使用胎盘干细胞的免疫调节.pdf

本发明提供了使用胎盘干细胞和胎盘干细胞群进行免疫调节的方法。本发明还提供了基于免疫调节生产和选择胎盘细胞和细胞群的方法以及包含该种细胞和细胞群的组合物。

1.  体外抑制免疫应答的方法，其包括将大量免疫细胞与一百万至一百亿胎盘干细胞接触，接触的时间足以使所述胎盘干细胞可检测地抑制免疫应答，其中(i)所述的胎盘干细胞可检测地抑制呈递Epstein-Barr病毒(EBV)抗原的B细胞刺激导致的T细胞增殖，(ii)所述胎盘干细胞不是滋养层细胞，(iii)至少80％所述胎盘干细胞：
表达CD200和HLA-G；
表达CD73、CD105和CD200；
表达CD200和OCT-4；或
表达CD73、CD105和HLA-G，
并且其中所述免疫应答是针对同种异体移植、自身免疫疾病、糖尿病、红斑狼疮、风湿性关节炎或者多发性硬化症的免疫应答。

2.  如权利要求1所述的方法，其中所述的免疫细胞为T细胞或NK(自然杀伤)细胞。

3.  如权利要求2所述的方法，其中所述的T细胞为CD4⁺T细胞。

4.  如权利要求2所述的方法，其中所述的T细胞为CD8⁺T细胞。

5.  如权利要求1所述的方法，其中所述的免疫细胞还与非胎盘细胞接触。

6.  如权利要求5所述的方法，其中所述的非胎盘细胞包含CD34⁺细胞。

7.  如权利要求1所述的方法，其包括使用至少1×10⁷个胎盘干细胞。

8.  如权利要求1所述的方法，其包括使用至少1×10⁸个胎盘干细胞。

9.  一百万至一百亿胎盘干细胞在制备用于抑制人个体中的免疫应答的药物中的用途，其中(i)当与大量免疫细胞接触时，所述胎盘干细胞可检测地抑制呈递Epstein-Barr病毒(EBV)抗原的B细胞刺激导致的T细胞增殖，(ii)所述胎盘干细胞不是滋养层细胞，并且(iii)至少80％所述胎盘干细胞：
表达CD200和HLA-G；
表达CD73、CD105和CD200；
表达CD200和OCT-4；或
表达CD73、CD105和HLA-G，
其中所述免疫应答是针对同种异体移植、自身免疫疾病、糖尿病、红斑狼疮、风湿性关节炎或者多发性硬化症的免疫应答。

10.  如权利要求9所述的用途，其中所述的大量免疫细胞为T细胞或NK(自然杀伤)细胞。

11.  如权利要求10所述的用途，其中所述的T细胞为CD4⁺T细胞。

12.  如权利要求10所述的用途，其中所述的T细胞为CD8⁺T细胞。

13.  如权利要求9所述的用途，其中所述的胎盘干细胞被配制成静脉内施用至所述个体。

14.  如权利要求9所述的用途，其中所述的胎盘干细胞被配制成肌肉内施用至所述个体。

15.  如权利要求9所述的用途，其中所述的胎盘干细胞被配制成施用至所述个体的器官中。

16.  如权利要求15所述的用途，其中所述的器官为胰腺。

17.  如权利要求9所述的用途，其中所述的药物还包括向所述个体施用的抗巨噬细胞炎症蛋白(MΙP)-1α或抗MIP-1β抗体，其中所述抗体以足以引起所述个体的血液中MIP-1α或抗MIP-1β的量出现可检测下降的量存在。

18.  如权利要求9所述的用途，其中所述的免疫应答为针对自身免疫疾病的免疫应答。

19.  如权利要求9所述的用途，其中所述免疫应答为针对为糖尿病、红斑狼疮、风湿性关节炎或者多发性硬化症的免疫应答。

20.  如权利要求9所述的用途，其中所述的药物还包括非胎盘细胞。

21.  如权利要求20所述的用途，其中所述的非胎盘细胞包含CD34⁺细胞。

22.  如权利要求21所述的用途，其中所述的CD34⁺细胞为外周血造血祖 细胞、脐带血造血祖细胞或胎盘血造血祖细胞。

23.  如权利要求21所述的用途，其中所述的非胎盘细胞包括间充质干细胞。

24.  如权利要求23所述的用途，其中所述的间充质干细胞为骨髓衍生间充质干细胞。

25.  如权利要求9所述的用途，其中所述的药物包含至少1×10⁷个胎盘干细胞。

26.  如权利要求9所述的用途，其中所述的药物包含至少1×10⁸个胎盘干细胞。

27.  选择胎盘干细胞群的方法，其包括
(a)在混合淋巴细胞反应(MLR)实验中分析大量胎盘干细胞；并且
(b)如果所述大量胎盘干细胞可检测地抑制呈递Epstein-Barr病毒(EBV)抗原的B细胞刺激导致的CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖，则选择所述大量胎盘干细胞，其中所述的胎盘干细胞：
(i)与基底粘附；并且
(ii)其中至少80％所述胎盘干细胞
表达CD200和HLA-G；
表达CD73、CD105和CD200；
表达CD200和OCT-4；或
表达CD73、CD105和HLA-G。

28.  体外制备胎盘干细胞群的方法，其包括：(a)在混合淋巴细胞反应(MLR)实验中分析大量胎盘干细胞；(b)从所述大量胎盘细胞中选择(i)与基底粘附，以及(ii)可检测地抑制呈递Epstein-Barr病毒(EBV)抗原的B细胞刺激导致的CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖的胎盘干细胞；和(c)从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成胎盘干细胞细胞群，其中至少80％所述胎盘干细胞
表达CD200和HLA-G；
表达CD73、CD105和CD200；
表达CD200和OCT-4；或
表达CD73、CD105和HLA-G。

29.  如权利要求27或28所述的方法，其中所述的T细胞和所述的胎盘干细胞以约5:1的比例存在于所述的MLR中。

30.  如权利要求27或28所述的方法，其中所述的胎盘干细胞来源于羊膜、或来源于羊膜和绒毛膜。

31.  如权利要求27或28所述的方法，其中与缺失所述胎盘干细胞的所述MLR中T细胞的增殖量相比，所述的胎盘干细胞在MLR中至少抑制50％的CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖。

32.  如权利要求27或28所述的方法，其中与缺失所述胎盘干细胞的所述MLR中的T细胞的增殖量相比，所述的胎盘干细胞在所述MLR中至少抑制75％的CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖。

33.  如权利要求27或28所述的方法，其中与缺失所述胎盘干细胞的所述MLR中的T细胞的增殖量相比，所述的胎盘干细胞在所述MLR中至少抑制90％的CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖。

34.  如权利要求27或28所述的方法，其中与缺失所述胎盘干细胞的所述MLR中的T细胞的增殖量相比，所述的胎盘干细胞在所述MLR中可至少抑制95％的CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖。

35.  如权利要求27或28所述的方法，其中所述的胎盘干细胞还可检测地抑制自然杀伤(NK)细胞的活性。

36.  根据权利要求28-35任意一项所述的方法制备的分离的胎盘干细胞群。

37.  分离的胎盘干细胞群，其中所述的胎盘干细胞：
(a)与基底粘附；和
(b)可检测地抑制呈递Epstein-Barr病毒(EBV)抗原的B细胞刺激导致的T细胞增殖；并且其中至少80％所述胎盘干细胞
表达CD200和HLA-G；
表达CD73、CD105和CD200；
表达CD200和OCT-4；或
表达CD73、CD105和HLA-G。

38.  包含从胎盘干细胞培养物中分离的培养基的组合物，其中所述的胎盘干细胞：
(a)与基底粘附；
(b)可检测地抑制呈递Epstein-Barr病毒(EBV)抗原的B细胞刺激导致的T细胞增殖；
其中所述的胎盘干细胞已在所述培养基中培养24小时或更长时间，并且其中至少80％所述胎盘干细胞
表达CD200和HLA-G；
表达CD73、CD105和CD200；
表达CD200和OCT-4；或
表达CD73、CD105和HLA-G。

39.  如权利要求38所述的组合物，进一步包括大量的所述胎盘干细胞。

40.  如权利要求38所述的组合物，进一步包括大量的非胎盘细胞。

41.  如权利要求40所述的组合物，其中所述的非胎盘细胞包括CD34⁺细胞。

42.  如权利要求41所述的组合物，其中所述的CD34⁺细胞为外周血造血祖细胞、脐带血造血祖细胞或胎盘血造血祖细胞。

43.  如权利要求38所述的组合物，其中所述的非胎盘细胞包括骨髓来源的间充质干细胞。

44.  如权利要求38所述的组合物，进一步包含抗MIP-1α或抗MIP-1β抗体。

45.  体外抑制免疫应答的方法，其包括将大量免疫细胞与一百万至一百亿胎盘干细胞接触，接触的时间足以使所述胎盘干细胞可检测地抑制免疫应答，其中(i)所述的胎盘干细胞可检测地抑制呈递Epstein-Barr病毒抗原的B细胞刺激导致的T细胞增殖，(ii)所述胎盘干细胞不是滋养层细胞，(iii)所述胎盘干细胞被鉴定为CD200⁺，且(iv)至少80％所述胎盘干细胞：
表达HLA-G；
表达CD73和CD105；或
表达OCT-4，
并且其中所述免疫应答是针对同种异体移植、自身免疫疾病、糖尿病、红斑狼疮、风湿性关节炎或者多发性硬化症的免疫应答。

46.  一百万至一百亿胎盘干细胞在制备用于抑制人个体中的免疫应答的药物中的用途，其中(i)当与大量免疫细胞接触时，所述胎盘干细胞可检测地抑制呈递Epstein-Barr病毒抗原的B细胞刺激导致的T细胞增殖，(ii)所述胎盘干细胞不是滋养层细胞，(iii)所述胎盘干细胞被鉴定为CD200+，且(iv)至少80％所述胎盘干细胞：
表达HLA-G；
表达CD73和CD105；或
表达OCT-4，
其中所述免疫应答是针对同种异体移植、自身免疫疾病、糖尿病、红斑狼疮、风湿性关节炎或者多发性硬化症的免疫应答。

