一种含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品.pdf

本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品。本发明提供一种含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品，其以肉苁蓉与蛤蟆油作为皮肤护理活性物。具体是利用现代工艺，将肉苁蓉提取物或发酵物进行超临界二氧化碳萃取，能够获得高含量的有效成分。本发明利用肉苁蓉与蛤蟆油配伍协同作用，将其作为皮肤护理活性物在化妆品中使用时，发挥了更加显著的抗衰老、抗氧化的作用，通过抑制弹性蛋白酶和/或刺激胶原产生而显著改善皮肤状况，具有卓越的抗衰老效果；采用本发明的工艺，可以充分发掘和利用肉苁蓉、蛤蟆油的功效，避免中药材及其有效成分的浪费。

1.一种含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品，其特征在于，以肉苁蓉与蛤蟆油作为皮肤护理活性物。 2.根据权利要求1所述的含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品，其特征在于，所述肉苁蓉经提取或发酵后，进行超临界二氧化碳萃取，获得的肉苁蓉萃取物与蛤蟆油混合，制备得到含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品。 3.根据权利要求1所述的含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品，其特征在于，所述含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品中含肉苁蓉或其萃取物1-98重量份，蛤蟆油2-99重量份，所述肉苁蓉或其萃取物的含量是在1-98％之间，所述蛤蟆油的含量是在2-99％之间。 4.根据权利要求1所述的含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品，其特征在于，所述化妆品选自乳膏、霜剂、凝胶、洗剂、喷雾制剂、乳液、混悬液或液体制剂中的一种。 5.根据权利要求1所述的含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品，其特征在于，所述含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品中还含有鱼肝油、维生素E和/或其它任意辅料。 6.根据权利要求1-5任意一项所述的含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品，其特征在于，所述肉苁蓉是指新鲜的肉苁蓉、干燥的肉苁蓉或经过各种炮制方法炮制的肉苁蓉饮片，所述肉苁蓉选自肉苁蓉、管花肉苁蓉、盐生肉苁蓉、沙苁蓉和/或草苁蓉。 7.根据权利要求1-5任意一项所述的含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品，其特征在于，所述提取是采用乙醇进行回流提取或超声加热提取，所述乙醇溶液浓度为20-70％，所述乙醇溶液与所述肉苁蓉的重量比为6-12∶1。 8.根据权利要求1-5任意一项所述的含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品，其特征在于，所述发酵是液体发酵方法或固体发酵，所述发酵菌种的添加量为发酵基质3-12％(w/w)，所述发酵中肉苁蓉原料的加入量为培养基的0.5-5％(w/v)，所述发酵温度为20-37℃，所述发酵时间为7-40天。 9.根据权利要求1-5任意一项所述的含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品，其特征在于，所述超临界二氧化碳萃取的压力是20-40MPa，温度为15-50℃，时间是0.5-5h，二氧化碳的流量为5-30L/h。 10.根据权利要求1-5任意一项所述的含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品，其特征在于，所述超临界二氧化碳萃取的夹带剂为乙醇。

技术领域

本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品。

背景技术

肉苁蓉载于《神农本草经》，列为上品，具有补肾阳、益精血、润肠通便等功效。《中国药典》收载的肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉和管花肉苁蓉干燥带鳞叶的肉质茎。肉苁蓉主要含有苯乙醇苷、环烯醚萜苷、木脂素及甾醇等化学成分，其中苯乙醇总苷是肉苁蓉中的主要活性成分，具有壮阳、抗氧化、抗衰老、提高免疫力、增强记忆力等多种功能。

蛤蟆油(Ranae Oviductus)为蛙科动物中国林蛙(Rana temporaria chensinensis David)雌蛙的输卵管，经采制干燥而得。蛤蟆油又称为林蛙油、田鸡油、哈什蟆油、哈蟆油、蛤蚂油、雪蛤油或雪蛤膏。墨龙江、吉林、辽宁为主要产地，其中以吉林为主。蛤蟆油味甘、咸，性平，具有补肾益精、健脾益胃、滋阴补肾、润肺生津等功效。蛤蟆油作为一种扶正固本药，对体弱气虚、精力耗损、记忆力不佳、神经衰弱等疗效较好，富有滋补“软黄金”的美誉，清代曾被列为皇室供品，也是我国东北特产、闻名中外的名贵食疗性中药。1996年高燕玲报道了蛤蟆油具有明显的抗疲劳作用；陈晓平也报道了蛤蟆油可调节人体内分泌，具有抗疲劳作用；另据1997年刘玉兰等报道，哈士蟆油可延长小鼠爬杆、滚棒及游泳时间，即对正常健康动物有一定的抗疲劳作用。

