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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810870571.9 (22)申请日 2018.08.02 (71)申请人 傅松涛 地址 100000 北京市大兴区亦庄经济技术 开发区天华南街三号院长新花园E12 (72)发明人 傅松涛 解军 刘美林 (74)专利代理机构 北京世誉鑫诚专利代理事务 所(普通合伙) 11368 代理人 孙国栋 (51)Int.Cl. A61K 35/28(2015.01) A61K 9/127(2006.01) A61K 47/24(2006.01) A61P 17/02(2006.01。
2、) A61K 8/99(2017.01) A61K 8/55(2006.01) A61Q 19/00(2006.01) (54)发明名称 一种干细胞分泌因子柔性脂质体的制备方 法 (57)摘要 本发明涉及一种干细胞分泌因子柔性脂质 体的制备方法， 用10ml有机溶剂溶解0 .100- 0.150g的磷脂、 0.020-0.030g的胆固醇、 0.2- 0.3mg的维生素E， 减压旋蒸去除有机溶剂形成脂 膜， 将干细胞分泌因子溶液与脂膜水合形成干细 胞分泌因子柔性脂质体原液， 将所得干细胞分泌 因子柔性脂质体原液进行均质处理， 即得到干细 胞分泌因子柔性脂质体。 本发明有效地改善了间 充质干细胞。
3、分泌因子的保存时间， 且利于药物与 皮肤粘附与吸收， 降低刺激和减少不良反应， 增 强渗透能力到达组织深层， 增强干细胞分泌因子 的作用疗效， 提高了间充质干细胞的利用度且无 毒副作用。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 108904534 A 2018.11.30 CN 108904534 A 1.一种干细胞分泌因子柔性脂质体的制备方法， 其特征在于， 包含以下步骤： 步骤一， 干细胞的原代分离纯化和培养鉴定： 从新鲜人脐带中分离脐带华氏通胶， 通过 组织块贴壁培养法获得脐带间充质干细胞； 步骤二， 干细胞分泌因子的获取： 待脐带间充质干细胞融合度达到80以上时， 更换新 鲜的不含。
4、抗生素的无酚红无血清间充质干细胞培养基进行培养， 收集脐带间充质干细胞第 410代的细胞培养上清液， 将上清液用0.22 m的无菌过滤器过滤， 取滤液， 即得干细胞分 泌因子； 步骤三， 柔性间充质干细胞分泌因子的微囊制备： 用10ml有机溶剂溶解0.100-0.150g 的磷脂、 0.020-0.030g的胆固醇、 0.2-0.3mg的维生素E， 减压旋蒸去除有机溶剂形成脂膜， 将干细胞分泌因子溶液与脂膜水水合形成干细胞分泌因子柔性脂质体原液， 将所得干细胞 分泌因子柔性脂质体原液进行均质处理， 即得到干细胞分泌因子柔性脂质体。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述将间干细。
5、胞分泌因子溶液与脂膜 水水合形成含有生物活性因子的脂质体原液， 具体包括： 量取10mL干细胞分泌因子溶液加入到所述干燥薄膜中， 同时加入0.2-0.3mg的维生素 C， 摇动水化形成乳化液， 即得到干细胞分泌因子柔性脂质体原液。 3.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述干细胞分泌因子为人脐带间充质 干细胞分泌的生物活性因子或者人源干细胞分泌的生物活性因子。 4.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述有机溶剂为三氯甲烷、 无水乙醇 或者甲醇。 5.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述有机溶剂为以下有机溶剂的至少 两种的混合物： 三氯甲烷、 无水乙醇、 甲。