使用胎盘干细胞的免疫调节
本申请是申请日为2006年10月13日、申请号为200680045964.1、名称为“使用胎盘干细胞的免疫调节”的发明申请的分案。
1.技术领域
本发明提供了使用胎盘干细胞调节免疫系统以及对抗原的免疫应答的方法。本发明还提供了包含了用于免疫调节的胎盘干细胞的组合物，以及移植组织和器官的方法，该方法包括施用胎盘干细胞以预防或抑制免疫介导的排斥。
2.背景技术
人干细胞是能够生成各种成熟人细胞系的全能或多能前体细胞。有证据显示干细胞可用于再生(repopulate)多种组织(如非全部)并恢复生理和解剖功能。
已经表征了许多不同类型的哺乳动物干细胞。例如，参见Caplan等人，美国专利号5,486,359(人间充质干细胞)；Boyse等人，美国专利号5,004,681(胎儿及新生儿造血干和祖细胞)；Boyse等人，美国专利号5,192,553(相同)；Beltrami等人，Cell114(6):763-766(2003)(心脏干细胞)；Forbes等人,J.Pathol197(4):510-518(2002)(肝干细胞)。脐带血和来自于脐带血的总有核细胞曾被用于在移植中部分或完全恢复接受剥括疗法的患者的造血功能。
胎盘是特别引人关注的干细胞来源。由于哺乳动物胎盘大量存在且通常作为医疗废弃物被抛弃，它们代表了具有医学用途的干细胞的独特来源。本发明提供了这些分离的胎盘干细胞、胎盘干细胞群及它们的使用方法。
3.发明概述
本发明提供了使用多种胎盘干细胞或脐带干细胞、胎盘干细胞群或脐带干细胞群进行免疫抑制的方法，以及包含该干细胞和/或由该干细胞制备的组合物。本发明还提供了组合物，包括包含了具有免疫抑制性质的胎盘干细胞或脐带干细胞的组合物。本发明进一步提供了基于其调节免疫应答能力选择的胎盘细胞群或脐带干细胞群，以及具有免疫调节性质的组合物。
一方面，本发明提供了抑制或减少免疫应答的方法，其包括将大量免疫细胞与大量胎盘干细胞接触，接触时间足以使所述胎盘干细胞可检测地抑制 免疫应答，其中所述的胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测试中可检测地抑制T细胞增殖。在具体的实施方式中，所述的胎盘干细胞：表达CD200和HLA-G；表达CD73、CD105和CD200；表达CD200和OCT-4；表达CD73、CD105和HLA-G；表达CD73和CD105，并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含该大量胎盘干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成；和/或表达OCT-4并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含该大量胎盘干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成。在另一具体实施方式中，所述的大量免疫细胞为T细胞或NK(自然杀伤)细胞。在更具体的实施方式中，所述T细胞为CD4⁺T细胞。在另一更具体的实施方式中，所述T细胞为CD8⁺T细胞。在另一具体实施方式中，所述接触在体外进行。在另一具体实施方式中，所述接触在体内进行。在更具体的实施方式中，所述体内接触在哺乳动物个体(例如，人)中进行。在另一更具体的实施方式中，所述的接触包括将所述胎盘细胞进行静脉内、肌肉内施用，或施用至所述个体的器官(例如，胰腺)中。该抑制免疫应答的方法，特别在体内时，可进一步包括向所述个体(例如，向哺乳动物)施用如抗巨噬细胞炎症蛋白(MΙP)-1α或抗MIP-1β抗体，其中所述抗体以足以引起(例如在所述个体的血液中的)MIP-1α或抗MIP-1β的量出现可检测的下降的量施用。
在本方法的更具体的实施方式中，所述表达CD200和HLA-G的胎盘干细胞还表达CD73和CD105，即，为CD73⁺和CD105⁺。在另一个具体实施方式中，所述胎盘细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺和CD105⁺。在另一个具体实施方式中，当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时，所述大量胎盘干细胞促进包含该胎盘干细胞的分离胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成。
在本方法的另一更具体的实施方式中，所述表达CD73、CD105和CD200的胎盘干细胞也是HLA-G⁺。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-和HLA-G⁺。在另一具体实施方式中，当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时，所述胎盘干细胞促进包含该胎盘干细胞的分离胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成。
在本方法的另一更具体的实施方式中，所述表达CD200和OCT-4的胎盘干细胞还表达CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方式中，所述的胎盘干细胞为HLA-G⁺。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在更为具体的实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、 CD105⁺和HLA-G⁺。在另一具体实施方式中，当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时，所述胎盘干细胞促进包含胎盘干细胞的分离胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成。
在另一更具体的实施方式中，所述表达CD73、CD105和HLA-G的胎盘干细胞同样是CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方式中，所述的胎盘干细胞为OCT-4⁺。在另一具体实施方式中，所述的胎盘干细胞为CD200⁺。在更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一具体实施方式中，当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时，所述干细胞促进包含该胎盘干细胞的分离胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成。
在另一更具体的实施方式中，所述的表达CD73和CD105、并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含所述胎盘干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成的胎盘干细胞同样是CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方式中，所述的胎盘干细胞为OCT-4⁺。在另一具体实施方式中，所述的胎盘干细胞为CD200⁺。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞为OCT-4⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-。
在另一更具体的实施方式中，所述的表达OCT-4、并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含所述胎盘干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成的胎盘干细胞同样是CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方式中，所述的胎盘干细胞为CD200⁺。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞为CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-。
在减少或抑制免疫应答的方法的另一具体实施方式中，所述免疫应答为移植物抗宿主病。在另一具体实施方式中，所述的免疫应答为自免疫性疾病，例如，糖尿病、红斑狼疮或风湿性关节炎。
在本方法的另一具体实施方式中，所述大量的免疫细胞还与大量非胎盘细胞接触。这样的非胎盘细胞可包含如CD34⁺细胞。在更具体的实施方式中，所述的CD34⁺细胞为外周血造血祖细胞、脐带血造血祖细胞或胎盘血造血祖细胞。在另一具体实施方式中，所述的非胎盘细胞包含了间充质干细胞。在更具体的实施方式中，所述的间充质干细胞为骨髓衍生间充质干细胞。在另一具体实施方式中，所述的非胎盘细胞包含在同种异体移植物中。
所述方法可使用实现免疫应答的可检测抑制所需量的胎盘干细胞。例如，用于和大量免疫细胞接触的大量胎盘干细胞可包含1×10⁵个胎盘干细胞、1×10⁶个胎盘干细胞、1×10⁷个胎盘干细胞、或1×10⁸个胎盘干细胞或更多。
本发明进一步提供了制备包含胎盘干细胞的细胞群的方法，该胎盘干细胞是基于其调节(例如，抑制)免疫应答的能力进行选择的。例如，在一个实施方式中，本发明提供了选择胎盘细胞群的方法，其包括(a)在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中分析大量的胎盘细胞；并且(b)如果所述大量胎盘干细胞在MLR(混合淋巴细胞反应)中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖，则选择所述的大量胎盘干细胞，其中所述的胎盘干细胞：(i)与基底粘附；并且(ii)表达CD200和HLA-G，或表达CD73、CD105和CD200，或表达CD200和OCT-4，或表达CD73、CD105和HLA-G，或表达CD73和CD105，并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含该干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成，或表达OCT-4，并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含该干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成。
本发明还提供了制备细胞群的方法，其包括从大量细胞中选择(a)与基底粘附，(b)表达CD200和HLA-G，以及(c)在MLR(混合淋巴细胞反应)中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖的胎盘干细胞；和从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。本发明还提供了制备细胞群的方法，其包括从大量细胞中选择(a)与基底粘附，(b)表达CD73、CD105和CD200，以及(c)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖的胎盘干细胞；和从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。本发明还提供了制备细胞群的方法，其包括选择(a)与基底粘附，(b)表达CD200和OCT-4，以及(c)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖的胎盘干细胞；和从其它细胞中分离所述的胎盘干细胞以形成细胞群。本发明还提供了制备细胞群的方法，其包括从大量细胞中选择(a)与基底粘附，(b)表达CD73和CD105，(c)在适于拟胚体形成的条件下培养时形成拟胚体，以及(d)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖的胎盘干细胞；和从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。本发明还提供了制备细胞群的方法，其包括从大量细胞中选择(a)与基底粘附，(b)表达CD73、CD105和HLA-G，以及(c)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖的胎盘干细胞；和从其它细胞中分离所述胎盘细胞以形成细胞群。本发明还提供了制备细胞群的方法，其包括从大量细胞中选择(a)与基底粘附，(b)表达OCT-4，(c)在适于拟胚体形成的条件下培养时形成拟胚体，以及(d)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖的胎盘干细胞；和从其它细胞中分离所述胎盘细胞以形成细胞群。
本文中任何实施方式的具体实施方式中，所述T细胞和所述胎盘干细胞在MLR中以，例如约为20:1、15:1、10:1、5:1、2:2、1:1、1:2、1:5、1:10或1:20，优选5:1的比例存在。
在另一具体实施方式中，所述方法包括选择表达ABC-p的细胞。在另一 具体实施方式中，该方法包括选择呈现间充质干细胞的至少一个特定特征的细胞。在更具体的实施方式中，所述的间充质干细胞的特定特征为CD29的表达、CD44的表达、CD90的表达或前述组合的表达。在本方法的另一具体实施方式中，所述选择通过使用抗体实现。在另一具体实施方式中，所述选择通过使用流式细胞计数法实现。在另一具体实施方式中，所述选择通过使用磁珠实现。在另一具体实施方式中，所述选择通过荧光激活细胞分选法实现。在上述方法的另一具体实施方式中，所述细胞群被扩增。
本方法中所用的胎盘干细胞可来自于全胎盘，或来自于胎盘的任何部分。例如，在各种实施方式中，所述胎盘干细胞主要来自于(或仅来自于)羊膜、或羊膜和绒毛膜、或来自于胎盘灌注过程中采集的胎盘灌注液。在具体实施方式中，与缺失所述胎盘干细胞的所述MLR中的T细胞增殖量相比，所述的胎盘干细胞在所述MLR中可至少抑制50％、70％、90％或95％的CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞还可检测地抑制自然杀伤(NK)细胞的活性。
本发明进一步提供了包含胎盘干细胞的分离的细胞群，该胎盘干细胞通过本文所述的用于选择免疫调节的胎盘细胞群的任何方法制备，其中该群在MLR中已被鉴定为可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖。例如，在一个实施方式中，本发明提供了包含了分离的胎盘干细胞的细胞群，其中所述胎盘干细胞：(a)与基底粘附，(b)表达CD200和HLA-G，或表达CD73、CD105和CD200，或表达CD200和OCT-4，或表达CD73、CD105和HLA-G，或表达CD73和CD105，并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含该胎盘干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成，或表达OCT-4，并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含该胎盘干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成，其中这样的群在MLR中已被鉴定为可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖。
本发明还提供了包含胎盘干细胞的分离的细胞群，该胎盘干细胞(a)与基底粘附，(b)表达CD200和HLA-G，并且(c)在MLR中已被鉴定为可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖。本发明还提供了包含胎盘干细胞的分离的细胞群，该胎盘干细胞(a)与基底粘附，(b)表达CD73、CD105和CD200，并且(c)在MLR中已被鉴定为可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖。本发明还提供了包含胎盘干细胞的分离的细胞群，该胎盘干细胞(a)与基底粘附，(b)表达CD200和OCT-4，并且(c)在MLR中已被鉴定为可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖。本发明还提供了包含胎盘干细胞的分离的细胞群，该胎盘干细胞(a)与基底粘附，(b)表达CD73和CD105，(c)在适于拟胚体形成的条件下培养时形成拟胚体，并且(d)在MLR中已被鉴定为可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细 胞增殖。本发明还提供了包含胎盘干细胞的分离的细胞群，该胎盘干细胞(a)与基底粘附，(b)表达CD73、CD105和HLA-G，并且(c)在MLR中已被鉴定为可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖。本发明还提供了包含胎盘干细胞的分离的细胞群，该胎盘干细胞(a)与基底粘附，(b)表达OCT-4，(c)在适于拟胚体形成的条件下培养时形成拟胚体，并且(d)在MLR中已被鉴定为可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖。
在所述组合物的更具体的实施方式中，所述表达CD200和HLA-G的胎盘干细胞还表达CD73和CD105，即为CD73⁺和CD105⁺。在另一个具体实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方式中，当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时所述大量胎盘干细胞促进包含所述胎盘干细胞的分离胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成。
在所述组合物的更具体的实施方式中，所述表达CD73、CD105和CD200的胎盘干细胞也是HLA-G⁺。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-和HLA-G⁺。在另一具体实施方式中，当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时，所述胎盘干细胞促进包含所述胎盘干细胞的分离胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成。
在所述组合物的另一更具体的实施方式中，所述表达CD200和OCT-4的胎盘干细胞还表达CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方式中，所述的胎盘干细胞为HLA-G⁺。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一个具体实施方式中，当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时所述胎盘干细胞促进包含所述胎盘干细胞的分离胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成。
在所述组合物的另一更具体的实施方式中，所述表达CD73、CD105和HLA-G的胎盘干细胞同样是CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一具体实施方式中，所述的胎盘干细胞为OCT-4⁺。在另一具体实施方式中，所述的胎盘干细胞为CD200⁺。在更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一具体实施方式中，当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时所述干细胞促进包含所述胎盘干细胞的分离胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成。
在所述组合物的另一更具体的实施方式中，所述的表达CD73和CD105，并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含所述胎盘干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成的胎盘干细胞同样是CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方式中，所述的胎盘干细胞为OCT-4⁺。在另一具体实施方式中，所述的胎盘干细胞为CD200⁺。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞为OCT-4⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-。
在所述组合物的另一更具体的实施方式中，所述的表达OCT-4，并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含所述胎盘干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成的胎盘干细胞同样是CD73⁺和CD105⁺。在另一具体实施方式中，所述的胎盘干细胞是CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一具体实施方式中，所述的胎盘干细胞为CD200⁺。在另一具体实施方式中，所述的胎盘干细胞为CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-。
本发明进一步提供了免疫调节组合物。在一个实施方式中，本发明提供了包含本文所述的任意细胞群的培养物上清液的组合物。在另一实施方式中，本发明提供了包含胎盘干细胞培养物的培养基的组合物，其中所述胎盘干细胞：(a)与基底粘附；(b)表达CD200和HLA-G，或表达CD73、CD105和CD200，或表达CD200和OCT-4，或表达CD73、CD105和HLA-G，或表达CD73和CD105，并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含该胎盘干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成，或表达OCT-4，并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含该胎盘干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成；并且(c)在MLR(混合淋巴细胞反应)中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖，其中所述的胎盘干细胞培养物已在所述培养基中培养24小时或更长时间。在具体实施方式中，所述组合物包含了大量所述胎盘干细胞。在另一个具体实施方式中，所述组合物包含了大量非胎盘细胞。在更具体的实施方式中，所述非胎盘细胞包括CD34⁺细胞。该CD34⁺细胞可以是，例如，外周血造血祖细胞、脐带血造血祖细胞或胎盘血造血祖细胞。在另一具体实施方式中，所述非胎盘细胞包括间充质干细胞。在更具体的实施方式中，所述间充质干细胞为骨髓衍生间充质干细胞。在另一具体实施方式中，该组合物进一步包含抗MIP-1α或抗MIP-1β抗体。
在另一具体实施方式中，任意前述组合物均包含基质。在更具体的实施方式中，所述基质为三维骨架。在另一更具体的实施方式中，所述基质包含胶原、明胶、层粘蛋白、纤维连接蛋白、果胶、鸟氨酸或玻连蛋白。在另一更具体的实施方式中，该基质是羊膜或羊膜衍生生物材料。在另一更具体的实施方式中，所述基质包含胞外膜蛋白。在另一更具体的实施方式中，所述基质包括合成化合物。在另一更具体的实施方式中，所述基质包括生物活性 化合物。在另一更具体的实施方式中，所述生物活性化合物是生长因子、细胞因子、抗体或小于5,000道尔顿的有机分子。
本发明进一步提供了低温保存的干细胞群，例如，包含本文所述的胎盘干细胞的细胞群，其中该细胞群具有免疫调节作用。例如，本发明提供了CD200⁺、HLA-G⁺胎盘干细胞群，其在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中已被鉴定为可检测地抑制T细胞增殖，其中所述干细胞已被低温保存，且其中所述的群装在容器中。本发明还提供了CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞群，其在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中已被鉴定为可检测地抑制T细胞增殖，其中所述的干细胞已被低温保存，且其中所述的群装在容器中。本发明还提供了CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞群，其在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中已被鉴定为可检测地抑制T细胞增殖，其中所述的干细胞已被低温保存，且其中所述的群装在容器中。本发明还提供了CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞群，其在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中已被鉴定为可检测地抑制T细胞增殖，其中所述的干细胞已被低温保存，且其中所述的群装在容器中，且当所述的干细胞与胎盘细胞群在适于拟胚体形成的条件下培养时可促进一或多个拟胚体的形成。本发明进一步提供了CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺胎盘干细胞群，其在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中已被鉴定为可检测地抑制T细胞增殖，其中所述的细胞已被低温保存，且其中所述的群装在容器中。本发明还提供了在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中已被鉴定为可检测地抑制T细胞增殖的OCT-4⁺胎盘干细胞群，其中所述的干细胞已被低温保存，其中所述的群装在容器中，且当所述的干细胞与胎盘细胞群在适于拟胚体形成的条件下培养时可促进一或多个拟胚体的形成。
在任意的前述低温保存群的具体实施方式中，所述的容器为袋子。在不同的具体实施方式中，所述的群包含大约、至少或至多1×10⁶个所述干细胞、5×10⁶个所述干细胞、1×10⁷个所述干细胞、5×10⁷个所述干细胞、1×10⁸个所述干细胞、5×10⁸个所述干细胞、1×10⁹个所述干细胞、5×10⁹个所述干细胞或1×10¹⁰个所述干细胞。在任意的前述低温保存群的其它具体实施方式中，所述干细胞已传代大约、至少、或不超过5次、不超过10次、不超过15次或不超过20次。在任意的前述低温保存群的另一具体实施方式中，所述的干细胞已在所述容器中扩增。
3.1定义
本文所用的术语“SH2”指与标记CD105上的表位结合的抗体。因此，被称为SH2⁺的细胞为CD105⁺。
本文所用的术语“SH3”和“SH4”指与标记CD73上的表位结合的抗体。因 此，被称为SH3⁺和/或SH4⁺的细胞为CD73⁺。
本文所用的术语“分离的干细胞”指与获得该干细胞的组织(例如，胎盘)中的其它、非干细胞基本分离的干细胞。例如，如果在该干细胞的采集和/或培养过程中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少99％的与该干细胞天然相随的非干细胞从该干细胞中去除，则干细胞是“分离的”。
本文所用的术语“分离的细胞群”指与获得该细胞群的组织(例如，胎盘)中的其它细胞充分分离的细胞群。例如，如果在该干细胞群的采集和/或培养过程中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少99％的与该干细胞群天然相随的细胞从该干细胞群去除，则干细胞群是“分离的”。
本文所用的术语“胎盘干细胞”指来自于哺乳动物胎盘的干细胞或祖细胞，不考虑形态、细胞表面标记或原代培养后的传代次数，该细胞与组织培养基底(例如，组织培养塑料或涂覆纤维连接蛋白的组织培养板)相粘附。然而本文所用的术语“胎盘干细胞”不用于指滋养层细胞。如果细胞保留了干细胞的至少一种特征，例如，分化成为至少一种其它类型细胞的能力等，则该细胞被认为是“干细胞”。