现有技术多将肉苁蓉、蛤蟆油、以及其他活性成分组合，用于不同的医药用途。例如CN201110123123公开了一种用于治疗肾炎的中药，其中除含有肉苁蓉、蛤蟆油之外，还有无名精、粪箕笃、红芪、白花蛇草、肉桂、一枝黄花等几十种中药材，该中药可以快速、有效地治疗各种急慢性肾炎。CN201210199964公开了一种补肾固元抗癌美颜的雪哈食品及其制备方法，采用雪哈配以灵芝、山药、人参、鹿茸、熟地、枸杞、茱萸、苁蓉、黑芝麻、香菇，营养更全面，更容易吸收，从而达到补肾固元抗癌美颜之功效。CN201510108792公开了一种具有消除运动性肢体疲劳功效的中药制剂，是由以下重量份的原料药制成的：黄芪30～40份，肉苁蓉30～40份，枸杞20～30份，益母草20～30份，怀牛膝20～30份，杜仲10～20份，山药10～20份，麦冬10～20份，徐长卿5～15份，蛤蟆油5～15份，甘草20～30份；具有抗疲劳的作用，可消除/缓解运动员的肢体疲劳，增强运动员的体能，使运动后的机体快速恢复体能，并能增加运动员心脏储备能力，适合运动员饮用。王高学(西北农林科技大学)发表的硕士论文及在《中成药》上发表的文章指出，蛤蟆油具有成分单一、功效不全等不足之处，遂以蛤蟆油为主要原料，按中医理论辅以其他多味中药，进行抗疲劳作用的筛选；虽然研究过程中考察了蛤蟆油单独配伍肉苁蓉的效果，但得到的效果欠佳，最终优选的蛤蟆油抗疲劳复方的配方为：蛤蟆油500mg，红景天220mg，肉苁蓉100mg，绞股 蓝80mg，人参200mg。在其他现有技术中，CN99113085公开了一种滋补保健颗粒冲剂，其是以蛤蟆油、肉苁蓉为原料，经粉碎成粉再制成颗粒状冲剂，并且提出二者相配伍，其作用可以互补，增强其滋补保健作用。

皮肤的胞外基质(ECM)在衰老过程中特别重要。ECM不仅提供了皮肤细胞附着和皮肤的正确定向需要的三维支架，而且ECM还作为对皮肤细胞的信号的传递管道发挥作用，所述信号刺激皮肤细胞实施关键功能，例如组织修复。当通过环境暴露或正常衰老过程而破坏ECM时，皮肤就发展了不想要的衰老外观，例如皱纹。用于降低皮肤内已存在的纤维状蛋白质的破坏，刺激产生更多的这类蛋白质是化妆品领域的期望。例如，人白细胞弹性蛋白酶是由活化的白细胞释放的丝氨酸蛋白酶，能够在暴露于UV光或其它刺激性刺激物下的皮肤中，引起多种ECM蛋白质组分的广泛破坏。因此，具有对该蛋白酶的抑制作用，从而保护ECM免受破坏的化妆品是有利的。

CN201510650282公开了将肉苁蓉，特别是肉苁蓉的提取物和/或肉苁蓉的生物酵素用于化妆品组合物来改善皮肤条件和/或提供抗衰老效果。

现有技术还未有将肉苁蓉与蛤蟆油配伍作为皮肤护理活性物在化妆品中使用的报道。

发明内容

研究发现，将肉苁蓉与蛤蟆油配伍作为皮肤护理活性物在化妆品中使用时，能协同发挥抗衰老、抗氧化的作用，通过抑制弹性蛋白酶和/或刺激胶原产生而显著改善皮肤状况，具有卓越的抗衰老效果。