6、醇。 6.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述干细胞分泌因子柔性脂质体的粒 径范围为50-200nm。 7.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述磷脂为天然大豆磷脂、 氢化磷脂、 双肉豆蔻磷脂酰胆碱、 二棕榈酰磷脂酰胆碱、 二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、 二棕榈酰磷脂酰甘 油、 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、 二硬脂酸磷脂酰乙醇胺、 二棕榈酰磷脂酸或聚乙二醇2000-二 硬脂酰磷脂酰乙醇胺。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108904534 A 2 一种干细胞分泌因子柔性脂质体的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及具有医学作用的脂质体领域， 尤其涉及一种干细胞分泌因子。
7、柔性脂质 体的制备方法。 背景技术 0002 创面修复是一个极其复杂的生物学过程， 其包含了多种修复细胞及细胞因子等诸 多因素共同参与的细胞学、 免疫学、 分子生物学过程。 创面修复过程包括肉芽组织生成、 胶 原填充、 创口收缩、 上皮覆盖及胶原重塑等阶段。 瘢痕是创伤愈合过程的必然产物。 但是， 过 度修复导致的病理性瘢痕形成， 则会引起外形毁损， 以及程度不等的功能障碍。 病理性瘢痕 主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩， 组织学特点为大量纤维细胞增生， 细胞外基质中胶原、 蛋 白多糖、 糖蛋白等过量沉积， 胶原纤维排列紊乱。 其临床表现为感觉异常、 瘤样增生并伴有 不同程度的功能障碍。 患者需要。
8、面对一系列的生理、 心理、 美容及社会问题。 至今为止， 病理 性瘢痕的治疗依然非常复杂和困难。 0003 脐带间充质干细胞可以分泌产生大量的细胞生物活性因子， 包括转化生长因子 (transforming growth factor- )TGF- ， 表皮生长因子(Epidermal Growth Factor)EGF， 成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor)FGF， 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor)VEGF等， 这些细胞生物活性因子可以有效调控机体细胞信号 传导、 活化人体干细胞， 进而生理性修复或替代。
9、机体损伤、 病变及衰老的细胞等。 它们通过 自分泌或旁分泌的方式， 改善机体局部微环境， 促进内源性干细胞向伤口部位的迁移和分 化， 挽救濒临凋亡的细胞， 从而达到修复组织的目的。 尤其是能够有效的与皮肤细胞发生作 用， 参与炎症发生和创伤愈合。 0004 目前， 临床上仅有单一细胞因子应用于瘢痕修复的临床报道， 疗效甚好。 相比于单 一细胞因子， 干细胞上清液更适合机体创面和瘢痕组织微环境的网络调节。 然而， 干细胞分 泌因子是生物活性大分子物质， 其不能直接透过皮肤到达表皮基底层以及真皮层， 或渗透 到组织深层发挥药效。 其次， 干细胞分泌因子的保存方法直接影响其生物活性的高低以及 保存时。