如本文所用，当具体标记是可检测的时，则干细胞对该标记呈“阳性”。例如，由于CD73以可检测地大于背景(例如，与同型对照相比)的量在胎盘干细胞上可检测，因此该胎盘干细胞对CD73呈阳性。当标记可用于将该细胞与至少一种其它细胞类型相区分，或可在存在于该细胞或由该细胞表达时被用于选择或分离该细胞，则该细胞对该标记也呈阳性。
本文所用的“免疫调节”和“免疫调节的”指引起或具有能力引起免疫应答的可检测的变化，以及引起免疫应答的可检测变化的能力。
本文所用的“免疫抑制”和“免疫抑制的”指引起或具有能力引起免疫应答的可检测的减少，以及引起免疫应答的可检测地抑制的能力。
4.附图说明
图1：来源于灌注(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、或羊膜-绒毛膜板(D)、或脐带干细胞(E)的胎盘干细胞的活力。X轴的数字指获得该干细胞的胎盘。
图2：通过FACSCalibur测定的来源于灌注(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、或羊膜-绒毛膜板(D)、或脐带干细胞(E)的HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺细胞百分比。X轴的数字指获得该干细胞的胎盘。
图3：通过FACS Aria测定的来源于灌注(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、或羊膜-绒毛膜板(D)、或脐带干细胞(E)的HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺细胞百分比。X轴的数字指获得该干细胞的胎盘。
图4：来自于胎盘灌注液的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、 CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表达。
图5：来自于羊膜的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表达。
图6：来自于绒毛膜的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表达。
图7：来自于羊膜-绒毛膜板的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表达。
图8：来自于脐带的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表达。
图9：来自于灌注(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、羊膜-绒毛膜板(D)或脐带(E)的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200表达的平均表达。
图10A和10B：混合淋巴细胞反应(MLR)是天然免疫应答的模型，并受到胎盘干细胞的抑制。羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)^Low细胞的百分比可从门控“活的”以及CD8⁺和CD4⁺T细胞选通进行监测(分别为图10A和10B)。该百分比在六日MLR后上升(图10C和10D，MLR曲线)，且添加胎盘干细胞(图3C和3D，PMLR曲线)，该作用在CD8⁺和CD4⁺T细胞区室中均被逆转。
图11：来自于羊膜绒毛膜板(AC)和脐带间质(UC)的胎盘衍生干细胞抑制异源-MLR。该MLR采用CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞或是等量的CD4⁺和CD8⁺T细胞进行。横坐标：抑制增殖的百分比。
图12：胎盘干细胞和脐带干细胞抑制异源-MLR。在圆底96孔板孔中的六日试验。胎盘细胞:T细胞:树突细胞＝约1:10:1。从羊膜-绒毛膜(AC)、羊膜(AM)或脐带(UC)中获取干细胞。FB＝纤维原细胞。BM＝骨髓衍生间充质干细胞。
图13：来自不同供体的胎盘干细胞以不同程度抑制异源-MLR。该图对来自称为61665和63450的两种胎盘供体的胎盘干细胞在MLR中的抑制进行了比较。来自于胎盘63540的干细胞显示出比来自61665的干细胞对MLR抑制程度更大。
图14：17日回归试验和改进的胎盘干细胞回归试验。X轴代表了添加至试验的胎盘干细胞的数量。存活CD23⁺LCL的数量(淋巴母细胞样细胞系，人工创建的转化B细胞系)在Y轴上测量。
图15：胎盘干细胞在六日回归试验中对T细胞增殖的抑制。使用CFSE染色的T细胞建立回归试验。6日后，对T细胞增殖进行评估。显示了来自羊膜-绒毛膜(AC)、脐带(UC)、羊膜(AM)或骨髓(BM)的干细胞对T细胞增殖 的相对抑制。
图16：在MLR中引入transwell嵌块，从T细胞中分离胎盘细胞同时允许培养基交换时的抑制百分比变化。在25,000、50,000、75,000或100,000/反应时，脐带干细胞显示了相对高水平的抑制和为实现抑制对高滴度中的细胞与细胞接触的相对高度需求。
图17：以12,500(UC OP/TW12.5)至100,000(UC OP/TW100)添加的脐带间质干细胞通过膜与NLR膜分离(TW)或与MLR接触(OP)。使用等量的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，并计算MLR的抑制百分比(％CFSE^Low＝89％)。
图18：胎盘干细胞剂量和细胞与细胞接触依赖性的关系不呈线性。由图17所给的值计算引入嵌块后MLR抑制的变化。
图19：胎盘干细胞和BMSC对T细胞应答的差异抑制。由PDAC或BMSC带来的抑制度可通过CFSE^Lo选通中的MLR T细胞百分比(超过70％)与贴壁细胞MLR的比较进行计算。该MLR或从贴壁细胞分离(transwell)，或在开口孔中进行(open)。X轴给出了添加至500,000T细胞和50,000DC的贴壁细胞数量(以千计)。贴壁细胞与T细胞的比例从1:5至1:40。
图20：对胎盘干细胞和骨髓衍生干细胞免疫抑制的不同的细胞与细胞接触要求。由图15所给的抑制数据，针对贴壁细胞/T比例(除UC:n＝2外，n＝3)计算和显示了接触依赖性。
图21：PDAC T细胞抑制不必需T调节细胞。回归试验可采用全PBMC(红和蓝图)或去除了T调节细胞的PBMC(绿图)进行，两者均以CFSE染色，并在某些条件下(蓝和绿图)添加UC PDAC。N＝1。
图22：在次级MLR中的CFSE^Hi细胞的增殖。从使用CFSE染色的细胞的PDAC MLR，在FACS Aria上分离CFSE^Hi T细胞。该细胞被用于MLR中。N＝1。
图23：受抑制干细胞MLR的上清液在75％的替换下不抑制MLR。进行UC(PUC)、AC(PAC)和BMSC(PBM)MLR，且对MLR的抑制均超过50％。来自该实验的上清液可用于替换用于新鲜MLR的200μl培养基中的10至150μl。来自T细胞和AC(T/AC)或是T细胞和骨髓衍生干细胞(T/BM)的共培养物的培养基也以相同方式作为对照使用(N＝2)。
图24A、24B：预培养T细胞和贴壁细胞不影响MLR抑制。在两个独立试验中使用来自2个供体的T细胞。在添加DC(在0日，A)或CFSE⁺CD3⁺T细胞(B)前，将成熟DC(A)或CFSE染色CD3⁺T细胞(B)与脐带干细胞(UC)或骨髓衍生干细胞培养指定天数，从而开始MLR。然后该贴壁细胞MLR照常进行六天。N＝2。
图25A、25B：A.在MLR以及具有胎盘干细胞或骨髓-衍生干细胞的MLR 中MIP-1α和MIP-1β的分泌，与MLR抑制呈反比。B：来自于相同实验的T细胞和NK细胞CFSE数据。从MLR收集的上清液显示于图14B，并对MIP-1α和MIP-1β进行分析。B:如上述进行MLR，并观察到平均55％(T细胞)或83％(NK细胞)CFSE^Low细胞。对干细胞添加的抑制效果进行计算。N＝2(NK部分:N＝1)。
图26：在改良的回归试验和MLR上清液测量MCP-1。MLR的胎盘干细胞抑制和回归试验与趋化蛋白MCP-1的分泌相关联。AC:来自羊膜-绒毛膜板的干细胞。UC:来自脐带的干细胞。浅色条：MLR试验结果。深色条：回归试验结果。Y轴：在试验溶液中MCP-1的pg数。
图27：在改良MLR和回归试验上清液中的IL-6测量。MLR和回归试验的胎盘干细胞抑制与IL-6分泌相关。AC:来自羊膜-绒毛膜板的干细胞。UC:来自脐带的干细胞。浅色条：MLR试验结果。深色条：回归试验结果。Y轴：在试验溶液中IL-6的pg数。
5.发明详述
5.1使用胎盘干细胞进行免疫调节
本发明提供了通过将免疫细胞和大量胎盘干细胞接触对免疫细胞或大量免疫细胞的活性(例如，增殖)的调节(例如，抑制)。在一个实施方式中，本发明提供了抑制免疫应答的方法，其包括将大量免疫细胞与大量胎盘干细胞接触，该接触的时间足以使所述胎盘干细胞对免疫应答可检测地抑制，其中所述的胎盘干细胞能在混合淋巴细胞反应(MLR)测试中可检测地抑制T细胞增殖。
胎盘干细胞为，例如，本文别处所述的胎盘干细胞(参见5.2节)。用于免疫抑制的胎盘干细胞可从单独胎盘或多个胎盘获得。用于免疫抑制的胎盘干细胞还可来自于单个物种(例如，目标接受者物种或免疫细胞功能将被减少或抑制的物种)或可来自于多个物种。
本方法中的“免疫细胞”指免疫系统的任何细胞，特别是T细胞和NK(自然杀伤)细胞。因此，在本方法的不同实施方式中，胎盘干细胞与大量的免疫细胞接触，其中大量的免疫细胞为，或包括，大量的T细胞(例如，大量的CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞)和/或自然杀伤细胞。本方法中的“免疫应答”可以是免疫细胞对通常由免疫细胞感知的刺激的任意应答，例如，对抗原存在的应答。在不同实施方式中，免疫应答可以是在对外源抗原(例如在灌注或移植存在的抗原)或自身抗原(例如在自身免疫疾病中)的应答中T细胞(例如，CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞)的增殖。该免疫应答还可以是移植物中包含的T细胞的增殖。该免疫应答还可以是自然杀伤(NK)细 胞的任何活性，树突细胞的成熟等。该免疫应答还可以是一类或多类免疫细胞活性的局部、组织或器官特异的或是全身的作用，例如，该免疫应答可以是移植物抗宿主病、炎症、炎症相关的瘢痕组织的形成以及自身免疫症状(例如，风湿性关节炎、I型糖尿病、红斑狼疮等)等。
文中的“接触”包括将胎盘干细胞和免疫细胞一同放在单个容器(例如，培养皿、瓶、小瓶等)中或放在体内如同一个体(例如，哺乳动物，例如，人)中。在优选实施方式中，该接触持续足够长的时间，且用足够量的胎盘干细胞和免疫细胞接触，使得免疫细胞的免疫功能的变化可检测。更优选地，在不同的实施方式中，与缺失胎盘干细胞时的免疫功能相比，所述接触足以抑制至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的免疫功能(例如，T细胞应答抗原的增殖)。体内环境下的该种抑制可通过体外试验(见下文)进行测定；即，对接受者个体中具体数量的胎盘干细胞和一定数量的免疫细胞，体外试验中的抑制程度可被外推至在个体之中的抑制程度。
在某些实施方式中，本发明提供了在体外使用胎盘干细胞调节免疫应答、或大量的一种或多种类型免疫细胞的活性的方法。将胎盘干细胞和大量免疫细胞接触可包括在相同的物理空间内将该胎盘干细胞和免疫细胞合并从而使大量胎盘干细胞中至少一部分与大量免疫细胞中的至少一部分相互作用；将胎盘干细胞和免疫细胞以共同的培养基维持在分离的物理空间内；或者可包括将胎盘干细胞或免疫细胞的培养物的培养基与另一类型的细胞接触(例如，从胎盘干细胞培养物中获取培养基并将分离的免疫细胞重悬浮在该培养基中)。在具体实施例中，该接触为混合淋巴细胞反应(MLR)。
例如该种接触可以发生在设计来检测特定量的胎盘干细胞的免疫调节(例如，免疫抑制)程度的实验环境中。该样的实验环境可以是，例如混合淋巴细胞反应(MLR)或回归试验。进行MLR和回归试验的方法为本领域所公知。例如,参见Schwarz,"The Mixed Lymphocyte Reaction:An In Vitro Test for Tolerance,"J Exp.Med.127(5)：879-890(1968)；Lacerda等人,"Human Epstein-Barr Virus(EBV)-Specific Cytotoxic T Lymphocytes Home Preferentially to and Induce Selective Regressions of Autologous EBV-Induced B Lymphoproliferations in Xenografted C.B-17Scid/Scid Mice,"J Exp.Med.183：1215-1228(1996)。在优选实施方式中，进行MLR，其中将大量的胎盘干细胞与大量免疫细胞(例如，淋巴细胞，例如，CD3⁺、CD4⁺和/或CD8⁺T淋巴细胞)接触。
MLR可被用于测定大量胎盘干细胞的免疫抑制能力。例如，可使用MLR对大量胎盘干细胞进行测试，包括以大约10:1:2的比例合并CD4⁺或CD8⁺T细胞、树突细胞(DC)和胎盘干细胞，其中所述T细胞用染料，例如可以分配 进入子代细胞的CFSE染色，且其中允许该T细胞增殖约6天。如果当与存在DC且胎盘干细胞缺失时的T细胞增殖相比在胎盘干细胞存在时T细胞在6日的增殖可检测地减少，则该大量胎盘干细胞具有免疫抑制性。在该MLR中，胎盘干细胞可被解冻或从培养物中收集。将约20,000个胎盘干细胞重悬浮于100μl的培养基(RPMI1640、1mM HEPES缓冲液、抗生素以及5％混合人血清)中，并允许其附着在孔底部2小时。CD4⁺和/或CD8⁺T细胞可从全外周血单核细胞Miltenyi磁珠中分离。以CFSE将细胞染色，每孔添加总计100,000个T细胞(单独的CD4⁺T细胞，单独的CD8⁺T细胞，或等量的CD4⁺和CD8⁺T细胞)。将孔中的体积加至200μl，并进行MLR。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了抑制免疫应答的方法，其包括将大量免疫细胞与大量胎盘干细胞接触，该接触的时间足以使所述胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测试中可检测地抑制T细胞增殖。在一个实施方式中，在MLR中采用的所述胎盘干细胞代表了更大胎盘干细胞群中的胎盘干细胞样本或等份。
从不同胎盘或相同胎盘中的不同组织获取的胎盘干细胞群可具有不同的调节免疫细胞活性的能力，例如，具有不同的抑制T细胞活性或增殖或NK细胞活性的能力。因此在使用前检测特定胎盘干细胞群的免疫抑制能力是理想的。该种能力可通过在MLR或回归试验中测试该胎盘干细胞群的样本进行测定。在一个实施方式中，采用该样本进行MLR，并在该试验中检测胎盘干细胞所产生的免疫抑制程度。然后将该免疫抑制程度归因于被取样的胎盘干细胞群。因此，MLR可被用作检测特定胎盘干细胞群抑制免疫功能的绝对和相对能力的方法。可对MLR的参数进行更改以提供更多数据或最好地检测胎盘干细胞样本的免疫抑制能力。例如，由于胎盘干细胞的免疫抑制表现出与试验中的胎盘干细胞的数量大致成比例上升，因此在一个实施方式中，可采用两种或多种数量的胎盘干细胞进行MLR，例如，每个反应中采用1×10³、3×10³、1×10⁴和/或3×10⁴个胎盘干细胞。试验中胎盘干细胞的数量相对于T细胞的数量的比例也可变化。例如，尽管可采用相对更大量的胎盘干细胞或T细胞，试验中胎盘干细胞和T细胞可以例如约10:1至约1:10的任何比例存在，优选以约1:5的比例存在。
可以类似方式使用回归试验。
本发明还提供了在体内使用胎盘干细胞调节免疫应答、或大量一类或多类免疫细胞的活性的方法。胎盘干细胞和免疫细胞可以被接触，例如在大量胎盘干细胞接受者个体中被接触。在一个实施方式中，当该接触在个体中进行时，该接触在该个体的外源胎盘干细胞(即，并非来自该个体的胎盘干细胞)和大量内源免疫细胞之间进行。在具体实施方式中，该个体内的免疫细胞为 CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和/或NK细胞。
该种采用胎盘干细胞进行的免疫抑制可有利于任何由不适当或不希望的免疫应答引起或恶化的或与之相关的任何病症。例如，胎盘干细胞介导的免疫调节(例如，免疫抑制)可用于抑制个体免疫系统对其自身的一个或多个组织引起的不适当免疫应答。因此，在不同实施方式中，本发明提供了抑制免疫应答的方法，其中该免疫应答是自身免疫疾病，例如，红斑狼疮、糖尿病、风湿性关节炎或多发性硬化症。
大量胎盘干细胞和大量的一种或多种类型免疫细胞之间的接触可，在例如向接受者个体嫁接或移植一种或多种类型的组织时，在体内发生或附随发生。该些组织可以是，例如，骨髓或血液；器官；特定组织(例如，皮肤移植)；复合组织同种异体移植物(即，包含两种或多种不同类型组织的移植物)等。就此而言，该胎盘干细胞可用于抑制包含在接受者个体内、在移植组织或嫁接物内、或包含在两者内的一种或多种免疫细胞的一种或多种免疫应答。该种接触可在嫁接或移植之前、同时和/或之后进行。例如，胎盘干细胞可在移植或嫁接时施用。另外，胎盘干细胞还可以在移植或嫁接之前(例如，移植或嫁接前约1、2、3、4、5、6或7日)施用。或者，胎盘干细胞还可以在移植或嫁接之后(例如，移植或嫁接后约1、2、3、4、5、6或7日)向移植或嫁接接受者施用。优选地，可在接受者个体或移植组织或嫁接物的免疫应答的任何可检测表现或症状(例如，移植物抗宿主病的可测表现或症状或者可测炎症)成为可检测前将大量胎盘干细胞与大量胎盘干细胞相接触。
在另一实施方式中，个体内的接触主要在外源胎盘干细胞和外源祖细胞或干细胞(例如，分化成为免疫细胞的外源祖细胞或干细胞)之间进行。例如，配合癌症治疗进行部分或完全免疫净化或骨髓细胞清除的个体可接受胎盘干细胞与一种或多种其它类型的干细胞或祖细胞的组合。例如，胎盘干细胞可与大量CD34⁺细胞(例如，CD34⁺造血干细胞)联用。这些CD34⁺细胞可以是，例如，来自外周血、脐带血、胎盘学或骨髓等组织来源的CD34⁺细胞。该CD34⁺细胞可从该种组织来源或全组织来源(例如，脐带血或骨髓单元)分离或者可将从该组织来源(例如，来自脐带血的白细胞)的部分纯化制品与胎盘干细胞组合。Hariri,美国申请公开号2003/0180269中描述了胎盘干细胞和脐带血或来自脐带血的干细胞的组合。
优选将该胎盘干细胞以相对于个体内免疫细胞(例如，T细胞)的已知或预期数量约10:1至约1:10的比例，优选约1:5的比例向该个体施用。然而，在非限制性实施例中，大量胎盘干细胞可以约10,000:1、约1,000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:100、约1:1,000或约1:10,000的比例向个体施用。一般来说，可施用约1×10⁵至约1×10⁸个胎盘干细胞/千克接受者，优选约1×10⁶ 至约1×10⁷个胎盘干细胞/千克接受者以实现免疫抑制。在不同的实施方式中，向个体或对象施用的大量胎盘干细胞包含至少为、大约为或不超过1×10⁵、3×10⁵、1×10⁶、3×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、1×10⁸、3×10⁸、1×10⁹、3×10⁹个胎盘干细胞，或更多。
该胎盘干细胞还可与一种或多种其它类型的干细胞，例如来自于骨髓的间充质干细胞共同施用。该种其它干细胞可与胎盘干细胞以一定比例，例如约1:10至约10:1向个体施用。
为促进胎盘干细胞和免疫细胞的体内接触，该胎盘干细胞可通过任何可使该胎盘干细胞与免疫细胞彼此接触的途径向个体施用。例如，该胎盘干细胞可通过如静脉内、肌肉内、腹腔内或直接针对器官(例如，胰腺)向个体施用。为进行体内施用，该胎盘干细胞可制成如下文5.6.1节所述的药物组合物。
免疫抑制方法可进一步包括添加一种或多种免疫抑制剂，特别是在体内。在一个实施方式中，将大量胎盘干细胞与大量免疫细胞在个体的体内接触，且向个体施用包含免疫抑制剂的组合物。免疫抑制剂是本领域公知的且包括，例如，抗T细胞受体抗体(单克隆或多克隆抗体，或其抗体片段或衍生物)、抗IL-2受体抗体(例如巴利昔单抗或达利珠单抗抗T细胞受体抗体(例如，莫罗单抗-CD3)，咪唑硫嘌呤、皮质类固醇、环孢菌素、他克莫司、霉酚酸酯、西罗莫司、神经钙调蛋白抑制剂等。在具体的实施方式中，该免疫抑制剂是巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α或MIP-1β的中和抗体。优选地，该抗(MIP)-1α或MIP-1β抗体以足以使所述个体中(MIP)-1α和/或MIP-1β量可检测地下降(例如，在移植时)的量进行施用。
5.2胎盘干细胞和胎盘干细胞群
本发明的免疫抑制方法采用了胎盘干细胞，即，从胎盘或其部分获得的干细胞，该细胞(1)与组织培养基底粘附；(2)具有分化成为非胎盘细胞类型的能力；(3)在数量充足时具有可检测地抑制免疫功能(例如，在混合淋巴反应试验中CD4⁺和/或CD8⁺干细胞的增殖)的能力。胎盘干细胞并非来自于血液(例如，胎盘血或脐带血)。本发明的方法和组合物中所用的胎盘干细胞具有抑制个体免疫系统的能力，并根据该能力进行选择。
胎盘干细胞既可以源自胎儿也可以源自母体(即，可具有母体或胎儿的基因型)。胎盘干细胞群或包含胎盘干细胞的细胞群可包含仅源自胎儿或母体胎盘干细胞，或可包含同时源自胎儿和母体的胎盘干细胞混合群。胎盘干细胞和包含胎盘干细胞的细胞群可通过下文讨论的形态、标记以及培养特征进行鉴定和选择。
5.2.1物理和形态特征
当本发明的胎盘干细胞在原代培养或细胞培养中进行培养时会吸附至组织培养基底，例如，组织培养容器表面(例如，组织培养塑料制品)。培养中的胎盘干细胞通常呈成纤维样、星形的外观，并具有从中央细胞体延伸的许多胞质突。然而，由于胎盘干细胞比纤维原细胞具有更多的该种突起，因此胎盘干细胞与在相同条件下培养的纤维原细胞在形态上可区分。形态学上，胎盘干细胞也可以与造血干细胞相区分，后者在培养中通常呈更圆的或呈鹅卵石形态。
5.2.2细胞表面，分子和遗传标记
可用于本发明的方法和组合物的胎盘干细胞和胎盘干细胞群表达大量可用于鉴别和/或分离该干细胞或包含干细胞的细胞群的标记。本发明的胎盘干细胞和干细胞群(即，两种或多种胎盘干细胞)包括直接从胎盘或其任何部分(例如，羊膜、绒毛膜、胎盘绒毛叶等)获得的干细胞和含干细胞细胞群。胎盘干细胞群还包括培养中的胎盘干细胞群(即，两种或多种)，或容器(例如，袋子)中的细胞群。然而，胎盘干细胞不是滋养层。
胎盘干细胞通常表达标记CD73、CD105、CD200、HLA-G和/或OCT-4，且不表达CD34、CD38或CD45。胎盘干细胞还可表达HLA-ABC(MHC-1)和HLA-DR。这些标记可用于鉴定胎盘干细胞并从其它干细胞类型中区分胎盘干细胞。由于胎盘干细胞可以表达CD73和CD105，因此它们具有类间充质干细胞的特征。然而，由于胎盘干细胞可以表达CD200和HLA-G(胎儿特异性标记)，因此它们可从既不表达CD200也不表达HLA-G的间充质干细胞(例如，骨髓衍生间充质干细胞)中区分出来。同理，可通过CD34、CD38和/或CD45表达的缺失将胎盘干细胞鉴定为非造血干细胞。
在一个实施方式中，本发明提供了包含大量CD200⁺、HLA-G⁺的免疫抑制性胎盘干细胞的分离细胞群，其中所述大量细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中可检测地抑制T细胞增殖。在分离群的具体实施方式中，所述干细胞同样为CD73⁺和CD105⁺。在另一个具体实施方式中，所述干细胞同样为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在更为具体的实施方式中，所述干细胞也为CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺和CD105⁺。在另一实施方式中，所述分离群在适于拟胚体形成的条件下培养时生成一或多个拟胚体。
在另一实施方式中，本发明提供了包含大量CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺的免疫抑制性胎盘干细胞的分离细胞群，其中所述大量细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中可检测地抑制T细胞增殖。在所述群的具体实施方式中，所述的干细胞为HLA-G⁺。在另一个具体实施方式中，所述干细胞为CD34^-、 CD38^-或CD45^-。在另一个具体实施方式中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在更具体的实施方式中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-和HLA-G⁺。在另一具体实施方式中，所述细胞群在适于拟胚体形成的条件下培养时生成一或多个拟胚体。
本发明还提供了包含大量CD200⁺、OCT-4⁺的免疫抑制性胎盘干细胞的分离细胞群，其中所述大量细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中可检测地抑制T细胞增殖。在具体实施方式中，所述干细胞为CD73⁺和CD105⁺。在另一个具体实施方式中，所述的干细胞为HLA-G⁺。在另一个具体实施方式中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在更具体的实施方式中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一具体实施方式中，该群在适于拟胚体形成的条件下培养时生成一或多个拟胚体。
本发明还提供了包含大量CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺的免疫抑制性胎盘干细胞的分离细胞群，其中所述大量细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中可检测地抑制T细胞增殖。在上述大量细胞的具体实施方式中，所述干细胞同样为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一个具体实施方式中，所述干细胞同样为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一特定实施方式中，所述的干细胞同样为OCT-4⁺。在另一具体实施方式中，所述干细胞同样为CD200⁺。在更具体的实施方式中，所述干细胞同样为CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺和CD200⁺。
本发明还提供了包含大量免疫抑制性胎盘干细胞的分离细胞群，该干细胞为CD73⁺、CD105⁺干细胞，其中所述的大量细胞在适于拟胚体形成的条件下培养时形成一或多个拟胚体，其中所述大量细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中可检测地抑制T细胞增殖。在具体实施方式中，所述干细胞同样为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一个具体实施方式中，所述干细胞同样为CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一个具体实施方式中，所述干细胞为OCT-4⁺。在更具体的实施方式中，所述干细胞同样为OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-。
本发明还提供了包含大量免疫抑制性胎盘干细胞的分离细胞群，该干细胞为OCT-4⁺干细胞，其中所述的大量细胞在适于拟胚体形成的条件下培养时形成一或多个拟胚体，其中所述大量细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中可检测地抑制T细胞增殖。在不同实施方式中，所述分离胎盘细胞至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％为OCT-4⁺干细胞。在上述群的具体实施方式中，所述干细胞为CD73⁺和CD105⁺。在另一个具体实施方式中，所述干细胞为CD34^-、CD38^-或CD45^-。在另一个具体实施方式中，所述的干细胞为CD200⁺。在更具体实施方式中，所述干细胞为CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-。在另一个具体实施方式中，所述群已被扩增，例如，传代至少1 次、至少3次、至少5次、至少10次、至少15次或至少20次。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含大量CD29⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-和CD133^-的免疫抑制性胎盘干细胞的分离细胞群。