本发明提供一种含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品，其以肉苁蓉与蛤蟆油作为皮肤护理活性物。

进一步地，本发明利用现代工艺，将肉苁蓉提取物或发酵物进行超临界二氧化碳萃取，能够获得高含量的有效成分。

进一步地，所述肉苁蓉经提取或发酵后，进行超临界二氧化碳萃取，获得的肉苁蓉萃取物与蛤蟆油混合，制备得到含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品。

进一步地，所述含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品中含肉苁蓉或其萃取物1-98重量份，蛤蟆油2-99重量份。

进一步地，所述含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品中活性成分应该是安全的和有效量的，而优选的肉苁蓉或其萃取物的含量是在1-98％之间，进一步优选5-85％，更进一步优选15-55％；或是1-98中任意整数的百分数。优选的蛤蟆油的含量是在2-99％之间，进一步优选5-85％，更进一步优选15-55％；或是2-99中任意整数的百分数。

进一步地，所述含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品选自乳膏、霜剂、凝胶、洗剂、喷雾制剂、乳液、混悬液或液体制剂等形式。

进一步地，所述含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品中还含有鱼肝油、维生素E和/或其它任意辅料。进一步地，所述辅料选自可以是任意一种或多种化妆品领域使用的添加剂。CTFA化妆品成分手册(CTFA Cosmetic Ingredient Handbook)描述了大量本领域技术人员常规使用的非限制性化妆品成分，它们适合在本发明的化妆品组合物中使用。这类成分类型的实例包括：研磨剂、乳化剂、吸收剂、胶凝剂、防泡剂、缓冲剂、着色剂、成膜材料、pH调节剂、湿润剂、增稠剂和色素。还认识到，基于意在通过组合物产生的想要的整体效果，本发明的化妆品组合物还可以使用其他的化妆品活性成分，例如：抗-痤疮活性物(例如：水杨酸或过氧化苯甲酰)，抗皱活性物(例如：类视黄醇或β-羟酸)，抗氧化剂(例如：抗坏血酸及其衍生物，或茶叶提取物)，螯合剂(例如：糠偶酰二肟)，抗炎剂(例如：皮质类固醇)，减肥剂(例如：咖啡因)，皮肤增光剂(例如：桑椹提取物或曲酸)，或防晒剂(例如：名为PARSOL的可商购产品)。

进一步地，所述含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品可以由本领域技术人员以常规方法处理，并适合化妆品用途。特别地，组合物优选适合用于有皱纹的、有线纹的、粗糙的、干燥的、易起屑的、衰老的和/或UV-损伤的皮肤，从而改善皮肤的外观和触感，以及用于健康的皮肤，从而预防或延缓皮肤的退化。

一般通过本领域已知的制备化妆品组合物的常规方法来制备本发明的含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品。此类方法一般涉及在一个或多个步骤中混合成分，成为相对均一的状态，其中有或没有加热、冷却、使用真空等。所述含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆品可以是任何常规的形态，例如乳膏、霜剂、凝胶、洗剂、喷雾制剂、乳液、混悬液或液体制剂。

进一步地，所述肉苁蓉是指新鲜的肉苁蓉、干燥的肉苁蓉或经过各种炮制方法炮制的肉苁蓉饮片，所述肉苁蓉选自肉苁蓉、管花肉苁蓉、盐生肉苁蓉、沙苁蓉和/或草苁蓉。其中新鲜的肉苁蓉在净选后切成适宜大小的片状、条状或粒状用于提取或发酵处理，或打磨成浆液用于提取或发酵处理。对于干燥肉苁蓉或肉苁蓉饮片可经浸泡后制备成适宜大小的片状、条状或粒状用于提取或发酵处理，或打磨成浆液用于提取或发酵处理，或不经浸泡直接磨成粉末进行提取或发酵处理。

进一步地，所述提取是采用乙醇进行回流提取或超声加热提取。进一步地，所述乙醇溶液浓度为20-70％。进一步地，所述乙醇溶液与所述肉苁蓉的重量比为6-12∶1；优选8-10∶1。

进一步地，所述提取包括以下步骤：肉苁蓉粉碎后过筛或打磨成浆液，使用乙醇溶液回流提取1-4h，过滤，滤渣再用乙醇溶液回流提取1-3次，合并提取液，离心后将上清液减压浓缩、烘干，即得肉苁蓉提取物。