10、间的长短。 这些因素都影响了干细胞分泌因子的应用。 发明内容 0005 本发明的目的在于， 解决现有技术中存在的上述不足之处。 0006 为实现上述目的， 本发明提供一种干细胞分泌因子柔性脂质体的制备方法， 包括 以下步骤： 步骤一， 干细胞的原代分离纯化和培养鉴定： 从新鲜人脐带中分离脐带华氏通 胶， 通过组织块贴壁培养法获得脐带间充质干细胞； 步骤二， 干细胞分泌因子的获取： 待脐 带间充质干细胞融合度达到80以上时， 更换新鲜的不含抗生素的无酚红无血清间充质干 细胞培养基进行培养， 收集脐带间充质干细胞第410代的细胞培养上清液， 将上清液用 0.22 m的无菌过滤器过滤， 取滤液， 即。
11、得干细胞分泌因子； 步骤三， 柔性间充质干细胞分泌 因子的微囊制备： 用10ml有机溶剂溶解0.100-0.150g的磷脂、 0.020-0.030g的胆固醇、 0.2- 说 明 书 1/6 页 3 CN 108904534 A 3 0.3mg的维生素E， 减压旋蒸去除有机溶剂形成脂膜， 将干细胞分泌因子溶液与脂膜水水合 形成干细胞分泌因子柔性脂质体原液， 将所得干细胞分泌因子柔性脂质体原液进行均质处 理， 即得到干细胞分泌因子柔性脂质体。 0007 优选地， 将间充质干细胞分泌因子溶液与脂膜水水合形成含有生物活性因子的脂 质体原液， 具体包括： 量取10mL干细胞分泌因子溶液加入到干燥薄膜中。
12、， 同时加入0.2- 0.3mg的维生素C， 摇动水化形成乳化液， 即得到干细胞分泌因子柔性脂质体原液。 0008 优选地， 干细胞分泌因子为人脐带间充质干细胞分泌的生物活性因子或者人源干 细胞分泌的生物活性因子。 0009 优选地， 有机溶剂为三氯甲烷、 无水乙醇或者甲醇。 0010 优选地， 有机溶剂为以下有机溶剂的至少两种的混合物： 三氯甲烷、 无水乙醇、 甲 醇。 0011 优选地， 干细胞分泌因子的脂质体微囊制剂也可以加入保护剂做成冻干粉。 0012 优选地， 干细胞分泌因子柔性脂质体的粒径范围为50-200nm。 0013 优选地， 磷脂为天然大豆磷脂、 氢化磷脂、 双肉豆蔻磷脂酰。
13、胆碱、 二棕榈酰磷脂酰 胆碱、 二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、 二棕榈酰磷脂酰甘油、 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、 二硬脂酸磷 脂酰乙醇胺、 二棕榈酰磷脂酸或聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。 0014 本发明将人脐带间充质干细胞分泌因子制备为柔性脂质体， 可以应用于组织损伤 与病理性瘢痕修复中。 将人脐带间充质干细胞分泌因子直接用于伤口部位， 吸收率及透皮 率较低， 且不利于细胞因子生物活性的维持。 将间充质干细胞分泌因子制备成柔性脂质体， 有效地改善了间充质干细胞分泌因子的保存时间， 且利于药物与皮肤粘附与吸收， 降低刺 激和减少不良反应， 增强渗透能力到达组织深层， 增强干细胞分泌因子的作用疗效。
14、， 提高了 间充质干细胞的利用度且无毒副作用。 此外， 将间充质干细胞分泌因子柔性脂质体直接用 于伤口处， 其可以渗透进入组织的深层结构， 改善局部微环境促进伤口处毛囊和腺体的发 生与生成以及上皮化， 从而达到创伤的愈合。 附图说明 0015 图1为本发明实施例提供的是脐带组织提取间充质干细胞的示意图； 0016 图2为本发明实施例提供的脐带间充质干细胞的形态学示意图； 0017 图3为本发明实施例提供的一种脐带间充质干细胞流式鉴定结果图； 0018 图4为本发明实施例提供的一种脐带间充质干细胞诱导分化成骨细胞的茜素红染 色结果图； 0019 图5为本发明实施例提供的一种脐带间充质干细胞诱导分。