在上述胎盘干细胞的具体实施方式中，该胎盘干细胞构成性分泌IL-6、IL-8和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)。
上述各大量胎盘干细胞可包含从哺乳动物胎盘直接获取或分离的胎盘干细胞，或是经培养并已至少传代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30或更多次的胎盘干细胞，或其组合。
上述大量的免疫抑制性胎盘干细胞可包含约、至少为、或不超过1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多的胎盘干细胞。
5.2.3选择和制备胎盘干细胞群
在另一个实施方式中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量免疫抑制性胎盘干细胞的方法，其包括选择胎盘细胞群，其中所述细胞的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％为CD200⁺、HLA-G⁺胎盘干细胞，且其中所述的胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中可检测地抑制T细胞增殖。在具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD73⁺和CD105⁺的干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD34^-、CD38^-或CD45^-的干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺或CD105⁺的胎盘干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择还包括选择能在适于拟胚体形成的条件下培养时生成一或多个拟胚体的大量胎盘干细胞。
在另一个实施方式中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量免疫抑制性胎盘干细胞的方法，其包括选择大量胎盘细胞，其中所述细胞的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％为CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘干细胞，且其中所述的胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中可检测地抑制T细胞增殖。在具体实施方式中，所述选择包括选择同样为HLA-G⁺的干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD34^-、CD38^-或CD45^-的胎盘干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD34^-、CD38^-、CD45^-和HLA-G⁺的胎盘干细胞。在另一具体实施方式中，所 述选择进一步包括选择能在适于拟胚体形成的条件下培养时生成一或多个拟胚体的胎盘细胞群。
在另一个实施方式中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量免疫抑制性胎盘干细胞的方法，其包括选择大量胎盘细胞，其中所述细胞的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％为CD200⁺、OCT-4⁺胎盘干细胞，且其中所述的胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中可检测地抑制T细胞增殖。在具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD73⁺和CD105⁺的胎盘干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择包括选择同样为HLA-G⁺的胎盘干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺的胎盘干细胞。
在另一个实施方式中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量免疫抑制性胎盘干细胞的方法，其包括选择大量胎盘细胞，其中所述细胞的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％为CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺胎盘干细胞，且其中所述的胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中可检测地抑制T细胞增殖。在具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD34^-、CD38^-或CD45^-的胎盘干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD200⁺的胎盘干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺和CD200⁺的胎盘干细胞。
在另一个实施方式中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量免疫抑制性胎盘干细胞的方法，其包括选择大量胎盘细胞，其中所述细胞的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％为CD73⁺、CD105⁺胎盘干细胞，且其中所述的大量细胞在适于拟胚体形成的条件下形成一或多个拟胚体。在具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD34^-、CD38^-或CD45^-的胎盘干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择包括选择同样为OCT-4⁺的胎盘干细胞。在更具体实施方式中，所述选择包括选择同样为OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘干细胞。
在另一实施方式中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量免疫抑制性胎盘干细胞的方法，其包括选择大量胎盘细胞，其中所述分离的胎盘细胞的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、 至少70％、至少80％、至少90％或至少95％为OCT4⁺干细胞，且其中所述的大量细胞在适于拟胚体形成的条件下形成一或多个拟胚体。在具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD73⁺和CD105⁺的胎盘干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD34^-、CD38^-或CD45^-的胎盘干细胞。在另一具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD200⁺的胎盘干细胞。在更具体实施方式中，所述选择包括选择同样为CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘干细胞。
本发明还提供了制备免疫抑制性胎盘干细胞群或大量免疫抑制性胎盘干细胞的方法。例如，本发明提供了制备细胞群的方法，其包括选择上述任意的大量胎盘干细胞，并从其它细胞(例如，其它胎盘细胞)中分离出该大量胎盘干细胞。在具体实施方式中，本发明提供了制备细胞群的方法，其包括选择胎盘细胞，其中所述胎盘细胞：(a)与基底粘附；(b)表达CD200和HLA-G，或表达CD73、CD105和CD200，或表达CD200和OCT-4，或表达CD73、CD105和HLA-G，或表达CD73和CD105，并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含该干细胞的胎盘细胞群中一或多个拟胚体的形成，或表达OCT-4，并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含该干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成；并且(c)在MLR(混合淋巴细胞反应)中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和从其它细胞中分离所述胎盘细胞以形成细胞群。
在更具体的实施方式中，本发明提供了制备细胞群的方法，其包括选择胎盘干细胞，该细胞(a)与基底粘附，(b)表达CD200和HLA-G，以及(c)在MLR(混合淋巴细胞反应)中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。在另一个具体实施方式中，本发明提供了制备细胞群的方法，其包括选择胎盘干细胞，该细胞(a)与基底粘附，(b)表达CD73、CD105和CD200，以及(c)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。在另一具体实施方式中，本发明提供了制备细胞群的方法，其包括选择胎盘干细胞，该细胞(a)与基底粘附，(b)表达CD200和OCT-4，以及(c)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。在另一具体的实施方式中，本发明提供了制备细胞群的方法，其包括选择胎盘干细胞，该干细胞(a)与基底粘附，(b)表达CD73和CD105，(c)在适于拟胚体形成的条件下培养时形成拟胚体，以及(d)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。在另一个具体实施方式中，本发明提供了制备细胞群的方法，其包括选择胎盘干细胞，该细胞(a)与基底粘附，(b)表达CD73、CD105和HLA-G， 以及(c)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。制备细胞群的方法，其包括选择胎盘干细胞，该细胞(a)与基底粘附，(b)表达OCT-4，(c)在适于拟胚体形成的条件下培养时形成拟胚体，以及(d)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。
在免疫抑制性胎盘干细胞群的制备方法的具体实施方式中，所述的T细胞和所述的胎盘细胞以约5:1的比例存在于所述的MLR中。本发明中所用的胎盘细胞可来自于全胎盘，或主要来自于羊膜、或羊膜和绒毛膜。在另一具体实施方式中，与所述胎盘细胞缺失时所述MLR中的T细胞增殖量相比，所述的胎盘细胞在所述MLR中可抑制至少50％、至少75％、至少90％或至少95％的CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖。该方法可进一步包括选择和/或制备能够免疫调节(例如，抑制其活性)其它免疫细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞的活性)的胎盘干细胞群。
5.2.4在培养中生长
此处所述的胎盘干细胞的生长，对于任何哺乳动物细胞而言，部分取决于所选的特定生长培养基。在最佳条件下，胎盘干细胞的数量通常在3-5日内加倍。在培养过程中，本发明的胎盘干细胞粘附在培养基底上，例如，组织培养容器表面(例如，塑料组织培养皿、涂覆纤维连接蛋白的塑料制品等)，并形成单层。
当在适当条件下培养时，包含本发明胎盘干细胞的分离胎盘细胞群形成拟胚体，即，在贴壁干细胞层顶部生长三维细胞簇。在拟胚体内的细胞表达与极早期干细胞相关的标记(例如，OCT-4、Nanog、SSEA3和SSEA4)。与此处所述的胎盘干细胞类似，在拟胚体内的细胞通常不粘附培养基底，但在培养中保持附着在贴壁细胞上。由于在贴壁干细胞缺失时不形成拟胚体，拟胚体细胞的存活取决于贴壁胎盘干细胞。因此贴壁胎盘干细胞在包含贴壁胎盘干细胞的胎盘细胞群中促进一或多个拟胚体的生长。不希望受理论的束缚，认为拟胚体的细胞在贴壁胎盘干细胞上生长如同胚胎干细胞在饲养细胞层上生长。间充质干细胞(例如，骨髓衍生间充质干细胞)在培养中不形成拟胚体。
5.2.5分化
可用于本发明方法的胎盘干细胞可分化成为不同的定向细胞系。例如，该胎盘干细胞可分化成为成脂肪性、成软骨性、神经原性或成骨性细胞系。该种分化可通过本领域已知的任何分化方法实现，例如，骨髓衍生间充质干细胞分化成为类似的细胞系的方法。
5.3获取胎盘干细胞的方法
5.3.1干细胞采集组合物
本发明进一步提供了收集和分离胎盘干细胞的方法。一般而言，可通过使用生理可接受的溶液，例如干细胞采集组合物从哺乳动物胎盘获取干细胞。干细胞采集组合物的详细描述可参见2005年12月29日提交的题为“收集和保存胚胎干细胞的改良组合物和该组合物的使用方法(Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition)”的美国临时申请号60/754,969。
干细胞采集组合物包括适于采集和/或培养干细胞的任何生理可接受的溶液，例如，盐溶液(例如，磷酸缓冲盐溶液、Kreb’s溶液、改良的Kreb’s溶液、Eagle’s溶液、0.9％NaCl等)，培养基(例如，DMEM、H.DMEM等)等。
干细胞采集组合物可包含一种或多种倾向于保存胎盘干细胞的组分，即，从采集时到培养时防止胎盘干细胞死亡、或延缓胎盘干细胞的死亡、减少细胞群中死亡胎盘干细胞的数量等的组分。这样的组分可以是，例如凋亡抑制剂(例如，caspase抑制剂或JNK抑制剂)；血管舒张剂(例如，硫酸镁、抗高血压药物、心房钠尿肽(ANP)、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、消炎痛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等)；坏死抑制剂(例如，2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊氨基-马来酰亚胺、二硫代氨基甲酸吡咯烷或氯硝西泮)；TNF-α抑制剂；和/或携氧全氟化碳(例如，全氟辛基溴、全氟癸基溴等)。
干细胞采集组合物可包含一种或多种组织降解酶，例如，金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、核糖核酸酶或脱氧核糖核酸酶等。这些酶包括，但不限于，胶原酶(例如，胶原酶I、II、III或IV、来自溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)的胶原酶等)；分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、释放酶、透明质酸酶等。
干细胞采集组合物可包括杀菌或抑菌有效量的抗生素。在某些非限定实施方式中，该抗生素为大环内酯物(例如，托普霉素)、头孢菌素(例如，头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉霉素、红霉素、青霉素(例如，青霉素V)或喹诺酮(例如，氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素等。在特定实施方式中，该抗生素对革兰氏(+)和/或革兰氏(-)细菌具有活性，例如，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。
干细胞采集组合物还可包括一种或多种下列化合物：腺苷(约1mM至约50mM)；D-葡萄糖(约20mM至约100mM)；镁离子(约1mM至约50mM)； 分子量大于20,000道尔顿的大分子，在一个实施方式中，其以足以维持内皮完整性和细胞存活力的数量存在(例如，以约25g/1至约100g/1，或约40g/1至约60g/1的量存在的合成或天然存在的胶体、多糖如葡聚糖或聚乙二醇)；抗氧化剂(例如，以约25μM至约100μM的量存在的丁基羟基茴香醚、丁羟甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E)；还原剂(例如以约0.1mM至约5mM的量存在的N-乙酰半胱氨酸)；防止钙进入细胞的试剂(例如，以约2μM至约25μM的量存在的维拉帕米)；硝酸甘油(例如，约0.05g/L至约0.20g/L)；抗凝血剂，在一个实施方式中，其以足以帮助防止残留血凝块的量存在(例如，以约1000单位/l至约100,000单位/l的浓度存在的肝磷脂或水蛭素)；或含有阿米洛利的化合物(例如，以约1.0μM至约5μM的量存在的阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、六亚甲基阿米洛利、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利)。
5.3.2胎盘的采集和处理
一般而言，人胎盘在分娩后立即回收。在优选实施方式中，该胎盘在患者知情同意并在获得该患者与胎盘相关的完整病史后从该患者回收。优选地，该病史在分娩后仍然继续。该病史可用于调整该胎盘或从其中收获的干细胞的后续使用。例如，根据该病史，人胎盘干细胞可用作对与该胎盘相关的婴儿、或婴儿的父母、兄弟姐妹或其它亲属的个体化药物。
在胎盘干细胞回收之前先去除脐带血和胎盘血。在某些实施方式中，胎盘中的脐带血在分娩后被回收。可对该胎盘进行常规的脐带血回收处理。通常采用针或套管在重力的帮助下从胎盘抽血(例如，参见，Anderson,美国专利号5,372,581；Hessel等人,美国专利号5,415,665)。该针或套管通常插入脐带静脉且可以轻柔按摩胎盘以帮助胎盘排出脐带血。该脐带血回收还可通过商业手段实现，例如LifeBank公司,Cedar Knolls,N.J.,ViaCord,Cord Blood Registry and Cryocell。优选地，该胎盘通过重力排放且不采取其它操作，从而将脐带血回收过程中的组织破坏最小化。
通常将胎盘从产房运送至另一地点(例如，实验室)以通过灌注或组织分离等方法回收脐带血并采集干细胞。优选在无菌、热绝缘的运输装置(将胎盘温度维持在20-28℃)中运送胎盘，例如，将夹住近端脐带的胎盘放置在无菌拉锁塑料袋中，然后将该袋子放入绝缘容器。在另一实施方式中，在基本如2005年9月19日提交的未决美国专利申请号11/230,760中所描述的脐带血采集试剂盒中运输胎盘。优选地，该胎盘在分娩后4至24小时内送至实验室。在某些实施方式中，脐带血回收前在插入胎盘的优选4-5cm(厘米)以内处夹住近端脐带。在另一实施方式中，该近端脐带在脐带血回收后但在进一步处理胎盘前被夹住。
在干细胞采集前，该胎盘可在无菌条件下且在室温或在5至25℃(摄氏度)下保存。在灌注胎盘以去除残留脐带血之前可将胎盘保存超过48小时，优选保存4至24小时。胎盘优选在抗凝血剂溶液中于5至25℃(摄氏度)下保存。适用的抗凝血剂溶液已为本领域熟知。例如，可采用肝素或华法林钠溶液。在优选实施方式中，该抗凝血剂溶液包含肝素溶液(例如，在1:1000溶液中含1％w/w)。该无血胎盘在胎盘干细胞采集前优选保存不超过36小时。
一旦大体参照上文方法采集和制备后，可通过本领域已知的任何方法对该哺乳动物胎盘或其部分进行处理(例如，灌注或破碎，例如，以一种或多种组织破碎酶进行消化)以获取干细胞。
5.3.3胎盘组织的物理破碎和酶消化
在一个实施方式中，可通过物理破坏(例如，酶消化)所述器官从哺乳动物胎盘采集干细胞。例如，该胎盘或其部分可在接触本发明的干细胞采集组合物的同时进行碾碎、剪切、绞碎、切块、剁碎、浸渍等，随后以一种或多种酶消化组织。该胎盘或其部分还可物理破碎并以一种或多种酶消化，然后将所得材料浸入或混合于本发明的干细胞采集组合物。任何物理破碎的方法均适用，只要通过例如台盼蓝拒染法能确定所述器官中大量、更优选大部分、更优选至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞存活。
可在物理破碎和/或酶消化以及干细胞回收前将胎盘切成部分。例如，可从羊膜、绒毛膜、胎盘绒毛叶或其任意组合中获取胎盘干细胞。优选地，可从包含羊膜和绒毛膜的胎盘组织中获取胎盘干细胞。胎盘干细胞通常可通过破坏小块胎盘组织获取，例如，体积为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000立方毫米的胎盘组织块。
优选的干细胞采集组合物包含一种或多种组织破碎酶。优选采用酶组合(例如，基质金属蛋白酶和中性蛋白酶的组合，例如，胶原酶和分散酶的组合)进行酶消化。在一个实施方式中，胎盘组织的酶消化使用基质金属蛋白酶、中性蛋白酶以及用于消化透明质酸的粘多糖酶的组合，例如胶原酶、分散酶和透明质酸酶的组合或是释放酶(Boehringer Mannheim公司,Indianapolis,Ind.)和透明质酸酶的组合。其它可用于破碎组织的酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可被血清中的α2微球蛋白抑制，因此用于消化的基质通常为无血清的。在酶消化过程中常用EDTA和脱氧核糖核酸酶以提高细胞回收的效率。优选对消化物进行稀释以避免在粘性消化中截留干细胞。
可使用组织消化酶的任何组合。组织消化酶的常见浓度包括，例如，胶 原酶I和胶原酶IV为50-200U/mL，分散酶为1-10U/mL，弹性蛋白酶为10-100U/mL。蛋白酶可组合使用，即，在同一消化反应中采用两种或多种蛋白酶，或可以依次使用以释放胎盘干细胞。例如，在一个实施方式中，先以适量的约2mg/ml的胶原酶I在37℃下消化胎盘或其部分30分钟，随后使用0.25％的胰蛋白酶在37℃下消化10分钟。优选在使用其它酶后紧接着使用丝氨酸蛋白酶。
在另一个实施方式中，可通过向包含该干细胞的干细胞采集组合物、或在使用干细胞采集组合物分离干细胞前向该组织被破碎和/或消化的溶液中添加螯合剂，例如乙二醇双(2-氨基乙醚)-N,N,N’,N’-四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)，以进一步破碎该组织。
可以理解当完整胎盘或胎盘的一部分同时包含了胎儿和母体细胞时(例如，当该胎盘部分包含了绒毛膜或绒毛叶时)，所采集的胎盘干细胞将包含来自胎儿和母体来源的胎盘干细胞的混合物。当该胎盘部分不包含母体细胞(例如，羊膜)或其数量可忽略时，所采集胎盘干细胞几乎仅包含胎儿胎盘干细胞。
5.3.4胎盘灌注
胎盘干细胞还可通过哺乳动物胎盘灌注获取。灌注哺乳动物胎盘以获得干细胞的方法披露于，例如，Hariri，美国申请公开号2002/0123141，以及2005年12月29日提交的名为“收集和保存胚胎干细胞的改良组合物和该组合物的使用方法(Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition)”的美国临时申请号60/754,969。
胎盘干细胞可通过使用例如干细胞采集组合物作为灌注溶液灌注例如胎盘脉管系统采集。在一个实施方式中，可通过将灌注溶液通过脐动脉和脐静脉之一或同时通过两者以灌注哺乳动物胎盘。该灌注溶液可通过重力流等方式流经胎盘。优选地，该灌注溶液通过泵(例如，蠕动泵)强制通过胎盘。可用与无菌连接装置(如无菌管)连接的套管(例如，或塑料套管)插入脐静脉。该无菌连接装置与灌注集流腔相连。
在准备灌注时，胎盘优选通过一定方式定向(例如，悬浮)使得脐动脉和脐静脉定位于胎盘的最高点。通过将灌注液(例如，本发明的干细胞采集组合物)流经胎盘脉管系统或通过胎盘脉管系统和周边组织对胎盘进行灌注。在一个实施方式中，该脐动脉和脐静脉被同时连接至经柔性连接器与灌注溶液储器相连的吸管。该灌注溶液流进脐静脉和动脉。该灌注溶液从血管壁流出和/或经过血管壁进入胎盘的周边组织，并从怀孕时与母体子宫相连的胎盘表面采集到适当的开口容器中。还可将该灌注溶液引导通过脐带开口并从与母体子宫壁结合的胎盘壁的开口流出或滤出。在另一个实施方式中，该灌注溶液通 过脐静脉并从脐动脉采集，或通过脐动脉并从脐静脉采集。
在一个实施方式中，可在灌注过程中夹住近端脐带，更优选在脐带插入胎盘4-5cm(厘米)之内夹住近端脐带。
在放血过程中从哺乳动物胎盘首次采集的灌注液通常由于脐带血和/或胎盘血中的残留红细胞而带有颜色。该灌注液将随灌注的进行以及残留脐带血被洗出胎盘而变浅。通常30至100ml(毫升)的灌注液足以使胎盘初步除血，但可根据观察结果采用更多或更少的灌注液。
用于采集胎盘干细胞的灌注液的体积可根据待采集的干细胞的数量、胎盘的大小、从单个胎盘采集的次数等因素而变化。在不同的实施方式中，灌注液的体积可以是从50mL至5000mL、50mL至4000mL、50mL至3000mL、100mL至2000mL、250mL至2000mL、500mL至2000mL或750mL至2000mL。通常在放血后以700-800mL的灌注液进行灌注。
可在数小时或数天的过程中多次灌注胎盘。当需要多次灌注胎盘时，可将胎盘在容器中或其它适当器皿中于无菌条件下保存或培养，并以含有或不含抗凝血剂(例如，肝素、华法林钠、香豆素、双羟香豆素)以及/或含有或不含抗菌剂(例如，β-巯基乙醇(0.1mM)；抗生素如链霉素(例如，40-100μg/ml)、青霉素(例如，40U/ml)、两性霉素B(例如，0.5μg/ml))的干细胞采集组合物或标准灌注溶液(例如，常规盐溶液，如磷酸缓冲盐)进行灌注。在一个实施方式中，分离胎盘在不采集灌注液的情况下保存或培养一段时间，例如在灌注和灌注液采集前保存或培养胎盘1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或2或3或更多天。该灌注胎盘可另外保存一定时间，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多小时，并再次以如700-800mL的灌注液进行灌注。胎盘可被灌注1、2、3、4、5次或更多次，例如每1、2、3、4、5或6小时灌注一次。在优选实施方式中，可重复胎盘的灌注和灌注溶液(例如，干细胞采集组合物)的采集直至回收的有核细胞的数量降至100个细胞/ml以下。在不同时间点的灌注液可进一步单独处理以回收时间依赖性细胞群，例如干细胞。还可集中不同时间点的灌注液。
不期望受限于任何理论，对胎盘放血并灌注胎盘充足时间后，认为胎盘干细胞转移进入无血的和经灌注的胎盘微循环中，其中如本发明所述，优选通过灌注洗入采集容器对它们进行采集。灌注分离的胎盘不仅有助于去除残留脐带血还能向胎盘提供适当的营养，包括氧。使用与用于去除残留脐带血细胞的溶液类似的溶液(优选不添加抗凝血剂)培养和灌注胎盘。
根据本发明的方法进行的灌注所得的采集物中的胎盘干细胞显著多于未经所述溶液灌注且未经其它获取干细胞的处理(例如，通过组织破碎，例如， 酶消化)从哺乳动物胎盘获得的胎盘干细胞数量。上下文中的“显著更多”指至少多10％。根据本发明的方法进行的灌注获得的胎盘干细胞比例如从培养胎盘或其部分的培养基中获得的胎盘干细胞数量显著更多。
可通过包含一种或多种蛋白酶或其它组织破碎酶的溶液进行灌注从胎盘分离干细胞。在特定实施方式中，可将胎盘或其部分(例如，羊膜、羊膜和绒毛膜、胎盘小叶或子叶或前述的任意组合)的温度调节为25-37℃，然后与一种或多种组织破碎酶在200mL的培养基中培养30分钟。从灌注液采集细胞，将温度调节为4℃,并以包含了5mM EDTA、2mM二硫苏糖醇和2mMβ-巯基乙醇的冷抑制剂混合物进行洗涤。数分钟后以本发明的冷(例如，4℃)干细胞采集组合物洗涤该干细胞。
可以理解通过本淘洗方法(pan method)进行的灌注，即采集从胎盘的母体一侧流出的灌注液，获得胎儿和母体细胞的混合物。因此，通过本方法采集的细胞同时包含了胎儿和母体来源的胎盘干细胞群的混合物。相反地，仅通过胎盘脉管系统进行的灌注(其中灌注液通过一种或两种胎盘脉管并仅通过剩余脉管进行采集)可得到几乎仅为胎儿来源的胎盘干细胞群采集物。
5.3.5胎盘干细胞的分离、分选和表征
不管通过灌注还是酶消化从哺乳动物胎盘获得的干细胞均可首先通过Ficoll梯度离心从其它细胞中纯化(即，分离)。该种离心可参照离心速度的任意标准方案。例如，在一个实施方式中，可通过在室温下5000×g离心15分钟从灌注液中回收从胎盘采集的细胞，该离心可从例如污染的碎片或血小板中分离细胞。在另一实施方式中，胎盘灌注液被浓缩至约200ml，在Ficoll上轻柔分层，并在22℃下以约1100×g离心20分钟，采集低密度细胞中间层作进一步处理。
将细胞沉淀重悬浮于新鲜干细胞采集组合物或适于干细胞保存的基质中，例如含2U/ml肝素和2mM EDTA的IMDM无血清培养基(GibcoBRL,NY)。可使用如Lymphoprep(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)并参照生产商推荐操作分离总单核细胞片段。