进一步地，所述发酵是液体发酵方法或固体发酵。所述发酵菌种包括但不限于酵母菌、乳酸菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、双岐杆菌、米曲霉、蜜环菌、虫草菌、灵芝菌、朱红菌等一种或多种能够用于食物或药物发酵的菌种。作为优选，所述菌种的添加量为发酵基质3-12％ (w/w)，或5-10％(w/w)、或8％(w/w)。作为优选，所述发酵中肉苁蓉原料的加入量为培养基的0.5-5％(w/v)或0.5-5％(v/v)。

进一步地，所述发酵包括固体斜面培养、摇瓶培养和/或种子罐培养。所述发酵的培养基包括糖类、氮源和无机盐。更进一步地，所述糖类选自白糖、红糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、糖醇类、冰糖、蜂蜜中的一种或几种。作为优选，所述糖类的加入量为原料总重量的0-10％。所述氮源选自酵母粉、蛋白胨、黄豆粉、玉米浆、鱼粉、蛹粉、麦麸中的一种或几种。作为优选，所述氮源的加入量为原料总重量的0-12％。所述无机盐选自硫酸铵、氯化锰、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或几种。作为优选，所述无机盐的加入量为原料总重量的0-5％。

进一步地，所述固体斜面培养的培养基组成包括葡萄糖2-4％、蛋白胨2-3％、豆粉1-4％、琼脂3-8％、硫酸镁0.05-0.08％、磷酸二氢钾0.2-0.3％、氯化钠0.1-0.3％。进一步地，所述摇瓶培养的培养基包括葡萄糖2-4％，蛋白胨2-3％，豆粉1-4％，麸皮0.5-2％，硫酸镁0.01-0.1％，磷酸二氢钾0.1-0.4％、磷酸氢二钾0.1-0.2％。作为优选，所述摇瓶的转速为200转/min。进一步地，所述种子罐培养的培养基为牛肉膏1-2％、蛋白胨2-3％、玉米浆0.5-1％、磷酸二氢钾0.03-0.05％、硫酸锌0.02-0.07％、氯化镁0.04-0.08％，其余为水。

进一步地，所述发酵温度为20-37℃，所述发酵时间为7-40天。

进一步地，所述超临界二氧化碳萃取的压力是20-40MPa。更进一步地，所述压力为20-35MPa、或28-32MPa、或30MPa。

进一步地，所述超临界二氧化碳萃取的温度为15-50℃。更进一步地，所述温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、或45℃；或是20℃-50℃中的其他任意整数温度或非整数温度。

进一步地，所述超临界二氧化碳萃取的时间是0.5-5h。更进一步地，所述时间是1.5h、或2.0h、或2.5h、或3.0h、或3.5h、或4.0h、或4.5h。

进一步地，所述超临界二氧化碳萃取的二氧化碳的流量为5-30L/h。更进一步地，所述流量为10L/h、或15L/h、或20L/h、或25L/h。

进一步地，所述超临界二氧化碳萃取的夹带剂为乙醇。

技术术语的解释

除非另外指出，本文中使用的所有百分比和比例都是占总组合物的重量。除非另外指出，所有温度都是摄氏度。

本文中使用的术语“安全和有效量”是指足以诱导本文中描述的正向益处的化合物或组合物的量，但根据技术人员的判断低至足以避免严重的副作用。

本文中使用的，改善皮肤状况包括消除、最小化和/或预防皮肤的瑕疵，所述瑕疵可以视觉上或通过触觉检测到，例如不整(irregularity)，包括但不限于皱纹、不均匀或粗糙、丧失皮肤弹性、松垂、胶原分解、丧失从变型的皮肤回复力(rccoil)，和暗黄。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明利用肉苁蓉与蛤蟆油配伍协同作用，将其作为皮肤护理活性物在化妆品中使用时，发挥了更加显著的抗衰老、抗氧化的作用，通过抑制弹性蛋白酶和/或刺激胶原产生而显著改善皮肤状况，具有卓越的抗衰老效果；