15、化成脂肪细胞的油红O 染色结果图； 0020 图6为本发明实施例提供的一种脐带间充质干细胞分泌因子脂质体形态学图； 0021 图7为本发明实施例提供的一种脐带间充质干细胞分泌因子柔性脂质体粒径检测 图； 0022 图8为本发明实施例提供的大鼠伤口模型修复情况伤口组织病理切片； 0023 图9为本发明实施例提供的伤口组织病理切片组织学评分统计图。 说 明 书 2/6 页 4 CN 108904534 A 4 具体实施方式 0024 下面结合具体实施例， 对本发明的技术方案做进一步的详细描述。 0025 本发明实施例提供一种干细胞分泌因子柔性脂质体的制备方法， 包括以下步骤： 步骤一， 干细胞的原。
16、代分离纯化和培养鉴定： 从新鲜人脐带中分离脐带华氏通胶， 通过组织 块贴壁培养法获得脐带间充质干细胞； 步骤二， 干细胞分泌因子的获取： 待脐带间充质干细 胞融合度达到80以上时， 更换新鲜的不含抗生素的无酚红无血清间充质干细胞培养基进 行培养， 收集脐带间充质干细胞第410代的细胞培养上清液， 将上清液用0.22 m的无菌过 滤器过滤， 取滤液， 即得干细胞分泌因子； 步骤三， 柔性间充质干细胞分泌因子的微囊制备： 用10ml有机溶剂溶解0.100-0.150g的磷脂、 0.020-0.030g的胆固醇、 0.2-0.3mg的维生素E， 减压旋蒸去除有机溶剂形成脂膜， 将干细胞分泌因子溶液与。
17、脂膜水水合形成干细胞分泌因 子柔性脂质体原液， 将所得干细胞分泌因子柔性脂质体原液进行均质处理， 即得到干细胞 分泌因子柔性脂质体。 0026 实施例1 0027 步骤一， 干细胞的原代分离纯化和培养鉴定： 将新鲜脐带剪成1-2cm长的小节， 剖 开胎膜， 剔除静脉和两条动脉， 然后提取胶状物质， 剪成12mm3大小的组织块， 接种于细胞 培养皿中， 半小时后添加完全培养基， 置于37、 5CO2的细胞培养箱中培养， 3天后换液。 10天后， 在倒置显微镜下， 可以看见有间充质干细胞从组织周围爬出。 细胞培养至第3代时， 脐带间充质干细胞即得到纯化， 对细胞进行干性鉴定： 形态鉴定： 间充质干。
18、细胞呈梭形贴 壁细胞； 表面标志物鉴定： 间充质干细胞高表达CD29、 CD44、 CD105， 低表达CD45、 CD34的表 达； 诱导分化鉴定： 在特定情况下， 间充质干细胞可以分化成骨细胞、 脂肪细胞。 0028 步骤二,干细胞分泌因子的获取： 待细胞长到80左右时， 弃去原培养基， 用缓冲 液冲洗细胞后， 换用不含抗生素的无酚红无血清培养基培养， 收集310代细胞上清液， 将 上清液用0.22 m的无菌过滤器过滤， 取滤液， 即得脐带间充质干细胞分泌因子， 冷冻保存。 0029 步骤三， 柔性间充质干细胞分泌因子的微囊制备： 以10ml脂质体制剂， 其组成配方 为： 磷脂0.100g。
19、， 胆固醇0.020g， 间充质干细胞分泌因子收集液6mL， 维生素E 0.2mg， 维生素 C 0.2mg。 0030 (1)按上述配方称取磷脂、 胆固醇、 维生素E溶解于三氯甲烷， 置于圆底烧瓶中； 0031 (2)在水浴温度30恒温、 真空条件下， 旋转蒸发除去有机溶剂， 使脂类溶液在瓶 壁形成一层干燥薄膜； 0032 (3)按上述配方精确量间充质干细胞分泌因子和维生素C， 加入到干燥薄膜中， 水 化形成乳化液， 即得到干细胞分泌因子柔性脂质体原液； 0033 (4)将干细胞分泌因子柔性脂质体原液超声均质即得到干细胞分泌因子柔性脂质 体， 放置4冰箱保存。 0034 本实施例所得的干细胞。
20、分泌因子柔性脂质体呈现白色混悬液， 静置底部有絮状 物， 摇动可变均匀乳白色， 粒径大小为(117.32.89)nm， Zate电位大小为(-43.561.03) mv， 超速离心结合EILSA方法测得包封率为(72.060.36)。 0035 在一个示例中， (4)中的超声均质还可以换成挤出器均质。 0036 在一个示例中， 干细胞分泌因子为人脐带间充质干细胞分泌的生物活性因子或其 说 明 书 3/6 页 5 CN 108904534 A 5 他人源干细胞分泌的生物活性因子或浓缩后的人源干细胞分泌的生物活性因子或已知成 分的复合生物活性因子。 0037 在一个示例中， 磷脂为高纯度的天然磷脂。