此处所用的“分离的”胎盘干细胞指去除至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的在完整哺乳动物胎盘中通常与该干细胞相关的细胞。当干细胞所在的细胞群包含的在完整器官中通常与该干细胞相关的细胞少于50％时，该器官的干细胞是“被分离的”。
通过灌注或消化获得的胎盘细胞可进一步或首先采用如含有0.2％EDTA的0.05％胰蛋白酶溶液(Sigma,St.Louis MO)通过差异胰蛋白酶消化进行分离。由于胎盘干细胞通常在大约5分钟内从塑料表面脱离，而其它贴壁群通常需 要超过20-30分钟的培养，因此差异胰蛋白酶消化成为可能。可在胰蛋白酶消化和使用如胰蛋白酶中和溶液(TNS,Cambrex)进行胰蛋白酶中和后收集脱离的胎盘干细胞。在一个分离贴壁细胞的实施方式中，将等份的(例如，约5-10×10⁶)细胞分别放入多个T-75瓶中的一个，优选放入涂覆纤维连接蛋白的T75瓶。在该实施方式中，该细胞可用商业可获取的间充质干细胞生长培养基(MSCGM)(Cambrex)在组织培养箱中(37℃,5％CO₂)进行培养。10至15天后，用PBS从瓶中洗去未贴壁细胞。然后以MSCGM替换PBS。优选每天检查瓶中各种贴壁细胞类型的存在，特别是进行成纤维细胞簇的鉴定和扩增。
从哺乳动物胎盘采集的细胞的数量和类型可通过如下方式监测，例如，可通过采用标准细胞检测技术如流式细胞计数、细胞分选、免疫细胞化学(例如，通过组织特异性或细胞标记特异性抗体染色)、荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)等检测形态和细胞表面标记的变化，通过采用光学或共焦显微镜检测细胞形态，以及/或通过本领域公知的技术如PCR和基因表达谱检测基因表达的变化。这些技术还可用于鉴定对一种或多种特定标记呈阳性的细胞。例如，人们可使用CD34的抗体通过上述技术测定细胞是否包含可测量的CD34；如包含，则该细胞为CD34⁺。同样地，如果细胞产生足以通过RT-PCR检测的OCT-4RNA，或产生显著多于成熟细胞的OCT-4RNA，该细胞为OCT-4⁺。针对细胞表面标记(例如，CD标记如CD34)的抗体以及干细胞特异性基因如OCT-4的序列已为本领域熟知。
可采用荧光激活细胞分选(FACS)对胎盘细胞特别是通过Ficoll分离、差异粘附或两者的组合分离的细胞进行分选。荧光激活细胞分选(FACS)是基于颗粒的荧光属性分离颗粒(包括细胞)的公知方法(Kamarch,1987,Methods Enzymol,151:150-165)。通过对单独颗粒中的荧光部分进行激光激发可产生微量电荷，使得混合物中的正负颗粒实现电磁分离。在一个实施方式中，可通过独特的荧光标记对细胞表面标记特异性抗体或配体进行标记。通过细胞分选器处理细胞，基于细胞结合所用抗体的能力进行细胞分离。可将FACS分选的颗粒直接放入96孔或384孔板的各孔中以促进分离和克隆。
在一个分选方案中，根据标记CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4和/或HLA-G的表达对来自胎盘的干细胞进行分选。通过与基于在培养中的贴壁性质选择干细胞的步骤相结合可以实现这一点。例如，可在基于标记表达的分选之前或之后完成贴壁选择干细胞。例如，在一个实施方式中，首先可根据细胞的CD34表达进行细胞分选；保留CD34^-细胞，并将CD200⁺HLA-G⁺细胞与所有其它CD34^-细胞分离。在另一个实施方式中，可根据标记CD200和/或HLA-G的表达对来自胎盘的细胞进行分选；例如，可将展示任一标记的细胞分离以供进一步使用。在一个具体实施方式中，表达如 CD200和/或HLA-G的细胞可根据它们对CD73和/或CD105的表达、或抗体SH2、SH3或SH4识别的表位、或是CD34、CD38或CD45表达的缺失进一步分选。例如，在一个实施方式中，可根据CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38和CD45的表达或其缺失对胎盘细胞进行分选，并从其它胎盘细胞中分离出CD200⁺、HLA-G⁺、CD73⁺、CD105⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘细胞以供进一步使用。
在另一实施方式中，可采用磁珠分离细胞。可采用磁激活细胞分选(MACS)技术对细胞进行分选，MACS是基于颗粒结合磁珠(直径0.5-100μm)的能力分离颗粒的方法。可对磁性微球进行多种有用的修饰，包括共价添加特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后将珠子与细胞混合以进行结合。然后将细胞通过磁场以分离具有特定细胞表面标记的细胞。在一个实施方式中，可将细胞进行此种分离并与结合了针对其它细胞表面标记的抗体的磁珠进行再混合。将该细胞再次通过磁场，分离同时结合两种抗体的细胞。然后将该种细胞稀释入各培养皿，例如微量滴定皿以进行克隆分离。
还可根据细胞形态和生长特征对胎盘干细胞进行表征和/或分选。例如，胎盘干细胞可被表征为例如在培养中具有成纤维状外观，和/或根据例如在培养中的成纤维状外观对胎盘干细胞进行选择。胎盘干细胞还可被表征为具有形成拟胚体的能力，和/或根据该能力对胎盘干细胞进行选择。在一个实施方式中，例如，从其它胎盘细胞中分离出在培养中呈成纤维状、表达CD73和CD105、并生成一或多个拟胚体的胎盘细胞。在另一实施方式中，从其它胎盘细胞中分离出在培养中生成一或多个拟胚体的OCT-4⁺胎盘细胞。
在另一实施方式中，可通过集落形成单位试验鉴定和表征胎盘干细胞。集落形成单位试验已为本领域公知，例如Mesen Cult培养基(Stem Cell Technologies公司,Vancouver British Columbia)。
可通过本领域已知的标准技术对胎盘干细胞的活力、增殖潜力以及寿命进行评定，例如台盼蓝拒染试验、荧光双乙酸吸收试验、碘化丙啶吸收试验(评定活力)；以及胸苷吸收试验、MTT细胞增殖试验(评定增殖)。可通过本领域公知的方法测定寿命，例如测定扩大培养中倍增的最大群数。
还可通过本领域已知的其它技术从其它胎盘细胞中分离出胎盘干细胞，例如，所需细胞的选择性生长(正向选择)，有害细胞的选择性破坏(负向选择)；在混合群中使用例如大豆凝集素基于差异性细胞凝集力进行分离；冻融法；过滤；常规和区带离心；离心淘洗(反流离心)；单位重力分离；逆流分配；电泳等。
5.4胎盘干细胞的培养
5.4.1培养基
可使用分离的胎盘干细胞、或胎盘干细胞群、或者生长胎盘干细胞的细胞或胎盘组织来起始或接种细胞培养。通常可将细胞转移进未涂覆或涂覆了胞外基质或配体如层粘蛋白、胶原(例如，天然或变性胶原)、明胶、纤维连接蛋白、鸟氨酸、玻连蛋白和胞外膜蛋白(例如，MATRIGEL(BD Discovery Labware,Bedford,Mass.))的无菌组织培养容器。
可在本领域认可接受的培养干细胞的任意培养基中和任意条件下培养胎盘干细胞。优选地，该培养基包含血清。例如，胎盘干细胞可培养于含ITS(胰岛素-铁传递蛋白-硒)、LA+BSA(亚油酸-牛血清白蛋白)、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1以及青霉素/链霉素的DMEM-LG(Dulbecco’s改良必需培养基，低糖)/MCDB201(鸡纤维原细胞基础培养基)；含10％胎牛血清(FBS)的DMEM-HG(高糖)；含15％FBS的DMEM-HG；含10％FBS、10％马血清以及氢化可的松的IMDM(Iscove’s改良Dulbecco’s培养基)；含10％FBS、EGF以及肝素的M199；含10％FBS、GlutaMAX^TM和庆大霉素的α-MEM(最小必需培养基)；含10％FBS、GlutaMAX^TM和庆大霉素的DMEM等中。优选的培养基为含有2％FBS、ITS、LA+BSA、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF和青霉素/链霉素的DMEM-LG/MCDB-201。
其它可用于培养胎盘干细胞的培养基包括DMEM(高糖或低糖)、Eagle’s基础培养基、Ham’s F10培养基(F10)、Ham’s F-12培养基(F12)、Iscove’s改良Dulbecco’s培养基、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、Liebovitz’s L-15培养基、MCDB、DMIEM/F12、RPMI1640、高级DMEM(Gibco)、DMEM/MCDB201(Sigma)以及CELL-GRO FREE。
培养基中可补充一种或多种成分，其包括，例如，血清(例如，胎牛血清(FBS)，优选约2-15％(v/v)；马血清(ES)；人血清(HS))；β-巯基乙醇(BME)，优选为约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如，血小板衍化生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，碱性纤维原细胞生长因子(bFGF)，类胰岛素生长因子-1(IGF-1)，白血病抑制因子(LIF)，血管内皮生长因子(VEGF)，以及促红细胞生成素(EPO)；氨基酸，包括L-缬氨酸；以及一种或多种抗生素和/或抗霉菌剂以控制微生物污染，例如，青霉素Ｇ、硫酸链霉素、两性霉素Ｂ、庆大霉素以及制霉菌素的一种或组合。
5.4.2胎盘干细胞的扩增和增殖
一旦胎盘干细胞或干细胞群被分离(例如，从通常与干细胞或干细胞群在体内关联的至少50％的胎盘细胞中分离出干细胞或干细胞群)，该干细胞或干细胞群可在体外增殖或扩增。例如，可在组织培养容器(例如，皿、瓶、多孔 板等)中培养胎盘干细胞群充足的时间以使干细胞增殖至70-90％汇合，即，直至干细胞及其子代占据了组织培养容器的培养表面区域的70-90％。
可以以允许细胞生长的密度将胎盘干细胞接种至培养容器。例如，该细胞可以低密度(例如，约1,000至约5,000细胞/cm²)至高密度(例如，约50,000或更多细胞/cm²)进行接种。在优选实施方式中，该细胞可在含约0至约5(体积)％的CO₂的空气中进行培养。在一些优选实施方式中，细胞可在含约2％至约25％的O₂的空气、优选含约5％至约20％的O₂的空气中进行培养。优选在约25℃至约40℃(优选37℃)下培养细胞。优选在培养箱中培养细胞。培养基可呈静态或通过生物反应器等进行摇动。胎盘干细胞优选在低氧化应激下生长(例如，添加谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、生育酚、N-乙酰半胱氨酸等)。
一旦获得70％-90％的汇合，可对该细胞进行传代。例如，可采用本领域公知技术对细胞进行酶处理(例如，胰蛋白酶消化)以将其从组织培养表面分离。以吸管去除细胞并对细胞计数后，将约20,000-100,000个干细胞，优选约50,000个干细胞传代至含新鲜培养基的新培养容器。通常，该新培养基与取出该干细胞的培养基为相同类型。本发明包含已经至少传代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20次，或更多次的胎盘干细胞群。
5.4.3胎盘干细胞群
本发明提供了胎盘干细胞群。胎盘干细胞群可直接从一个或多个胎盘分离；即，该胎盘干细胞群可以是胎盘细胞群，其包括从灌注液获取的或包含在该灌注液中的、或是从消化液(即，对胎盘或其部分进行酶消化获得的细胞采集物)中获取的或包含在该消化液中的胎盘干细胞。也可培养和扩增本发明的分离的胎盘干细胞以制备胎盘干细胞群。也可培养和扩增包含胎盘干细胞的胎盘细胞群制备胎盘干细胞群。
本发明的胎盘干细胞群包含胎盘干细胞，例如，此处所述的胎盘干细胞。在不同的实施方式中，在分离的胎盘干细胞群中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞为胎盘干细胞。即，胎盘干细胞群可包含，例如，1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的非干细胞。
本发明提供了通过，例如，选择表达特定标记和/或特定培养或形态学特征的胎盘干细胞(不管从酶消化还是灌注获得的)制备分离的胎盘干细胞群的方法。例如，在一个实施方式中，本发明提供了制备细胞群的方法，其包括选择胎盘细胞，该细胞(a)与基底粘附，并且(b)表达CD200和HLA-G；和从其它细胞中分离所述细胞以形成细胞群。在另一实施方式中，制备细胞群的 方法包括选择胎盘细胞，该细胞(a)与基底粘附，并且(b)表达CD73、CD105和CD200；和从其它细胞中分离所述细胞以形成细胞群。在另一实施方式中，制备细胞群的方法包括选择胎盘细胞，该细胞(a)与基底粘附，并且(b)表达CD200和OCT-4；和从其它细胞中分离所述细胞以形成细胞群。在另一实施方式中，制备细胞群的方法包括选择胎盘细胞，该细胞(a)与基底粘附，(b)表达CD73和CD105，并且(c)当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含所述干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成；和从其它细胞中分离所述细胞以形成细胞群。在另一实施方式中，制备细胞群的方法包括选择胎盘细胞，该细胞(a)与基底粘附，并且(b)表达CD73、CD105和HLA-G；和从其它细胞中分离所述细胞以形成细胞群。在另一实施方式中，制备细胞群的方法包括选择胎盘细胞，该细胞(a)与基底粘附，(b)表达OCT-4，并且(c)当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含所述干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成；和从其它细胞中分离所述细胞以形成细胞群。在上述任意实施方式中，该方法可进一步包括选择表达ABC-p(胎盘特异性ABC转运蛋白；例如，参见Allikmets等人,Cancer Res.58(23):5337-9(1998))的胎盘细胞。该方法还可包括选择表现出至少一种例如间充质干细胞的特定特征(例如CD29的表达、CD44的表达、CD90的表达或前述组合的表达)的细胞。
在上述的实施方式中，该基底可以是可进行细胞(例如，胎盘干细胞)培养和/或选择的任何表面。该基底通常是塑料，例如，组织培养皿或塑料多孔板。组织培养皿可以涂覆生物分子，例如，层粘蛋白或纤维连接蛋白。
可通过本领域已知的任何细胞选择方法选择细胞，例如胎盘干细胞，以用于胎盘干细胞群。例如，可使用一种或多种细胞表面标记的抗体通过流式细胞计数或FACS选择细胞。可使用抗体结合磁珠进行选择。对某些干细胞相关标记具有特异性的抗体已为本领域所知。例如，针对OCT-4(Abeam,Cambridge,MA)、CD200(Abeam)、HLA-G(Abeam)、CD73(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA)、CD105(Abeam；BioDesign International,Saco,ME)等的抗体。针对其它标记的抗体也可在市场上购得，例如CD34、CD38和CD45可从StemCell Technologies或BioDesign International等公司获得。
分离的干细胞群可包含非干细胞的胎盘细胞，或是非胎盘细胞的细胞。
分离的胎盘干细胞群可与一种或多种非干细胞群或非胎盘细胞群组合。例如，分离的胎盘干细胞群可与血液(例如，胎盘血或脐带血)、血液衍生干细胞(例如，来自胎盘血或脐带血的干细胞)、血液衍生有核细胞群、骨髓衍生间充质细胞、骨衍生干细胞群、天然骨髓、成年(体)干细胞、组织中所含的干细胞群、培养的干细胞、完全分化细胞群(例如，软骨细胞、纤维原细胞、羊膜 细胞、造骨细胞、肌肉细胞、心肌细胞等)等组合。分离的胎盘干细胞群中的细胞可与大量其它类型的细胞组合，相对于各群中的总有核细胞数量的比率为约100,000,000:1、50,000,000:1、20,000,000:1、10,000,000:1、5,000,000:1、2,000,000:1、1,000,000:1、500,000:1、200,000:1、100,000:1、50,000:1、20,000:1、10,000:1、5,000:1、2,000:1、1,000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:500、1:1,000、1:2,000、1:5,000、1:10,000、1:20,000、1:50,000、1:100,000、1:500,000、1:1,000,000、1:2,000,000、1:5,000,000、1:10,000,000、1:20,000,000、1:50,000,000或约1:100,000,000。分离的胎盘干细胞群中的细胞也可与大量细胞类型的大量细胞组合。
在一个实施方式中，分离的胎盘干细胞群与大量造血干细胞组合。例如，这样的造血干细胞可以包含在未处理的胎盘、脐带血或外周血内；在来自胎盘血、脐带血或外周血的总有核细胞内；在来自胎盘血、脐带血或外周血的分离的CD34⁺细胞群内；在未经处理的骨髓内；在来自骨髓的总有核细胞内；在来自骨髓的分离的CD34⁺细胞群内等。
5.5胎盘干细胞的保存
可保存胎盘干细胞，即，将其放置于能长期储存的条件下、或是能抑制细胞因凋亡或坏死等原因而死亡的条件下。
如2005年12月25日提交的题为“收集和保存胚胎干细胞的改良组合物和该组合物的使用方法(Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition)”的美国临时申请号60/754,969所述，可使用例如包含凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟化碳的组合物保存胎盘干细胞。在一个实施方式中，本发明提供了保存干细胞群的方法，其包括将所述干细胞群与包含凋亡抑制剂和携氧全氟化碳的干细胞采集组合物接触，其中与未接触凋亡抑制剂的干细胞群相比，所述凋亡抑制剂以足以减少和防止干细胞群凋亡的量和时间存在。在具体实施方式中，所述凋亡抑制剂是caspase抑制剂。在另一具体实施方式中，所述凋亡抑制剂是JNK抑制剂。在更具体的实施方式中，所述JHK抑制剂不调节所述干细胞的分化或增殖。在另一实施方式中，所述干细胞采集组合物在分开的相中包含所述凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一实施方式中，所述干细胞采集组合物在乳液中包含所述凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一实施方式中，该干细胞采集组合物进一步包括乳化剂，例如卵磷脂。在另一实施方式中，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳在与干细胞接触时其温度介于约0℃和约25℃。在另一更具体的实施方式中，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳在与干细胞接触时其温度介于约2℃和约10℃，或介于约2℃和约5℃。在另一更 具体的实施方式中，所述接触在所述干细胞群的运输过程中进行。在另一更具体的实施方式中，所述接触在所述干细胞群的冷冻和解冻过程中进行。
在另一实施方式中，本发明提供了保存胎盘干细胞群的方法，其包括将所述干细胞群与凋亡抑制剂和器官保存化合物接触，其中与未接触凋亡抑制剂的干细胞群相比，所述凋亡抑制剂以足以减少和防止干细胞群凋亡的量和时间存在。在具体实施方式中，该器官保存化合物为UW溶液(参见美国专利号4,798,824；也称为ViaSpan，还可参见Southard等人,Transplantation 49(2):251-257(1990))或如Stern等人的美国专利号5,552,267所述的溶液。在另一实施方式中，所述器官保存化合物为羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖或其组合。在另一实施方式中，该干细胞采集组合物进一步在两相或乳液中包含携氧全氟化碳。
在本方法的另一实施方式中，胎盘干细胞在灌注过程中与包含了凋亡抑制剂和携氧全氟化碳、器官保存化合物或其组合的干细胞采集组合物接触。在另一实施方式中，所述干细胞在组织破碎(例如，酶消化)处理中接触。在另一实施方式中，在通过灌注采集后、或通过组织破碎(例如，酶消化)采集后将胎盘干细胞与所述干细胞采集化合物接触。
在胎盘细胞采集、富集和分离过程中，通常优选尽量减少或消除由乏氧和机械应力等产生的细胞应激。因此，在本方法的另一实施方式中，在所述保存中，在采集、富集或分离期间，干细胞或干细胞群暴露至乏氧条件六小时以下，其中乏氧条件是低于正常血氧浓度的氧浓度。在更具体的实施方式中，在所述保存中，所述干细胞群暴露于所述乏氧条件下不到两小时。在另一更具体的实施方式中，所述干细胞群在采集、富集或分离过程中暴露于所述乏氧条件下少于一小时、或少于30分钟，或未暴露至乏氧条件。在另一具体实施方式中，所述干细胞群在采集、富集或分离中未暴露于剪切应力。
本发明的胎盘干细胞可进行低温保存，例如，保存在安瓿等小容器中的低温保存培养基中。适用的低温保存培养基包括但不限于培养基，包括生长培养基或细胞冻存培养基，例如商业上可获得的细胞冻存培养基，如C2695、C2639或C6039(Sigma)。低温保存培养基优选包含浓度为例如约10％(v/v)的DMSO(二甲亚砜)。低温保存培养基可包含其它试剂，例如，甲基纤维素和/或甘油。胎盘干细胞在低温保存过程中优选以约1℃/min的速度冷却。优选的低温保存温度为约-80℃至约-180℃，优选约-125℃至约-140℃。低温保存细胞可在解冻使用前转移至液氮。例如，在一些实施方式中，一旦安瓿达到约-90℃，将其转移至液氮储存区。低温保存细胞优选在约25℃至约40℃，优选约37℃下的温度下解冻。
5.6胎盘干细胞的使用
5.6.1包含胎盘干细胞的组合物
本发明的免疫抑制方法可使用包含胎盘干细胞或从其获得的生物分子的组合物。类似地，本发明的大量胎盘干细胞和胎盘干细胞群可与任何用于例如研究或治疗的生理可接受或医学可接受的化合物、组合物或装置组合。
5.6.1.1低温保存的胎盘干细胞
可保存(例如，低温保存)本发明的免疫抑制性胎盘干细胞群以供日后使用。低温保存细胞(如干细胞)的方法已为本领域熟知。胎盘干细胞群可制成易于向个体施用的形式。例如，本发明提供了包含在适于进行医疗施用的容器中的胎盘干细胞群。例如，该容器可以是无菌塑料袋、瓶、缸或易于施用胎盘干细胞群的其它容器。例如，该容器可以是血袋或适于向接受者静脉内施用液体的其它塑料的、医学可接受的袋子。该容器优选为可低温保存合并的干细胞群的容器。
低温保存的免疫抑制性胎盘干细胞群可包含来自单个供体或多个供体的胎盘干细胞。该胎盘干细胞群可与目标接受者完全地HLA-匹配，或者部分或完全HLA-不匹配。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了在容器中的包含免疫抑制性胎盘干细胞群的组合物。在具体实施方式中，该干细胞群被低温保存。在另一具体实施方式中，该容器可以是袋、瓶或缸。在更具体的实施方式中，所述袋为无菌塑料袋。在更具体的实施方式中，所述袋适于支持或促进所述胎盘干细胞群的静脉内施用。该袋可包含多个相互连接的腔或室从而可使胎盘干细胞或一种或多种其它溶液(例如，药物)在施用前或施用时进行混合。在另一个具体实施方式中，该组合物包含一种或多种可有利于合并的干细胞群低温保存的化合物。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞群包含在生理可接受的水性溶液中。在更具体的实施方式中，所述生理可接受水性溶液为0.9％NaCl溶液。在另一具体实施方式中，所述胎盘干细胞群包含与所述干细胞群的接受者HLA-匹配的胎盘细胞。在另一具体实施方式中，所述合并的干细胞群包含对所述干细胞群的接受者至少部分HLA-不匹配的胎盘细胞。在另一个具体实施方式中，所述胎盘干细胞来自多个供体。
5.6.1.2药物组合物
免疫抑制性胎盘干细胞群或包含胎盘干细胞的细胞群可被制成体内使用的药物组合物。这些药物组合物包含存在于药学可接受载体中的胎盘干细胞群或包含胎盘干细胞的细胞群，该载体例如盐溶液或适于体内施用的其它生 理可接受溶液。本发明的药物组合物可包含本文所述的任意胎盘干细胞群或胎盘干细胞类型。该药物组合物可包含胎儿、母体或同时包含胎儿和母体的胎盘干细胞。本发明的药物组合物可进一步包含从单个个体或胎盘或是从多个个体或胎盘获得的胎盘干细胞。
本发明的药物组合物可包含任意免疫抑制性数量的胎盘干细胞。例如，在不同的实施方式中，胎盘干细胞的单一单位剂量可包含大约、至少或不超过1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多的胎盘干细胞。
本发明的药物组合物包含含有50％或更多活细胞的细胞群(即，群中至少50％的细胞具有功能或存活)。优选地，群中至少60％的细胞存活。更优选地，药物组合物的群中至少70％、80％、90％、95％或99％的细胞存活。
本发明的药物组合物可包含一种或多种例如促进植入的化合物(例如，抗T细胞受体抗体、免疫抑制剂等)；稳定剂例如白蛋白、右旋糖苷40、明胶、羟乙基淀粉等。
5.6.1.3胎盘干细胞条件培养基
本发明的胎盘干细胞可用于制备免疫抑制性的条件培养基，即，包含了一种或多种由所述干细胞分泌的对一种或多种类型的免疫细胞具有可检测的免疫抑制作用的生物分子的培养基。在各种实施方式中，该条件培养基包含胎盘干细胞在其中已生长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天的培养基。在另一实施方式中，该条件培养基包含胎盘干细胞在其中已生长至至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％汇合，或直至100％汇合的培养基。这些条件培养基可用于支持胎盘干细胞的另一个群或其它类型干细胞群的培养。在另一实施方式中，该条件培养基包含胎盘干细胞在其中已分化成成熟细胞类型的培养基。在另一实施方式中，本发明的条件培养基包含胎盘干细胞和非胎盘干细胞已在其中培养的培养基。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了包含培养基的组合物，该培养基来自胎盘干细胞培养物，其中所述胎盘干细胞：(a)与基底粘附；(b)表达CD200和HLA-G，或表达CD73、CD105和CD200，或表达CD200和OCT-4，或表达CD73、CD105和HLA-G，或表达CD73和CD105并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含该胎盘干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成，或表达OCT-4并当所述群在适于拟胚体形成的条件下培养时促进包含该胎盘干细胞的胎盘细胞群中的一或多个拟胚体的形成；并且(c)在MLR(混合淋巴细胞反应)中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞扩增，其中所述的胎盘干细胞培养物已在所述培养基中培养24小时或更长时间。在具体 实施方式中，该组合物进一步包含大量所述胎盘干细胞。在另一个具体实施方式中，该组合物包含了大量非胎盘细胞。在更具体的实施方式中，所述非胎盘细胞包含CD34⁺细胞，例如，造血祖细胞，如外周血造血祖细胞、脐带血造血祖细胞或胎盘血造血祖细胞。该非胎盘细胞还可包含其它干细胞，例如间充质干细胞，例如骨髓衍生间充质干细胞。该非胎盘细胞还可以为一种或多种类型的成熟细胞或细胞系。在另一个具体实施方式中，该组合物进一步包含抗增殖剂，例如，抗MIP-1α或抗MIP-1β抗体。
5.6.1.4包含胎盘干细胞的基质
本发明进一步包括包含免疫抑制性胎盘干细胞群的基质、水凝胶、支架等。
本发明的胎盘干细胞可被接种至自然基质上，例如，胎盘生物材料如羊膜材料上。这样的羊膜材料可以是，例如直接从哺乳动物胎盘切割的羊膜；固定的或热处理的羊膜、充分干燥(即，<20％H₂O)羊膜、绒毛膜、充分干燥绒毛膜、充分干燥羊膜和绒毛膜等。在其上接种胎盘干细胞的优选胎盘生物材料可参见Hariri，美国申请公开号2004/0048796。
本发明的胎盘干细胞可悬浮于例如适于注射的水凝胶溶液中。适用于这些组合物的水凝胶包括自组装肽，例如RAD16。在一个实施方式中，包含细胞的水凝胶溶液可在模子中硬化以形成细胞分散其中的供植入的基质。在该种基质中的胎盘干细胞还可进行培养从而在植入前有丝分裂扩增。例如，该水凝胶可以是通过共价、离子或氢键交联形成三维开放晶格结构的有机聚合物(天然或合成)，该结构包埋水分子以形成凝胶。水凝胶形成材料包括多糖(如海藻酸及其盐)、肽、聚磷嗪以及离子交联的聚丙烯酸、嵌段聚合物(例如分别通过温度或pH交联的聚乙烯氧化物-聚丙二醇嵌段共聚物)。在一些实施方式中，本发明的水凝胶或基质可生物降解。