(2)采用本发明的工艺，可以充分发掘和利用肉苁蓉、蛤蟆油的功效，避免中药材及其有效成分的浪费。

具体实施方式

以下所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照下述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1 肉苁蓉提取物

将新鲜的肉苁蓉在净选后打磨成浆液，添加10倍重量份的50％乙醇溶液，回流提取2h，过滤，滤渣再用60％乙醇溶液回流提取3次，合并提取液，离心后将上清液减压浓缩、烘干，即得肉苁蓉提取物。

实施例2 肉苁蓉发酵物

(1)取干燥的肉苁蓉切成薄片、粉碎，低温杀菌处理；

(2)制备发酵基质：在琼脂固体培养基中，加入步骤(1)所得的肉苁蓉原料，所述肉苁蓉原料的加入量为培养基的1％(w/w)；

(3)菌种植入并发酵：选择枯草芽孢杆菌为发酵菌种，经固体斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养后，植入所述发酵基质中进行发酵；所述固体斜面培养的培养基组成包括葡萄糖2％、蛋白胨2％、豆粉2％、琼脂5％、硫酸镁0.06％、磷酸二氢钾0.2％、氯化钠0.1％；所述摇瓶培养的培养基包括葡萄糖2％，蛋白胨2％，豆粉2％，麸皮1％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.3％、磷酸氢二钾0.1％；所述种子罐培养的培养基为牛肉膏1％、蛋白胨2％、玉米浆1％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸锌0.02％、氯化镁0.08％，其余 为水。所述枯草芽孢杆菌的植入量为发酵基质6％(w/w)。所述发酵是在通气条件下于28℃发酵21天，所通气体为无菌空气，通气量为5.0L/min。

(4)抽取发酵后的液体，经过滤后得到肉苁蓉发酵物。

实施例3 肉苁蓉超临界二氧化碳萃取物

取实施例1制备的肉苁蓉提取物或实施例2制备的肉苁蓉发酵物，干燥后经超临界二氧化碳萃取，以乙醇为夹带剂，萃取压力是30MPa，萃取温度为30℃，萃取时间是2h，二氧化碳的流量为15L/h，制得肉苁蓉超临界二氧化碳萃取物。

实施例4 含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆乳膏

成分 相 含量(w/w％) 实施例3肉苁蓉萃取物 A 12.5 蛤蟆油 A 8.5 硬脂酸 A 20.0 Myrj 59 A 5 Span 60 A 5 对羟基苯甲酸丙酯 A 0.5 BHT A 0.1 二甲聚硅氧烷 A 0.5 水 B *适量 EDTA B 0.2 对羟基苯甲酸甲酯 B 0.1

*适量＝加至100％

按照以下方式制备含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆乳膏：将所有A相成分混合加热至65℃；在另一容器中将所有B相成分混合加热到65℃；之后停止加热，搅拌下缓慢混合A、B两相；将所得混合物冷却至室温，然后包装即得。

实施例5 含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆霜

成分 相 含量(w/w％) 实施例3肉苁蓉萃取物 A 12.5 蛤蟆油 A 22 聚甘油-2二聚羟基硬脂酸酯 B 10 聚甘油-3二异硬脂酸酯 B 15 维生素E B 1 丙二醇 C 5 甘油 C 20 水 C *适量 EDTA C 0.2 对羟基苯甲酸甲酯 C 0.1

*适量＝加至100％

按照以下方式制备含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆霜：将所有B、C相分别加热至70℃；先将A相抽入乳化锅，再将B相慢慢抽入乳化锅，均质20分钟，恒温70℃搅拌30分钟；将A相加入乳化锅，搅拌均匀；将所得混合物冷却至室温，然后包装即得。

实施例6 含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆凝胶

成分 相 含量(w/w％) 实施例3肉苁蓉萃取物 A 10.5 蛤蟆油 B 32 EDTA二钠 A 0.5 丁二醇 A 3 鲸蜡醇 B 5 辛酸/癸酸甘油三酯 B 15 香料 B 0.1 丁化羟基甲苯 B 0.3 水 A *适量

*适量＝加至100％

按照以下方式制备含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆凝胶：将所有A、B相分别加热至60℃；之后60℃恒温搅拌下缓慢混合A、B两相；继续搅拌直至粘稠，将所得混合物冷却至室温，然后包装即得。

