纳米乳可以用一台加热器，在一个容器内完成制备，是一种简单快捷的先进工 艺方法。
本发明主要完成PIT表面活性剂和辅助表面活性剂的选择，油水相优化，表面活性剂的 比例以及水相的优化，最终形成一种制备纳米乳疫苗辅剂的工艺，该工艺制备的新型疫苗辅 剂颗粒大小分布在140nm左右(与其它纳米辅剂相比具有更小的颗粒分布)，颗粒分布更 均匀，稳定性优良，免疫增效性优良。采用该工艺制备的纳米乳疫苗辅剂对疫苗的发展将起 到重要的影响和作用。
附图说明
图1是本发明实施例1纳米乳疫苗辅剂PIT法制备中温度，粒径和电导率的示意图。
图2是实施例3中免疫增强试验的中和荧光效价示意图。
图3是实施例4中免疫增强试验的血凝抑制效价示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。
实施例1
纳米乳疫苗辅剂的制备
1)粗乳制备：以角鲨烯为油相，与吐温80和司盘80混合。另加入pH约为中性的缓 冲剂PBS为水相。HLB为9.5，表面活性剂总量范围为11％，水油比例范围在0.4，搅拌 15-20分钟同时加热至55-70℃。(2)相转变以及纳米乳的形成：将温度保持在55-70℃， 继续搅拌5-10分钟后将热的乳剂迅速转移至4-8℃的大量(5倍起始总量)PBS缓冲剂中 稀释，同时不停搅拌。继续搅拌10-30分钟，制得纳米乳疫苗辅剂产物。将产物分装保存 于2-8℃冷库中。
图1是本实施例纳米乳疫苗辅剂PIT法制备中温度，粒径和电导率的示意图，如图1 所示，反应开始后温度低于相转变温度，表面活性剂正向卷曲，形成水包油型乳剂，乳剂的 粒径较大，且不均匀；当反应继续进行，温度达到或高于相转变温度时，表面活性剂则反向 卷曲，形成油包水型乳剂，粒径变小，颗粒仍不均匀；反应最后，快速的降温使得表面活性 剂迅速变为亲水，从而使之迅速而自发的从油相向水相转移；这种迅速的转移产生很高的内 部紊流能，于是乳滴就被这种能量分散成了纳米级别；且颗粒分布均匀。
根据上述工艺制备六批产物，初步结果分别如表1所示。表1为纳米乳粒子大小和大 颗粒的数量，其中平均颗粒大小为125-165nm，大颗粒的数量：大于1.2μm的颗粒数量 小于1×107个/ml。从上述实验数据可知，本实施例制得的纳米乳疫苗辅剂具有更小的颗粒 分布，且颗粒分布更均匀。
表1纳米乳粒子大小和大颗粒的数量
Batch number Particle size Mean Large particle(particles/ml) 2013 1-1 135.2 8.78E+05 2013 1-2 137.7 6.94E+05 2013 2-1 137.6 6.08E+05 2013 2-2 137.7 9.75E+05 2013 3-1 137.4 5.41E+05 2013 3-2 136.6 6.95E+05
实施例2
产品稳定性测试
稳定性为疫苗辅剂的一个重要指标，表2为实施例1中六批纳米乳疫苗辅剂在25℃条 件下放置12个月的稳定性数据。从表2可知，该纳米乳疫苗辅剂在12个月内粒径(最主 要的稳定性指标)无显著改变，产品质量稳定。
表2纳米乳疫苗辅剂12个月的粒径
实施例3
疫苗辅剂的增敏性
采用家兔实验验证本发明疫苗辅剂的增敏性。其中对照组为常规无辅剂的出血热疫苗(I 型抗原量为1∶32，II型为1∶16)，实验组选取同样的出血热抗原并最终添加实施例1中制得 的疫苗辅剂，配置流程和常规无佐剂疫苗流程相同。I型抗原量滴度为1∶32、1∶16、1∶8，II 型抗原量滴度为1∶16、1∶8。初免后第7天加强一针，初次免疫后21天采血进行中和荧光 效价测定。结果如图2所示，从中可以看出，添加了本发明辅剂的疫苗(I型和II型HA滴 度为1∶8)其免疫后的荧光抗体水平与常规配制的疫苗(I型和II型HA滴度分别为1∶32和 1∶16)比较，仍具有较高的荧光效价，该辅剂刺激免疫应答作用明显。
实施例4
本发明疫苗辅剂与传统铝盐辅剂的免疫效果比较
为进一步比较新型辅剂与传统铝盐辅剂的免疫效果，我们进行了另一组动物实验。I型 出血热原液(血凝效价1∶64)被分别配制为终浓度为1∶32、1∶16和1∶8的各三组疫苗，分 别添加实施例1制得的辅剂和传统铝盐辅剂，初免后第7天加强一针，初次免疫后21天采 血测血凝抑制效价，结果如图3所示，表明新型佐剂效果优于传统铝盐佐剂。
从上述实施例3和4中的免疫结果初步可以判定：本发明提供的新型辅剂疫苗不仅具 有明显的增敏效果，而且和传统铝盐佐剂相比较，增敏效果有显著优势。
综上所述，本发明首次研发出利用相转变温度法制备新型纳米乳疫苗辅剂的工艺。该工 艺制备的新型疫苗辅剂颗粒大小分布在140nm左右(与其它纳米辅剂相比具有更小的颗粒 分布)，颗粒分布更均匀，稳定性优良，免疫增效性优良。
本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人 员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方 案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实 质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。