在本发明的一些实施方式中，该制剂包含原位可聚合凝胶(例如，参见美国专利申请公开号2002/0022676；Anseth等人,J.Control Release,78(l-3):199-209(2002)；Wang等人,Biomaterials,24(22):3969-80(2003))。
在一些实施方式中，聚合物在水性溶液例如水、缓冲盐溶液或水性醇溶液中至少是部分可溶的，该聚合物具有带电侧基或其单价离子盐。具有能与阳离子反应的酸性侧基的聚合物的范例为聚(磷偶氮)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(乙酸乙烯酯)以及磺化聚合物，例如磺化聚苯乙烯。还可使用通过丙烯酸或甲基丙烯酸和乙烯醚单体或聚合物反应形成的具有酸性侧基的共聚物。酸性基团的范例为羧酸基、磺酸基、卤化(优选氟化)醇基、酚类OH基、以及酸性OH基。
可将本发明的胎盘干细胞或其共培养物接种至三维框架或支架上并植入体内。该种框架可与任意一种或多种生长因子、细胞、药物或刺激组织形成或以其它方式改善本发明实践的其它成分联合植入。
可用于本发明的支架的范例包括无纺毡、多孔泡沫或自组装肽。无纺毡可采用包含合成的乙酸和乳酸可吸收共聚物(例如，PGA/PLA)(VICRYL,Ethicon公司,Somerville,N.J.)的纤维形成。由例如聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物组成的，通过诸如冷冻干燥法或冻干法(例如，参见美国专利号6,355,699)形成的泡沫也可作为支架使用。
本发明的胎盘干细胞还可接种至生理可接受陶瓷材料上或与其接触，该材料包括但不限于，单、双、三、α-三、β-三以及四磷酸钙、羟磷灰石、氟磷灰石、硫酸钙、氟化钙、氧化钙、碳酸钙、磷酸钙镁、生物活性玻璃如及其混合物。目前商业上可获得的多孔生物相容性陶瓷材料包括(CanMedica公司,加拿大)、(Merck Biomaterial France,法国)、(Mathys,AG,Bettlach,瑞士)，以及矿化胶原质骨嫁接产品例如HEALOS^TM(DePuy公司,Raynham,MA)和RHAKOSS^TM以及(Orthovita,Malvern,Pa.)。该框架可以是天然和/或合成材料的混合物、掺杂物或复合物。
在另一实施方式中，胎盘干细胞可接种毡上或与其接触，该毡可以由例如复丝组成，该复丝从生物可吸收材料如PGA、PLA、PCL共聚物或掺杂物或透明质酸制得。
在另一实施方式中，本发明的胎盘干细胞可接种至泡沫支架上，该支架可以是复合结构。该种泡沫支架可模制成为有用的形状，例如体内待修复、替换或增大的特定结构部分的形状。在一些实施方式中，该框架可在接种本发明的细胞之前先以例如0.1M乙酸处理，然后在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中放置，以增强细胞吸附。可修饰基质的外表面以提高细胞的吸附或生长以及组织的分化，该修饰例如通过血浆涂覆基质，或添加一种或多种蛋白(例如，胶原、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、粘多糖(例如，硫酸肝素、软骨素-4-硫酸、软骨素-6-硫酸、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白等)、细胞基质和/或其它材料，例如但不限于，明胶、海藻酸、琼脂、琼脂糖以及植物胶等。
在一些实施方式中，该支架包含可使其具有非成血栓性的材料，或以之进行处理。这类处理和材料还可促进和维持内皮生长、迁移和胞外基底沉积。这类材料和处理的范例包括但不限于天然材料例如基底膜蛋白如层粘蛋白和IV型胶原质、合成材料例如EPTFE、以及嵌段聚氨酯脲硅酮，如PURSPAN^TM(The Polymer Technology Group公司,Berkeley,Calif)。支架还可包含抗血栓形成剂如肝素；还可在接种胎盘干细胞前处理该支架以改变表面电荷(例如，以 血浆涂覆)。
5.6.2永生化胎盘干细胞系
可通过以任何适用的包含生长促进基因的载体转染使哺乳动物胎盘细胞有条件地永生化，该生长促进基因即编码在适当条件下促进被转染细胞生长的蛋白的基因，从而使该生长促进蛋白的生成和/或活性可通过外部因子进行调节。在优选实施方式中，该生长促进基因为癌基因，例如但不限于，v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多瘤病毒大T抗原、E1a腺病毒或人乳头瘤病毒的E7蛋白。
生长促进蛋白的外部调节可通过将该生长促进基因置于外部可调节启动子(例如，可通过改变转染细胞温度或与该细胞接触的培养基的组分来控制其活性的启动子)的控制之下来实现。在一个实施方式中，可采用四环素(tet)控制的基因表达系统(参见Gossen等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA89:5547-5551,1992；Hoshimaru等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:1518-1523,1996)。当tet缺失时，该载体内的tet控制的反式激活因子(tTA)强烈激活从ph_CMV*-1(融合至tet操纵基因序列的人微细胞巨化病毒最小启动子)的转录。tTA是大肠杆菌(Escherichia coli)转座子-10-衍生的tet抗性操纵子的阻遏子(tetR)和单纯疱疹病毒的VP16的酸性结构域的融合蛋白。无毒低浓度的tet(例如，0.01-1.0μg/mL)几乎完全破坏了tTA的转录激活。
在一个实施方式中，该载体进一步包含编码可选择标记(例如，可赋予耐药性的蛋白)的基因。细菌新霉素抗性基因(neo^R)便是可在本发明中采用的该种标记之一。携带neo^R的细胞可通过本领域普通技术人员已知的方法进行选择，例如向生长培养基添加100-200μg/mL G418。
可通过本领域普通技术人员已知的多种方法中的任意一种实现转染，包括，但不限于，逆转录病毒感染。一般而言，细胞培养物可通过与采集自载体生成细胞系的条件培养基和含N2补充物的DMEM/F12的混合物共同培养进行转染。例如，按如上所述制备的胎盘细胞培养物可通过在一体积的条件培养基和二体积的含N2补充物的DMEM/F12中培养约20小时在五日后体外感染。随后可如上所述对携带可选择标记的转染细胞进行选择。
转染后，将培养物传代至允许增殖(例如，允许至少30％的细胞在24小时的期限内倍增)的表面。优选地，该基底为由涂覆了聚鸟氨酸(10μg/mL)和/或层粘蛋白(10μg/mL)的组织培养塑料产品组成的聚鸟氨酸/层粘蛋白基底、聚赖氨酸/层粘蛋白基底或以纤维连接蛋白处理的表面。然后每3-4天向培养物饲喂补充或未补充一种或多种增殖促进因子的生长培养基。可在培养物小于50％汇合时将增殖促进因子添加至生长培养基。
可采用标准技术将该条件永生化胎盘干细胞系传代，例如在80-95％汇合时进行胰蛋白酶化。在一些实施方式中，大约直至第二十代，维持选择仍是有利的(例如，通过对含有新霉素抗性基因的细胞添加G418)。也可在液氮中冷冻细胞进行长期保存。
可从如上制备的条件永生化人胎盘干细胞系中分离克隆细胞系。一般而言，该种克隆细胞系可通过如有限稀释或采用克隆环等标准技术进行分离并扩增。一般可通过如上方式饲喂和传代克隆细胞系。
一般可通过在促进分化的培养条件下抑制生长促进蛋白的生成和/或活性诱导条件永生化人胎盘干细胞系分化，该细胞系可以但不必须是克隆的。例如，假如编码生长促进蛋白的基因受外部可调节启动子控制，可改变条件(例如，温度或培养基的组成)以抑制生长促进基因的转录。对于上述四环素控制的基因表达系统，可通过添加四环素抑制生长促进基因的转录实现分化。一般而言，1μg/mL四环素维持4-5天足以引起分化。为促进进一步分化，可在生长培养基中添加其它试剂。
5.6.3试验
本发明的胎盘干细胞可被用于试验中以测定与未暴露至该条件时的胎盘干细胞相比培养条件、环境因素、分子(例如，生物分子、小无机分子等)等对干细胞增殖、扩增和/或分化的影响。
在优选实施方式中，对本发明的胎盘干细胞与某种分子接触后在增殖、扩增或分化上的变化进行了测定。例如，在一个实施方式中，本发明提供了鉴定能调节大量胎盘干细胞增殖的化合物的方法，其包括将所述大量干细胞与所述化合物在允许增殖的条件下接触，其中如果与未接触所述化合物的大量干细胞相比，所述化合物引起所述大量干细胞的增殖的可检测变化，则所述化合物被鉴定为调节胎盘干细胞增殖的化合物。在具体实施方式中，所述化合物被鉴定为增殖的抑制剂。在另一具体实施方式中，所述化合物被鉴定为增殖的增强剂。
在另一实施方式中，本发明提供了鉴定能调节大量胎盘干细胞扩增的化合物的方法，其包括将所述大量干细胞与所述化合物在允许扩增的条件下接触，其中如果与未接触所述化合物的大量干细胞相比，所述化合物引起所述大量干细胞的扩增的可检测变化，则所述化合物被鉴定为调节胎盘干细胞扩增的化合物。在具体实施方式中，所述化合物被鉴定为扩增的抑制剂。在另一具体实施方式中，所述化合物被鉴定为扩增的增强剂。
在另一实施方式中，本发明提供了鉴定能调节胎盘干细胞分化的化合物的方法，其包括将所述干细胞与所述化合物在允许分化的条件下接触，其中 如果与未接触所述化合物的干细胞相比，所述化合物引起所述干细胞的分化的可检测变化，则所述化合物被鉴定为调节胎盘干细胞增殖的化合物。在具体实施方式中，所述化合物被鉴定为分化的抑制剂。在另一具体实施方式中，所述化合物被鉴定为分化的增强剂。
5.6.4胎盘干细胞库
来自产后胎盘的干细胞可用多种不同的方式培养以得到一组胎盘干细胞批次(例如，一组可单独施用的剂量)。例如，该种批次可从胎盘灌注或酶消化的胎盘组织中的干细胞中获得。从大量胎盘获得的胎盘干细胞批次的组可安排在胎盘干细胞库中以供例如长期储存。通常可从胎盘材料的初代培养中获取贴壁干细胞以形成种子培养物，后者在控制条件下扩增以形成约与倍增数量相当的细胞群。优选从单个胎盘的组织中获取批次，但也从大量胎盘的组织中获取。
在一个实施方式中，如下获取干细胞批次。例如，首先通过切碎、以适当的酶如胶原酶消化将胎盘组织破碎(见上文5.2.3节)。该胎盘组织优选包含，例如，来自单个胎盘的完整羊膜、完整绒毛膜、或同时包含两者，但也可以仅包含羊膜或绒毛膜的一部分。该消化后的组织可培养约1-3周，优选约2周。去除非贴壁细胞后，通过胰蛋白酶消化等作用采集形成的高密度集落。采集这些细胞并重悬浮于一定体积的培养基中，并将其定义为0代细胞。
然后用0代细胞接种扩增培养物。可通过独立细胞培养装置的任何设置进行扩增培养，例如，NUNC^TM的Cell Factory。可将0代细胞培养物以任何程度细分从而以例如1×10³、2×10³、3×10³、4×10³、5×10³、6×10³、7×10³、8×10³、9×10³、1×10⁴、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴或10×10⁴个干细胞接种扩增培养物。优选地，使用约2×10⁴至约3×10⁴个0代细胞接种各扩增培养物。扩增培养物的数量可取决于0代细胞的数量，并可根据获得该干细胞的特定胎盘而取更大或更小的数量。
扩增培养物可生长至培养中的细胞密度达到一定值，例如，约1×10⁵个细胞/cm²。此时可对细胞进行采集或低温保存，或如上所述传代进入新的扩增培养物。细胞可在使用前传代如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。优选在扩增培养中保留对群体倍增的累积数量的记录。来自0代培养的细胞可扩增至2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次倍增，或直至60次倍增。然而，将细胞群划分为单独剂量之前群体倍增的数量优选介于约15和约30次之间，优选约20次倍增。该细胞可在整个扩增过程中连续培养，或在扩增中的一个或多个点进行冷冻。
可以冷冻(例如低温保存)将用于单独剂量的细胞以供日后使用。单独剂量可包含，例如，约1百万至约1亿个细胞/ml，并能总共包含约10⁶至约10⁹个细胞。
在本方法具体实施方式中，0代细胞培养至约4次倍增，然后冷冻在第一细胞库中。将第一细胞库的细胞冷冻并用于接种第二细胞库，对该细胞再进行八次倍增的扩增。采集并冷冻该阶段的细胞并用于接种新的扩增培养物，允许该培养无进行另外八次倍增，使细胞倍增的累积数量达到约20次。在传代中间点的细胞可以约10万至约1千万细胞/ml的单位进行冷冻，优选约1百万细胞/ml冷冻以用于后续扩增培养。约20次倍增的细胞可冷冻为约1百万至约1亿个细胞/ml的单独剂量以供施用或用于制备含干细胞的组合物。
在优选实施方式中，对获得该胎盘的供体(例如亲体)进行至少一种病原体的测试。如果该母体对测试病原体呈阳性，则放弃从该胎盘获取的全部批次。该种测试可在制备胎盘干细胞批次过程中的任何时间进行，包括0代细胞的建立前或建立后，或在扩增培养过程中。可对其的存在进行测试的病原体包括但不限于，甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝、人免疫缺陷病毒(I型和II型)、细胞巨化病毒、疱疹病毒等。
5.6.5多发性硬化症的治疗
另一方面，本发明提供了治疗患有多发性硬化症或多发性硬化症相关症状的个体的方法，包括以足以可检测地调节(例如，抑制)个体的免疫应答的量和持续时间向该个体施用大量胎盘干细胞。
多发性硬化症(MS)是中枢神经系统的慢性、复发性炎性疾病。该疾病可导致CNS和PNS轴突周围的髓鞘、少突细胞以及神经细胞本身的损伤。该疾病通过在细胞粘附分子和促炎症细胞因子的影响下增殖、通过血脑屏障并进入CNS的自身反应性T细胞，特别是CD4⁺T细胞介导。MS的症状包括肢体感觉障碍、视神经障碍、锥体束障碍、膀胱功能障碍、肠功能障碍、性功能障碍、共济失调和复视。
已鉴定了四种不同的MS类型或临床病程。首先，复发/缓解型MS(RRMS)表征为在数日至数周期间内急性的神经功能障碍的自限发作(self-limiting attacks)，随后为数月的恢复期，有时不能完全恢复。第二种类型为次发渐进型MS(SPMS)，其最初为RRMS，但随后发生改变，以致其临床病程表征为与急性发作无关的功能持续恶化。第三种类型为原发渐进型MS(PPMS)，其表征为从发作时起功能的持续衰退，没有急性发作。第四种类型为渐进/复发型MS(PRMS)，同样起始于渐进过程，在功能渐进衰退中有偶尔的发作。
通常可采用运动技能评估，可选择地结合MRI对患有MS的人员进行评 价。例如，一种运动技能评估(扩展的伤残状态等级)对感染个体的能力级别评分如下：
0.0神经检查正常
1.0没有残疾，在一个FS中有最小信号
1.5没有残疾，在多个FS中有最小信号
2.0在一个FS中有最小残疾
2.5在一个FS中有轻度残疾或在两个FS中有最小程度的残疾
3.0在一个FS中有中度残疾，或在三或四个FS中有轻度残疾。完全可走动
3.5完全可走动，但是在一个FS中有中度残疾和数个其它系统中有超过最小程度的残疾
4.0完全可走动，不需辅助，生活自理，尽管有相当严重的残疾，但每天起床走动大约12小时；不需辅助或休息能够行走大约500米
4.5完全可走动，不需辅助，每天起床走动大多时间，能够整日工作，完全活动可能有一些限制或需要最小限度的帮助；特点是相当严重的残疾；不需辅助或休息能够行走大约300米
5.0不需辅助或休息行走大约200米；残疾严重到足以伤害整日的日常活动(不需特殊设备的整日工作)
5.5不需辅助或休息行走大约100米；残疾严重到足以阻止整日的日常活动
6.0间歇辅助或一侧持续辅助(竹杖、拐杖、支架)下行走大约100米，需要或不需休息
6.5持续的双侧辅助(竹杖、拐杖、支架)下行走大约20米，不需休息
7.0即使在辅助下也不能行走超出大约5米，基本限制在轮椅上；自行移动到标准轮椅中并单独挪动；每天在轮椅上起床走动大约12小时
7.5行走不多于几步；限制在轮椅上；挪动时可能需要辅助；自行移动轮椅，但不能整天呆在标准轮椅上；可能需要自动轮椅
8.0基本限制在床或椅子上或在轮椅上走动，但每天可以离开床大多数时间；保留有自理功能；一般有手臂的有效使用
8.5每天的大多数时间基本限制在床上；有一些手臂的有效使用，保留部分自理功能
9.0被限制在床上；仍然可以交流和进食
9.5完全无助的卧床病人；不能有效地交流或进食/吞咽
10.0MS引起的死亡
在上述评分系统中，“FS”指测量的八种功能系统，包括锥体、小脑、脑 干、感官、肠和膀胱、视觉、大脑系统以及其它系统。
已知其它类似的评分系统，包括Scripps神经学量表、行走指数以及多发性硬化症功能性复合评分(MSFC)。
MS进展还可通过测定发病率进行评估。
MS的进展还可通过磁共振影像进行评估，磁共振影像可检测与MS相关的神经病灶(例如，新病灶、增强病灶或组合式独特活性病灶)。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了治疗患有MS的个体(例如已诊断患有MS的个体)的方法，其包括向该个体施用足以抑制个体内免疫应答的大量胎盘干细胞。在具体的实施方式中，该施用可测改善该个体中MS的一种或多种症状。在更具体的实施方式中，该症状为，例如，肢体的一种或多种知觉障碍、视神经功能障碍、锥体束功能障碍、膀胱功能障碍、肠功能障碍、性功能障碍、共济失调和复视。在另一具体实施方式中，所述施用可导致EDSS评分中提高至少半分。在另一具体实施方式中，所述施用可导致EDSS评分中提高至少一分。在另一具体实施方式中，所述施用可导致EDSS评分中提高至少两分。在其它具体实施方式中，所述施用可导致多发性硬化症评分或MRI中的可测改善。
MS已通过其它治疗剂进行治疗，例如免疫调节或免疫抑制剂，例如干扰素β(IFNβ)，包括IFNβ-la和IFNβ-lb；醋酸格拉替雷(Copaxone)；环磷酰胺；甲氨蝶呤；硫唑嘌呤(Imuran)；克拉屈滨(Leustatin)；环孢霉素；米托蒽醌等。MS也已通过抗炎治疗剂进行治疗，例如糖皮质激素，包括促肾上腺皮质激素(ACTH)、甲基强的松龙、地塞米松等。MS也已通过其它类型的治疗剂进行治疗，例如静脉内免疫球蛋白、血浆置换或柳氮磺胺吡啶。
因此，本发明进一步提供了治疗患有MS的个体(例如已诊断患有MS的个体)的方法，其包括向该个体施用足以抑制个体内免疫应答的大量胎盘干细胞(其中该施用可检测地改善个体中MS的一种或多种症状)以及一种或多种治疗剂。在一个实施方式中，该治疗剂为糖皮质激素。在具体实施方式中，该糖皮质激素为促肾上腺皮质激素(ACTH)、甲基强的松龙或地塞米松。在另一实施方式中，该治疗剂是一种免疫调节或免疫抑制剂。在不同的具体实施方式中，该免疫调节或免疫抑制剂为IFNβ-la和IFNβ-lb、醋酸格拉替雷(Copaxone)、环磷酰胺、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、克拉屈滨、环孢霉素或米托蒽醌。在其它实施方式中，该治疗剂为静脉内免疫球蛋白、血浆置换或柳氮磺胺吡啶。在另一实施方式中，该个体被施用前述治疗剂的任意组合。
可使用大量胎盘干细胞并选择性结合一种或多种治疗剂在该疾病进展的任何时间对患有MS的个体(例如被诊断患有MS的个体)进行治疗。例如，该个体可在诊断后立即治疗，或在诊断后1、2、3、4、5、6天内，或在诊断后 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多周内，或在诊断后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年内进行治疗。可在疾病的临床病程中对该个体进行单次治疗或多次治疗。合适的话，可在急性发作、缓解或在慢性退化期对个体进行治疗。在另一实施方式中，该胎盘干细胞在产后施用于患MS的女性以维持其在怀孕时经历的复发缓解或减少的状态。
在一个实施方式中，该个体被施用约3亿个胎盘干细胞的剂量。然而，可根据个体的身体特征(例如体重)而变化剂量，并可在每剂1百万至100亿胎盘干细胞之间变化，优选每剂介于1千万至10亿，或每剂介于1亿至5千万胎盘干细胞。优选通过静脉内施用，但可采用本领域接受的施用活细胞的任何途径。在一个实施方式中，该胎盘干细胞来自于细胞库。
6.实施例
6.1实施例1：胎盘干细胞的培养
通过灌注或物理破碎，例如酶消化从产后哺乳动物胎盘获取胎盘干细胞。在培养基中培养该细胞，该培养基包含60％DMEM-LG(Gibco)、40％MCDB-201(Sigma)、2％胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories)、1×胰岛素-铁传递蛋白-硒(ITS)、1×亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)、10^-9M地塞米松(Sigma)、10^-4M抗坏血酸-2-磷酸(Sigma)、表皮生长因子(EGF)10ng/ml(R&D Systems)、血小板衍化生长因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems)以及100U青霉素/1000U链霉素。
如下方式制备培养细胞的培养瓶。通过向瓶中添加含5ng/ml人FN(Sigma F0895)的5ml PBS，而以纤维连接蛋白(FN)涂覆T75瓶。将含有FN溶液的瓶子在37℃下放置30分钟。然后在细胞培养前去除FN溶液。无需在处理后干燥瓶子。或者使瓶子与FN溶液在4℃下接触过夜或更长时间，然后在使用前将瓶子加温并去除FN溶液。
通过灌注分离的胎盘干细胞
如下方式制备来自胎盘灌注的胎盘干细胞培养物。将来自Ficoll梯度法的细胞以50-100×10⁶细胞/瓶的浓度接种至如上制备的FN涂覆的T75瓶中的15ml培养基中。通常接种5至10瓶。将瓶子在37℃下孵育12-18小时以使贴壁细胞吸附。向各瓶添加10ml的温PBS以去除悬浮的细胞，并轻柔混合。然后去除15ml培养基并以15ml新鲜培养基置换。在培养开始后3-4天更换所有培养基。在进行后续的培养基置换时，去除50％或7.5ml培养基。
自约第12日起，以显微镜检查培养物中贴壁细胞集落的生长。通常在培 养开始后第13日至第18日之间，当细胞培养物达到约80％汇合时，通过胰蛋白酶消化收集贴壁细胞。从原代培养中采集的细胞被称为0代(零)。
通过物理破坏和酶消化分离的胎盘干细胞
如下方式制备来自消化的胎盘组织的胎盘干细胞培养物。将灌注的胎盘母侧朝上放置在无菌纸上。用刀片在胎盘母侧刮取约0.5cm的表面层，并使用该刀片去除胎盘组织块，尺寸为约1×2×1cm。然后将该胎盘组织切成约1mm³的片段。将这些片段放入50ml Falcon管并在37℃的水浴中先以胶原酶IA(2mg/ml,Sigma)消化30分钟，再以胰蛋白酶-EDTA(0.25％,GIBCO BRL)消化10分钟。将所得溶液在室温下以400g离心10分钟，并去除消化液。以大约10倍体积的PBS重悬浮该沉淀(例如，将5ml的沉淀以45ml PBS重悬浮)，然后在室温下以400g将管离心10分钟。将组织/细胞沉淀重悬浮于130mL的培养基中，然后在每个涂覆纤维连接蛋白的T75瓶中接种13ml细胞。在37℃下于含有5％CO₂的潮湿空气中培养细胞。在该阶段可选择性低温保存胎盘干细胞。
胎盘干细胞的传代培养和扩增
在37℃的水浴中迅速解冻低温保存的细胞。用10ml温培养基从冷冻小瓶中迅速移出胎盘干细胞并转移至15ml无菌管中。将细胞在室温下以400g离心10分钟。通过吹吸将细胞轻柔重悬浮于10ml温培养基中，并用台盼蓝拒染法计算活细胞数。以大约6000-7000细胞/cm²的密度将细胞接种于如上制备的涂覆RN的瓶中(每个T-75瓶中大约5×10⁵细胞)。将细胞在37℃、5％CO₂和90％湿度下孵育。当细胞达到75-85％汇合，从瓶中无菌取出所有耗竭培养基并丢弃。添加3ml的0.25％胰蛋白酶/EDTA(w/v)溶液以覆盖细胞层，然后将细胞在37℃、5％CO₂和90％湿度下培养5分钟。轻拍瓶子一次或两次以加速细胞脱落。当>95％的细胞呈圆形并脱落后，向每个T-75瓶添加7ml的温培养基，通过多次在细胞层表面吹吸将溶液分散。
如上所述对细胞计数并检测活性后，在室温下以1000RPM离心细胞5分钟。通过用培养基将T-75瓶中的细胞沉淀轻柔重悬并均匀涂布于两个涂覆FN的T-75瓶中进行细胞传代。
使用上述方法，鉴定表达标记CD105、CD117、CD33、CD73、D29、CD44、CD10、CD90和CD133的贴壁胎盘干细胞群。该细胞群不表达CD34或CD45。这些胎盘干细胞培养物的部分但非全部表达表达HLA-ABC和/或HLA-DR。
6.2实施例2：从胎盘结构分离胎盘干细胞
6.2.1材料与方法
6.2.1.1目标表型的分离
从正常的、足月怀孕的胎盘获取五种不同的胎盘细胞群。所有的捐献者均提供了有关将其胎盘供研究目的使用的完全书面同意书。对五种细胞群进行了检查：来自于(1)胎盘灌注液(来自于胎盘脉管系统的灌注)的胎盘细胞；以及(2)羊膜的酶消化的、(3)绒毛膜的酶消化的、(4)羊膜-绒毛膜板的酶消化的胎盘细胞以及(5)来自于酶消化的脐带细胞。不同的组织以无菌PBS(Gibco-Invitrogen公司,Carlsbad,CA)清洁并置于单独的无菌Petri皿上。采用无菌外科解剖刀切开各组织并置于50mL Falcon锥管中。以1×胶原酶(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)在37℃水浴中消化切碎的组织20分钟，离心，然后以0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco-Invitrogen公司)在37℃水浴中消化10分钟。在消化后离心各组织并以无菌PBS(Gibco-Invitrogen公司)洗涤一次。将复原的细胞过滤两次(一次采用100μm细胞过滤器而一次采用30μm分离过滤器)以去除任何残留胞外基质或细胞碎片。
6.2.1.2细胞活性评估和细胞计数
在消化后采用人工台盼蓝拒染法计算细胞数量并评估细胞活性。将细胞与台盼蓝染料(Sigma-Aldrich)以1:1的比例混合，并在血球计上读取细胞。
6.2.1.3细胞表面标记表征
选择HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺的细胞进行表征。对具有该表型的细胞进行鉴定、定量并以Becton-Dickinson流式细胞仪、FACSCalibur和FACS Aria(Becton-Dickinson,San Jose,CA,美国)中的两者进行表征。以每1百万个细胞约10μL抗体的比例在振荡器上于室温下将各种胎盘细胞染色30分钟。可使用下列抗人抗体：偶联了荧光素异硫氰酸盐(FITC)的针对HLA-G(Serotec,Raleigh,NC)、CD10(BD Immunocytometry Systems,San Jose,CA)、CD44(BD Biosciences Pharmingen,San Jose,CA)以及CD105(R&D Systems公司,Minneapolis,MN)的单克隆抗体；偶联了藻红蛋白(PE)的针对CD44、CD200、CD117和CD13(BD Biosciences Pharmingen)的单克隆抗体；偶联了藻红蛋白-Cy5(PE Cy5)的链霉亲和素和针对CD117(BD Biosciences Pharmingen)的单克隆抗体；偶联了藻红蛋白-Cy7(PE Cy7)的针对CD33和CD10(BD Biosciences)的单克隆抗体；偶联了别藻蓝蛋白(APC)的链霉亲和素和针对CD38(BD Biosciences Pharmingen)的单克隆抗体；以及生物素化的CD90(BD Biosciences Pharmingen)。在孵育后，将该细胞洗涤一次以去除未结合抗体并以4％多聚甲醛(USB,Cleveland,OH)在4℃下固定过夜。次日，洗涤细胞两次，以30μm  分离过滤器过滤，并上样至流式细胞仪。
将以抗小鼠IgG抗体(BD Biosciences Pharmingen)染色的样本作为阴性对照并可用于调节光电倍增管(PMTs)。以抗人抗体单独染色的样本可用作阳性对照并用于调节光谱重叠/补偿。
6.2.1.4细胞分选和培养
采用7-氨基-放线菌素D(7AAD；BD Biosciences Pharmingen)和对目标表型具有特异性的单克隆抗体对一组胎盘细胞(来自灌注液、羊膜、绒毛膜)进行染色。以每1百万个细胞约10μL抗体的比例对细胞染色并在振荡器上于室温下孵育30分钟。然后在BD FACS Aria上阳性分选表达目的表型的活细胞并将其铺盘在培养基中。分选的(目标群)和“所有的”(未分选)胎盘细胞群均进行铺盘以供比较。以表1列举的细胞密度(细胞/cm²)将细胞铺盘于涂覆纤维连接蛋白(Sigma-Aldrich)的96孔板上。根据表达该目标表型的细胞数量确定细胞密度以及是否将该细胞类型以两次重复或三次重复铺盘。
表1：细胞铺盘密度