实施例7 含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆乳液

成分 含量(w/w％) 实施例3肉苁蓉萃取物 23 蛤蟆油 9.5 鱼肝油 5 EDTA二钠 0.5 PEG 400 10 丙二醇 5 矿物油 3 水 *适量

*适量＝加至100％

采用本领域的常规方式制备含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆乳液。

实施例8 含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆混悬液

成分 含量(w/w％) 肉苁蓉 8 蛤蟆油 5 维生素E 1 PEG 1500 5 透明质酸 2 Avicel 951 3 水 *适量

*适量＝加至100％

采用本领域的常规方式制备含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆混悬液。

对比例1 仅含有肉苁蓉的化妆乳膏

成分 相 含量(w/w％) 实施例3肉苁蓉萃取物 A 20 硬脂酸 A 20.0 Myrj 59 A 5 Span 60 A 5 对羟基苯甲酸丙酯 A 0.5 BHT A 0.1 二甲聚硅氧烷 A 0.5 水 B *适量 EDTA B 0.2 对羟基苯甲酸甲酯 B 0.1

*适量＝加至100％

制备方法同实施例4。

对比例2 仅含有肉苁蓉的化妆混悬液

成分 含量(w/w％) 肉苁蓉 15 维生素E 1 PEG 1500 5 透明质酸 2 Avicel 951 3 水 *适量

*适量＝加至100％

采用本领域的常规方式制备含有肉苁蓉蛤蟆油的化妆混悬液。

试验例1 抗氧化测试

利用ABTS总抗氧化能力测试(ABTS Total Antioxidant Capacity Test)检测实施例4、实施例8和对比例1-2，所述测试测量给定量的测试样品清除过量的ABTS(2，2′-连氮二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))自由基正离子的程度。在测试前，通过过滤(0.2μm孔径)和/或离心从样品中去除任何不溶性物质。在完成测试后，进行计算并以等价量的标准抗氧化剂Trolox(α-生育酚的水溶性类似物)来表示所述能力。该检测是确定测试样品的“总抗氧化能力”的标准方法。

通过将等分的测试物按不同浓度与含有固定量的ABTS0+的反应混合物混合，来实施检测。在20分钟反应期的结束时，通过测量ABTS0+在734nm的吸光值，确定剩余的未清除的ABTS0+。在每个检测中都包括了Trolox作为样品，作为为了以“Trolox当量”表示测试样品的抗氧化能力的标准。特别地，每种未知样品的抗氧化能力用与20μM Trolox等价的浓度(％v/v)表示。下表显示了各样品的Trolox等价。

样品 等价浓度(％v/v) 实施例4 1.04±0.05** 实施例8 1.21±0.04** 对比例1 1.98±0.07 对比例2 2.15±0.10

由上述结果可知，分别与对比例1-2相比，实施例4、8极显著提高了抗氧化活性(**P＜0.01)。

试验例2：抗衰老测试

弹性蛋白酶抑制和胶原产生的刺激。利用Whatman 1微米滤纸过滤样品，并利用0.8和0.2微米过滤进一步澄清。

测试中的阳性活性证实测试物的抗衰老活性，根据人白细胞弹性蛋白酶对显色肽底物的切割速率而实施测试，以每个样品的IC50值表示，其表示抑制人白细胞弹性蛋白酶达50％的测试样品的浓度，较低的IC50值表示具有更高的弹性蛋白酶抑制作用。

在多孔板中生长人真皮成纤维细胞，然后用不同的测试物干预刺激，在孵育3天后，通过ELISA测量分泌到生长培养基中的I型胶原的量，用相对于来自未刺激细胞的培养基中检测的百分比来表示每种测试条件下存在的胶原的量。

根据上述测试方法，滤出物的弹性蛋白酶抑制作用和胶原刺激作用如下两表。

样品 IC50值 实施例4 1.1±0.1** 实施例8 1.0±0.1** 对比例1 3.1±0.4 对比例2 2.8±0.6

由上述结果可知，分别与对比例1-2相比，实施例4、8极显著提高了抗衰老活性(**P＜0.01)，这体现在弹性蛋白酶的抑制活性和胶原刺激活性非常明显变化。