21、和合成磷脂。 0038 在一个示例中， 干细胞分泌因子脂质体还包含其他抗氧化保护制剂， 其中， 抗氧化 保护剂对人体无刺激的温和抗氧化剂， 例如抗环血酸、 维生素E、 右旋糖酐、 蔗糖、 乳糖或海 藻糖中的至少一种。 0039 在一个示例中， 干细胞分泌因子的脂质体微囊制剂也可以加入保护剂做成冻干 粉。 该冻干粉可以在功能化妆品中应用， 也可以在创伤修复中用作外敷制剂或者注射制剂。 0040 在一个示例中， 磷脂为天然大豆卵磷脂、 氢化磷脂、 双肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)、 二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、 二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、 二棕榈酰磷脂酰。
22、乙醇胺(DPPE)、 二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(DSPE)、 二棕榈酰磷脂酸(DPPA)或 聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)。 0041 在一个示例中， 干细胞分泌因子柔性脂质体优选粒径范围为50-200nm。 0042 在一个示例中， 干细胞分泌因子还包含助悬剂， 助悬剂为甘油或者高分子材料， 如 PVP等。 0043 实施例2 0044 在步骤三， 以10ml脂质体制剂， 组成配方比为： 磷脂0.150g， 胆固醇0.030g， 干细胞 分泌因子浓缩液6mL， 维生素E 0.3mg， 维生素C 0.3mg。 其他步骤与实施例1相同。 0045 实施例3 004。
23、6 在步骤三， 以10ml脂质体制剂， 组成配方比为： 磷脂0.120g， 胆固醇0.025g， 干细胞 分泌因子浓缩液6mL， 维生素E 0.25mg， 维生素C 0.25mg。 其他步骤与实施例1相同。 0047 对脂质体稳定性进行测定 0048 取实施例1所制得的脐带间充质干细胞分泌因子柔性脂质体于4条件下保存， 分 别于0天、 15天及30天测定其粒径、 Zeta电位、 包封率， 并观察外观， 以确定其稳定性， 其结果 如表1所示： 0049 表1脐带间充质干细胞分泌因子柔性脂质体稳定性结果 0050 0051 从表1可以看出， 脐带间充质干细胞分泌因子柔性脂质体在4条件下稳定性良 好。
24、， 0天、 15天及30天各项结果没有显著性差异(p0.05)， 可预测干细胞柔性脂质体的稳定 性良好。 0052 对实施例3所得脐带间充质干细胞分泌因子柔性脂质体用于伤口观察修复作用： 0053 将健康雄性220g左右的SD大鼠经腹腔注射10水合氯醛(0.35mL/100g)麻醉， 待 其应答不能后将其固定进行背部脱毛， 清洁背部皮肤， 在大鼠背部脊椎两侧分别切除两个 说 明 书 4/6 页 6 CN 108904534 A 6 直径为1cm的全层皮肤缺损伤口， 分笼饲养。 对每只大鼠的不同伤口给与不同的药物包扎处 理并分组， 每天换药一次观察一周。 术后2、 3、 5、 7d定时观察伤口修。
25、复情况拍照记录并收集 组织样本， 其中， 样本包括创面新生皮肤组织及周围少许正常皮肤， 分组如下： 将纱布剪成 适当大小长条状， 浸泡于各药液中， 将药液浸湿的纱条覆盖在伤口处， 纱条上覆盖油纱、 纱 布， 最后用绷带缠绕大鼠腹部使辅料固定， 纱布剪成的长条的规格可以是1cm2cm。 0054 收集的组织样本用4中性甲醛固定1d， 梯度脱水， 石蜡包埋， 4um连续切片， 常规 苏木精-伊红染色， 中性树胶封片， 光学显微镜下观察新生皮肤病理学改变。 对伤口组织病 理切片进行组织学评分统计分析。 0055 图1为本发明实施例提供的一种的脐带组织块贴壁培养法分离提取脐带间充质干 细胞结果图， 脐。