向96孔板的各孔中加入完全培养基(60％DMEM-LG(Gibco)和40％MCDB-201(Sigma)；2％胎牛血清(Hyclone Labs.)；1×胰岛素-铁传递蛋白-硒(ITS)；1×亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)；10^-9M地塞米松(Sigma)；10^-4M抗坏血酸-2-磷酸(Sigma)；表皮生长因子10ng/mL(R&D Systems)；以及血小板衍化生长因子(PDGF-BB)10ng/mL(R&D Systems))并将孔板放置于5％CO₂/37℃的培养箱中。在第7日，向各孔添加100μL的完全培养基。对96孔板连续监测约2周并在第12日最终评估该培养物。
6.2.1.5数据分析
在FlowJo(Tree star公司)中采用标准选通技术分析FACSCalibur数据。采用FACSDiva软件(Becton-Dickinson)分析BD FACS Aria数据。采用使双联体最小化的双联体辨别选通和标准选通技术对FACS Aria数据进行分析。所有的结果均在Microsoft Excel中编辑且此处的所有数值均表示为平均值±标准差(数量，平均的标准误差)。
6.2.2结果
6.2.2.1细胞活力
可采用人工台盼蓝拒染法对消化后的活力进行评价(图1)。从大部分消化后的组织(来自羊膜、绒毛膜或羊膜-绒毛膜板)获得的细胞的平均活力约为70％。来自羊膜的细胞的平均活力为74.35％±10.31％(n＝6,SEM＝4.21)，来自绒毛膜的细胞的平均活力为78.18％±12.65％(n＝4,SEM＝6.32)，来自羊膜-绒毛膜板的细胞的平均活力为69.05％±10.80％(n＝4,SEM＝5.40)，来自脐带的细胞的平均活力为63.30％±20.13％(n＝4,SEM＝10.06)。来自灌注且未经消化的细胞保持了最高的平均活性89.98±6.39％(n＝5,SEM＝2.86)。
6.2.2.2细胞定量
分析五种不同的胎盘衍生细胞群以确定HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺细胞的数量。从BD FACSCalibur数据分析可以看到羊膜、灌注液和绒毛膜包含了总量最多的该种细胞，分别为30.72±21.80个细胞(n＝4,SEM＝10.90)、26.92±22.56个细胞(n＝3,SEM＝13.02),以及18.39±6.44个细胞(n＝2,SEM＝4.55)(数据未显示)。羊膜-绒毛膜板和脐带包含了总数最少的表达目标表型的细胞，分别为4.72±4.16个细胞(n＝3,SEM＝2.40)和3.94±2.58个细胞(n＝3,SEM＝1.49)(数据未显示)。
类似地，在分析表达目标表型的总细胞百分比时，可以看到羊膜和胎盘灌注液包含了表达该种表型的细胞的最高百分比，分别为0.0319％±0.0202％(n＝4,SEM＝0.0101)和0.0269％±0.0226％(n＝3,SEM＝0.0130)(图2)。尽管脐带包含了数量较少的表达目标表型的细胞(图2)，但其包含了表达目标表型的细胞的第三高百分比0.020±0.0226％(n＝3,SEM＝0.0131)(图2)。绒毛膜和羊膜-绒毛膜板包含了最低的表达目标表型的细胞百分比，分别为0.0184±0.0064％(n＝2,SEM＝0.0046)和0.0177±0.0173％(n＝3,SEM＝0.010)(图2)。
与BD FACSCalibur分析的结果一致，BD FACS Aria的数据同样证实了羊膜、灌注液和绒毛膜提供了比其它来源更高数量的HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺。羊膜、灌注液和绒毛膜中表达目标表型的细胞平 均总数分别为126.47±55.61个细胞(n＝15,SEM＝14.36)、81.65±34.64个细胞(n＝20,SEM＝7.75)以及51.47±32.41个细胞(n＝15,SEM＝8.37)(数据未显示)。羊膜-绒毛膜板和脐带包含了总数最少的表达目标表型的细胞，分别为44.89±37.43个细胞(n＝9,SEM＝12.48)和11.00±4.03个细胞(n＝9,SEM＝1.34)(数据未显示)。
BD FACS Aria数据显示B和A细胞来源包含了最高的HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺细胞百分比，分别为0.1523±0.0227％(n＝15,SEM＝0.0059)和0.0929±0.0419％(n＝20,SEM＝0.0094)(图3)。D细胞来源包含了第三高的表达目标表型的细胞百分比，0.0632±0.0333％(n＝9,SEM＝0.0111)(图3)。C和E细胞来源包含了最低的表达目标表型的细胞百分比，分别为0.0623±0.0249％(n＝15,SEM＝0.0064)和0.0457±0.0055％(n＝9,SEM＝0.0018)(图3)。
在对各细胞来源的HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺细胞进行鉴定和定量后，进一步对各细胞表面标记HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200和CD105的表达进行分析和表征。
6.2.2.3胎盘灌注液衍生细胞
灌注液衍生细胞对HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105和CD13呈一致的阳性(图4)。灌注液衍生细胞对各标记的平均表达如下：37.15％±38.55％(n＝4,SEM＝19.28)的细胞表达HLA-G；36.37％±21.98％(n＝7,SEM＝8.31)的细胞表达CD33；39.39％±39.91％(n＝4,SEM＝19.96)的细胞表达CD117；54.97％±33.08％(n＝4,SEM＝16.54)的细胞表达CD10；36.79％±11.42％(n＝4,SEM＝5.71)的细胞表达CD44；41.83％±19.42％(n＝3,SEM＝11.21)的细胞表达CD200；74.25％±26.74％(n＝3,SEM＝15.44)的细胞表达CD90；35.10％±23.10％(n＝3,SEM＝13.34)的细胞表达CD38；22.87％±6.87％(n＝3,SEM＝3.97)的细胞表达CD105；并且25.49％±9.84％(n＝3,SEM＝5.68)的细胞表达CD13。
6.2.2.4羊膜衍生细胞
羊膜衍生细胞对HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105和CD13呈一致的阳性(图5)。羊膜衍生细胞对各标记的平均表达如下：57.27％±41.11％(n＝3,SEM＝23.73)的细胞表达HLA-G；16.23％±15.81％(n＝6,SEM＝6.46)的细胞表达CD33；62.32％±37.89％(n＝3,SEM＝21.87)的细胞表达CD117；9.71％±13.73％(n＝3,SEM＝7.92)的细胞表达CD10；27.03％±22.65％(n＝3,SEM＝13.08)的细胞表达CD44；6.42％±0.88％(n＝2, SEM＝0.62)的细胞表达CD200；57.61％±22.10％(n＝2,SEM＝15.63)的细胞表达CD90；63.76％±4.40％(n＝2,SEM＝3.11)的细胞表达CD38；20.27％±5.88％(n＝2,SEM＝4.16)的细胞表达CD105；并且54.37％±13.29％(n＝2,SEM＝9.40)的细胞表达CD13。
6.2.2.5绒毛膜衍生细胞
绒毛膜衍生细胞对HLA-G、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38和CD13呈一致的阳性，而CD33和CD105的表达则变化(图6)。绒毛膜细胞对各标记的平均表达如下：53.25％±32.87％(n＝3,SEM＝18.98)的细胞表达HLA-G；15.44％±11.17％(n＝6,SEM＝4.56)的细胞表达CD33；70.76％±11.87％(n＝3,SEM＝6.86)的细胞表达CD117；35.84％±25.96％(n＝3,SEM＝14.99)的细胞表达CD10；28.76％±6.09％(n＝3,SEM＝3.52)的细胞表达CD44；29.20％±9.47％(n＝2,SEM＝6.70)的细胞表达CD200；54.88％±0.17％(n＝2,SEM＝0.12)的细胞表达CD90；68.63％±44.37％(n＝2,SEM＝31.37)的细胞表达CD38；23.81％±33.67％(n＝2,SEM＝23.81)的细胞表达CD105；并且53.16％±62.70％(n＝2,SEM＝44.34)的细胞表达CD13。
6.2.2.6羊膜-绒毛膜板胎盘细胞
来自羊膜-绒毛膜板的细胞对HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105和CD13呈一致的阳性(图7)。羊膜-绒毛膜板衍生细胞对各标记的平均表达如下：78.52％±13.13％(n＝2,SEM＝9.29)的细胞表达HLA-G；38.33％±15.74％(n＝5,SEM＝7.04)的细胞表达CD33；69.56％±26.41％(n＝2,SEM＝18.67)的细胞表达CD117；42.44％±53.12％(n＝2,SEM＝37.56)的细胞表达CD10；32.47％±31.78％(n＝2,SEM＝22.47)的细胞表达CD44；5.56％(n＝1)的细胞表达CD200；83.33％(n＝1)的细胞表达CD90；83.52％(n＝1)的细胞表达CD38；7.25％(n＝1)的细胞表达CD105；并且81.16％(n＝1)的细胞表达CD13。
6.2.2.7脐带衍生细胞
脐带衍生细胞对HLA-G、CD33、CD90、CD38、CD105和CD13呈一致的阳性，而CD117、CD10、CD44和CD200的表达则变化(图8)。脐带衍生细胞对各标记的平均表达如下：62.50％±53.03％(n＝2,SEM＝37.50)的细胞表达HLA-G；25.67％±11.28％(n＝5,SEM＝5.04)的细胞表达CD33；44.45％±62.85％(n＝2,SEM＝44.45)的细胞表达CD117；8.33％±11.79％(n＝2,SEM＝8.33)的细胞表达CD10；21.43％±30.30％(n＝2,SEM＝21.43)的细胞表达CD44；0.0％(n＝l) 的细胞表达CD200；81.25％(n＝1)的细胞表达CD90；64.29％(n＝1)的细胞表达CD38；6.25％(n＝1)的细胞表达CD105；并且50.0％(n＝1)的细胞表达CD13。
所有标记表达平均值的总结显示于图9。
6.2.2.8BD FACS Aria分选报告
对表达最高百分比的HLA ABC、CD45、CD34和CD133三种不同胎盘细胞群(来自于灌注液、羊膜和绒毛膜的细胞)用7AAD和针对这些标记的抗体进行染色。对三种群阳性分选表达目标表型的活细胞。BD FACS Aria分选的结果显示于表2。
表2：

将三个不同的阳性分选的细胞群(“分选的”)及其相应的未分选细胞铺盘并在第12天分析培养结果(表3)。以40,600/cm²的细胞密度铺盘的分选的灌注液衍生细胞得到微小圆形的非贴壁细胞。分别以40,600/cm²的细胞密度铺盘的三组未分选的灌注液衍生细胞中的两组得到几乎都是微小圆形的非贴壁细胞，在孔外周有几个贴壁细胞。以93,800/cm²的细胞密度铺盘的未分选的灌注液衍生细胞得到几乎都是微小圆形的非贴壁细胞，在孔外周有几个贴壁细胞。
以6,300/cm²的细胞密度铺盘的分选的羊膜衍生细胞得到微小圆形的非贴壁细胞。以6,300/cm²的细胞密度铺盘的未分选羊膜衍生细胞得到微小圆形的非贴壁细胞。以62,500/cm²的细胞密度铺盘的未分选羊膜衍生细胞得到微小圆形的非贴壁细胞。
以6,300/cm²的细胞密度铺盘的分选的绒毛膜衍生细胞得到微小圆形的非贴壁细胞。以6,300/cm²的细胞密度铺盘的未分选的绒毛膜衍生细胞得到微小圆形的非贴壁细胞。以62,500/cm²的细胞密度铺盘的未分选的绒毛膜衍生细胞得到微小圆形的非贴壁细胞。
6.3实施例3：胎盘干细胞的分化
贴壁胎盘干细胞分化成为多种不同的细胞系。通过物理破碎来自胎盘中 解剖部位(包括羊膜、绒毛膜、胎盘子叶或其任意组合)的组织从胎盘中分离得到贴壁胎盘干细胞，而脐带干细胞可通过物理破碎脐带组织获取。
在含低浓度胎牛血清和有限的生长因子的培养基中培养胎盘干细胞和脐带干细胞。流式细胞计数分析显示通常≥70％的胎盘干细胞具有CD200⁺CD105⁺CD73⁺CD34^-CD45^-表型。发现胎盘干细胞分化成脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞系。
在含有IBMX、胰岛素、地塞米松和茚甲新的诱导培养基中，胎盘干细胞在3至5周转化成满载脂肪的脂肪细胞。在成骨性细胞诱导培养条件下，发现胎盘干细胞形成骨小结并在其胞外基质中存在钙沉积。PDAC的成软骨性分化在微细胞球中进行并可通过组织聚集物中粘多糖的形成得到证实。
6.4实施例4：使用胎盘干细胞的免疫调节
胎盘干细胞具有免疫调节功能，包括对T细胞和自然杀伤细胞增殖的抑制。下列实验证明了胎盘干细胞在两个试验中具有调节T细胞的刺激应答的能力，两个试验为混合淋巴细胞反应试验和回归试验。
6.4.1混合淋巴细胞反应试验
MLR检测效应群对目标群的反应。该效应物可以是淋巴细胞或纯化的亚群，例如CD8⁺T细胞或NK细胞。该目标群可以是异体辐照PBMC，或是与本研究相同的成熟DC。应答群由约占总T细胞20％的同种异体特异性细胞组成。改良的胎盘干细胞MLR在该反应中使用胎盘干细胞。
将胎盘干细胞铺盘于96孔板的孔中，并添加效应群。在靶细胞-成熟DC添加前，将胎盘干细胞与5(6)-羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色的效应物预孵育24小时。六日后，收集上清液和非贴壁细胞。以Luminex珠分析对上清液进行分析，并以流式细胞计数法分析细胞。
经典地，MLR在CD8⁺和CD4⁺T细胞小室中均产生增殖应答。由于两种异体供体之前从未接触，该应答为初始T细胞应答。CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞均在标准MLR中大量增殖。当将胎盘干细胞加入MLR时，通过CFSE^Low应答细胞百分比所测得的CD4和CD8T细胞增殖被抑制。
向MLR添加胎盘干细胞(PMLR)的作用可参见图3A和3B(PMLR迹线)以及图4。不管是仅单独使用CD4⁺或CD8⁺T细胞，或是同时使用等量的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，均能得到类似的结果。从羊膜-绒毛膜或脐带基质获得的胎盘干细胞以相近的程度抑制MLR，在CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞之间没有观察到抑制上的差别。这对大批T细胞反应同样成立。
使用CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、或同时使用CD4⁺T细胞和CD8⁺T细 胞以及异体树突细胞(DC)进行单独MLR。将胎盘干细胞添加至MLR，以无胎盘干细胞的MLR作为对照，对T细胞的增殖程度进行评估。
使用Miltenyi MACS柱和珠，根据生产商说明，从白膜层中分离CD4⁺和CD8⁺T细胞以及CD14⁺单核细胞。通过将单核细胞在补充了1％供体血浆、IL-4和GM-CSF的RPMI1640中培养六日，以及在补充了IL-1β、TNF-α和IL-6的RPMI1640中培养两日获取树突细胞。以T:Dc为10:1的比例孵育异体T细胞和DC以形成经典的6日MLR。在添加至试验前，通过用CFSE(羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯)染色T细胞对T细胞增殖进行评估。通过检测染料在子细胞群中的稀释，可将CSFE用于评估增殖程度。
将胎盘干细胞(PSCs)以T:DC:PSC为10:1:2的比例添加至该试验。在96孔板上在终体积为200μL的补充了5％的汇集人血清(R5)的RPMI1640中进行反应。六日后，将非贴壁细胞简单重悬并转移至经RPMI洗涤的5mL管中，并以CD4和CD8抗体染色。可在BD FACS Calibur上对CD4和CD8小室的增殖评估。
胎盘干细胞。可如以上实施例1和2所述获取胎盘干细胞。可从下列胎盘组织中获取胎盘干细胞：羊膜(AM)、或羊膜/绒毛膜(AC)。从脐带(UC)的消化物中获取脐带干细胞。添加纤维原细胞(FB)和骨髓衍生间充质干细胞(MSC)作为对照。
结果。当向MLR添加胎盘干细胞时，T细胞增殖被抑制(图10)。图10所反映的实验中所用的胎盘干细胞来自一个胎盘，被称为61665。对于所有测试的胎盘干细胞，当使用CD4⁺和CD8⁺T细胞之一但不同时使用两种细胞时，CD4⁺小室的抑制程度大于CD8⁺小室的抑制程度(图10A)。AM和UC胎盘干细胞对CD4⁺活化的抑制与MSC介导的抑制大致相当，抑制率约为60％-75％。在同时使用CD4⁺和CD8⁺T细胞进行MLR时，胎盘干细胞抑制CD4⁺小室的增殖的程度远大于CD8⁺小室(图10B)。特别地，AM胎盘干细胞对CD4⁺T细胞增殖的抑制接近90％，超过了MSC所显示的抑制。这两种小室之间的抑制差异对AM和AC胎盘干细胞最为显著。
来自不同供体的胎盘干细胞在MLR中以不同的程度抑制T细胞增殖(图11)。来自不同胎盘(称为65450)的胎盘干细胞在MLR中对CD4⁺和CD8⁺T细胞的增殖不同于来自于胎盘61665的胎盘干细胞。令人注意的是，来自胎盘65450的AC和UC PSC抑制80％至95％的T细胞增殖，超过了MSC在该试验中的抑制。然而，来自胎盘65450的AC胎盘干细胞未能以可感知的程度抑制T细胞增殖(与图10A的AM胎盘干细胞抑制相比)。
胎盘干细胞在MLR中还抑制自然杀伤(NK)细胞的活性。
6.4.2回归试验
在回归试验中显示胎盘干细胞抑制T细胞对表达Epstein-Barr病毒(EBV)抗原的B细胞系的应答。回归试验是测量由EBV转化B细胞的MHC I类和II类分子的EBV抗原肽的递呈所带来的效应T细胞机制的回忆试验(recall assay)。该试验通过混合T细胞和人工生成的转化B细胞系、来自同一供体的淋巴母细胞样细胞系(LCL)得以进行。该LCL表达九种Epstein-Barr病毒抗原，这些抗原在彼此之间引起一系列自适应性T和B细胞应答，虽然在经典回归试验中仅对T细胞效应机制进行测量。该回归试验提供了对感染了天然存在病原体的靶标的细胞毒性的简单检测方法，其中LCL表达激活的B细胞标记CD23。因此，表达CD23的细胞的数量即是该试验中LCL存活数量的量度。
经典的17日回归试验产生的结果与图5中第一组柱的结果类似。由于所有的CD23⁺细胞均已被CD4⁺和CD8⁺T细胞杀死，未检测到CD23⁺细胞。随着胎盘干细胞的添加，在后两组柱中观察到CD23⁺细胞的存活有所增加。不期望受限于理论，对观察到的作用可给出两种解释。或是T细胞死亡，使得LCL可自由扩增，或是胎盘干细胞主要提高了LCL的寿命，对T细胞的作用相对较小。
在单独的回归试验中，T细胞和树突细胞可从实验室供体中获取。可通过将外周血单核细胞(PBMC)与来自细胞溶解EBV系的上清液、B95.8和环孢霉素A孵育两周获得Epstein-Barr病毒转化B细胞系，LCL。LCL表达9种EBV抗原。长出的LCL系保存在含10％胎牛血清的RPMI1640中。通过将CD4⁺或CD8⁺T细胞与自体同源LCL以T:LCL为10:1的比例混合以进行回归试验。该试验在96孔板上于补充了5％的汇集人血清(R5)的200μL的RPMI1640中进行。胎盘干细胞以T:LCL:PSC为10:1:2的比例添加至该试验。该试验将进行6、10或17日。
可采用CSFE标记的T细胞进行6日回归试验。来自胎盘65450的胎盘干细胞在回归试验中抑制约65％至约97％的T细胞增殖，该结果对应于PSC在MLR中的结果(图12)。另外，来自胎盘65450的UC和AC系显著抑制T细胞增殖，而65450AM PSC不抑制增殖。
在单独的试验中，确定自然杀伤细胞在MLR和回归试验中也被抑制。在包含了50U/ml IL-2的MLR或回归试验中，对NK细胞的抑制作用约为45％(从约40％至约65％，SEM5％)。
胎盘干细胞没有免疫原性。任何情况下，针对来自任何供体或任何胎盘解剖位点的胎盘干细胞所观察到的背景T细胞增殖不超过5％。
细胞-细胞接触的要求。回归试验中的细胞毒性作用，以及MLR中的异体-识别均依赖于靶标和效应细胞之间的TCR(T细胞受体):MHC相互作用。胎 盘干细胞介导抑制中的细胞-细胞接触的要求可通过transwell试验进行评估。在该试验中可进行MLR，其中T细胞和胎盘干细胞通过膜分隔。如图13所示，在MLR中的胎盘干细胞数量越高，抑制的减少越多，显示特别在更高的密度下，胎盘干细胞(UC)需要与T细胞显著的接触以抑制T细胞增殖。
单独的试验证实胎盘干细胞对T细胞的免疫抑制似乎至少部分涉及可溶性因子。为确定该胎盘干细胞介导的免疫抑制是否依赖于细胞-细胞接触，进行transwell试验，其中将胎盘干细胞置于一个嵌块中，其底部具有只允许可溶性因子通过的膜。在孔底部，仅有MLR或T细胞，与胎盘干细胞分隔。为测定可观察效应是否依赖于胎盘干细胞的相对剂量，以相对于T细胞和DC的不同相对密度添加干细胞。当脐带胎盘干细胞与MLR分隔时，该抑制性作用被部分消除。当以与图4中所用的密度相似的密度使用胎盘干细胞时，该MLR抑制对CD4⁺T细胞减少了75％，对CD8⁺T细胞减少了85％(图7，图8)。仅使用四分之一剂量的胎盘干细胞时(UC OP25)抑制性作用仍有66％，当添加12,500UC胎盘干细胞时该作用降至背景水平。当采用嵌块分离时未观察到抑制的变化(图7)。对于25,000胎盘干细胞，尽管仍然存在强烈的抑制作用，观察到由嵌块引入导致的抑制的最小相对下降(图8)。
6.5实施例5：胎盘干细胞免疫抑制的接触依赖性不同于骨髓衍生间充质干细胞
在检测免疫调节接触依赖性的程度的实验中，脐带干细胞显示了与骨髓衍生干细胞显著不同的对免疫调节细胞-细胞接触的要求。特别地，胎盘干细胞更多地依赖细胞-细胞接触以实现免疫调节，特别是在胎盘或间充质干细胞数量更多时。
根据混合淋巴细胞反应试验(MLR)中贴壁细胞与T细胞的比例，骨髓衍生干细胞(BMSC)和脐带干细胞(UC)对细胞-细胞接触具有不同的要求。在胎盘干细胞与T细胞和树突细胞(DC)在MLR中分隔的transwell试验中，两种类型的贴壁细胞之间的抑制有所不同。图15并排显示了开口孔和transwell的结果。在开口孔形式中使用约100,000或75,000UC或BMSC时，可观察到类似的抑制。然而，在transwell形式中，UC对MLR的抑制程度小于BMSC，显示在更高的胎盘干细胞/T细胞比例下具有更大的接触依赖性。当使用更低的胎盘细胞与T细胞的比例时，胎盘干细胞对细胞更具抑制性。
从该抑制数据计算接触依赖性的程度。图16显示了UC和BMSC MLR的接触依赖性。骨髓衍生细胞在更高的BM/T细胞比例下比UC具有更低的接触依赖性。换言之，UC胎盘干细胞和BMSC对于重要的机理参数，对细胞-细胞接触的要求，具有不同的表现。
调节性T细胞(Treg)在BMSC介导的T细胞抑制中必不可少。参见Aggarwal和Pittenger,“Human Mesenchymal Stem Cells Modulate Allogeneic Immune Cell Responses,”Blood105(4):1815-1822(2004)。从健康供体外周血单核细胞(PBMC)耗竭CD4⁺CD25⁺Treg，并使用自体同源EBV(Epstein-Barr病毒)转化的细胞进行回归试验。在某些情况下加入UC。如图17所示，不管是否存在Treg，回归试验中的胎盘干细胞介导的对T细胞应答的抑制没有区别。因此，尽管据报道T调节性T细胞对BMSC介导的T细胞抑制是必需的，T调节性细胞在胎盘干细胞介导的免疫抑制中未显示作用。
进行MLR，其中T细胞取自被胎盘干细胞抑制的MLR，并添加新鲜树突细胞。T细胞以CFSE染色，CFSE在增殖时平均分布至子代细胞。CFSE^Hi细胞为未增殖的T细胞(例如，图17中最左边的峰)。通过在FACS Aria上分选染色T细胞获取该群。这些细胞可用于具有新鲜树突细胞的次级MLR中。如图18所示，由于之前被抑制的细胞相对DC增殖良好，未观察到持续的抑制。CFSE^Lo细胞(即，子细胞)不太可能与抑制有关，因为这些细胞本身随后增殖。CFSE^Hi群由不会相对于该DC供体增殖的非异体特异性细胞以及被胎盘干细胞抑制的T细胞组成。一旦该胎盘干细胞被去除，抑制细胞便会增殖。
当大约10％的上清液被置换为来自BMSC MLR的上清液时MLR被BMSC抑制。在鲜明的对比中，当上清液被置换为来自MLR的包含胎盘干细胞的上清液时，甚至当75％的培养基被置换时，未观察到T细胞增殖的变化(图19)。
在MLR开始前与胎盘干细胞孵育不同的时间可能会影响DC或休眠T细胞。这个通过在开始该试验前将胎盘干细胞或BMSC与T细胞(图20A)或DC(图20B)孵育不同的时间长度进行测试。T细胞与胎盘干细胞预孵育未明显改变抑制性表型(图20A)。然而，BMSC T细胞抑制随DC/PDAC预孵育的时间长度而变化。如图20B所示，当DC在T细胞后一天添加时由BMSC产生的抑制最强。然而，当DC与T细胞同时添加时，可观察到低得多的抑制。将DC与BMSC孵育更长的时间可逆转该抑制的损失。在两日的预培养中，当DCs在T细胞一天后(+1天)添加时，该抑制接近预期。在胎盘干细胞介导的抑制中未观察到类似的趋势。
6.6实施例6：胎盘干细胞和脐带干细胞在MLR和回归试验中的细胞因子状况
测定脐带干细胞(UC)和来自羊膜绒毛膜板(AC)的胎盘干细胞向MLR培养基分泌某些细胞因子。
在一些试验中，使用细胞因子阵列测量上清液中细胞因子和趋化因子的 水平。据发现有多种因子被分泌进入上清液，与MLR和回归试验最为相关的是巨噬细胞炎症蛋白(MΙP)-1α和MIP-1β。这两种趋化蛋白均吸引T细胞，并通过CD8⁺T细胞响应人免疫缺陷病毒(HIV)感染而被分泌。在MLR中测定时，这些趋化蛋白的分泌与胎盘干细胞和MSC对MLR的抑制呈负相关(图14)。胎盘干细胞和MSC均不分泌MΙP-1α和MIP-1β。
在另一研究中，发现了MCP-1和IL-6的分泌的相关性，这两者均为重要的免疫调节剂(图9和图10；与图4比较)。尽管胎盘干细胞不单独分泌IL-6或MCP-1，在回归试验中抑制MLR和T细胞增殖(图4)的UC和AC系分泌IL-6或MCP-1(图9和图10)。尽管IL-6主要与促炎症作用相关(例如，参见Kishimoto等人，Annu.Rev.Immunol.23:1-21(2005))，它还具有其它功能，例如在小鼠肝损伤中的保护作用(例如，参见Klein等人，J.Clin.Invest.115:860-869(2005))。
在单独研究中，对MLR或回归试验中所用的AC进行细胞因子分泌的分析。可在Luminex系统上对来自6日干细胞培养物、干细胞MLR或干细胞回归试验的上清液中的细胞因子进行检测。MLR包括了比例为2/1/10的干细胞、树突细胞(DC)和T细胞。Epstein-Barr病毒(EBV)回归试验包括TS:干细胞:T比例为2:1:10的干细胞、EBV肿瘤细胞(T)和T细胞。
据发现在单独干细胞培养、MLR和回归试验中的IL-6(11ng/ml)和IL-8(16ng/ml)水平保持恒定。据检测在单独干细胞培养及非抑制性对照贴壁细胞MLR和回归试验中的MCP-1浓度约为2ng/ml，但在抑制性干细胞MLR和干细胞回归试验中上升至约10ng/ml。这些值属于MCP-1的血清水平。
白介素-2(IL-2)同时是T细胞存活因子和CD4⁺CD25⁺T调节性细胞的专性因子(obligate factor)。该T细胞子集不是AC干细胞对T细胞的抑制所必需的，但在AC干细胞抑制MLR的过程中IL-2水平持续降低。AC干细胞缺失的MLR上清液含约35pg/ml的IL-2，然而包含AC干细胞的MLR包含高达440pg/ml的IL-2。
IL-2浓度与抑制相关。例如，显示了85％抑制的CD4⁺T细胞MLR包含了330pg/ml IL-2，而显示了85％抑制的使用AC干细胞的CD8⁺T细胞MLR包含了66pg/ml IL-2。这些结果显示IL-2和MCP-1(传统上认为是免疫应答刺激剂)在免疫抑制中具有重要的作用。
等同物：
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