26、带组织块周围有脐带间充质干细胞爬出。 0056 图2为本发明实施例提供的一种的脐带间充质干细胞纯化后的形态学图， 细胞呈 长梭形旋涡状， 说明所分离脐带间充质干细胞的形态符合间充质干细胞特性。 0057 图3为本发明实施例提供的一种脐带间充质干细胞表面标志物流式鉴定结果图， A、 B、 C分别是hUC-MSCs表面标志蛋白CD105、 CD44、 CD29的表达， 阳性率分别为99.7、 95.7、 99.4； D、 E分别是hUC-MSCs表面标志蛋白CD45、 CD34的表达， 阳性率分别为1.1、 0.1。 说明所分离脐带间充质干细胞的表面标志物符合间充质干细胞特性。 0058 图4为本。
27、发明实施例提供的一种脐带间充质干细胞诱导分化成骨细胞的茜素红染 色钙结节呈红色结果图。 说明脐带间充质干细胞可以诱导分化为骨细胞。 0059 图5为本发明实施例提供的一种脐带间充质干细胞诱导分化成脂肪细胞的油红O 染色脂滴呈红色结果图。 说明脐带间充质干细胞可以诱导分化为脂肪细胞。 图4和图5说明 所分离脐带间充质干细胞的分化能力符合间充质干细胞特性。 0060 图6为本发明实施例提供的一种脐带间充质干细胞分泌因子脂质体形态学图， 说 明脐带间充质干细胞分泌因子柔性脂质体呈不规则的圆球状， 大小不均一， 但分散比较均 匀。 0061 图7为本发明实施例提供的一种脐带间充质干细胞分泌因子柔性脂质。
28、体粒径检测 图， 说明脐带间充质干细胞分泌因子柔性脂质体粒径呈拟正态分布， 粒径范围在37.84nm 3580.00nm， 平均粒径为262.3nm。 0062 图8为本发明实施例提供的大鼠伤口模型修复情况伤口组织病理切片， 其中， An为 伤口愈合情况， Bn为空白培养基组HE染色病理组织切片， Cn为空白培养基柔性脂质体组HE 染色病理组织切片， Dn为脐带间充质干细胞分泌因子组HE染色病理组织切片， En为脐带间 充质干细胞分泌因子柔性脂质体组HE染色病理组织切片， n1， 2， 3， 4分别为伤口第2， 3， 5， 7天的修复情况。 0063 图9为本发明实施例提供的伤口组织病理切片组。
29、织学评分统计图， 第2天的脐带间 充质干细胞分泌因子组与脐带间充质干细胞分泌因子柔性脂质体组没有统计学差异(P 0.730)， 其他各组之间P0.05， 有统计学差异。 0064 干细胞分泌因子中含有大量有助于伤口修复的细胞因子诱皮肤创伤基底层和浅 层结缔组织处毛囊和腺体的发生与上皮化从而促进皮肤伤口修复， 干细胞分泌因子脂质体 囊泡中的磷脂可以将细胞分泌因子递送到创伤深层， 诱导皮肤深层结缔组织毛囊和腺体的 发生与上皮化。 说 明 书 5/6 页 7 CN 108904534 A 7 0065 以上的具体实施方式， 对本发明的目的、 技术方案和有益效果进行了进一步详细 说明， 所应理解的是， 以上仅为本发明的具体实施方式而已， 并不用于限定本发明的保护范 围， 凡在本发明的精神和原则之内， 所做的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明 的保护范围之内。 说 明 书 6/6 页 8 CN 108904534 A 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/4 页 9 CN 108904534 A 9 图3 图4 说 明 书 附 图 2/4 页 10 CN 108904534 A 10 图5 图6 图7 说 明 书 附 图 3/4 页 11 CN 108904534 A 11 图8 图9 说 明 书 附 图 4/4 页 12 CN 108904534 A 12 。