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1、10申请公布号CN104107211A43申请公布日20141022CN104107211A21申请号201410366504522申请日20140729A61K36/48120060171申请人黑龙江珍宝岛药业股份有限公司地址158400黑龙江省鸡西市虎林市红星街72号72发明人方同华徐秀杰王博董丽丽周广红范玉奇74专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君54发明名称黄芪总皂苷提取物的制备方法57摘要本发明提供一种改进的黄芪总皂苷提取物的制备方法，包括对黄芪的水提液进行两次醇沉一次水沉，再使用大孔树脂吸附三次，浓缩后即得黄芪总皂苷提取物。由于黄芪总皂苷含量较低，且药材含。
2、大量糖类物质，提取分离比较困难。本发明能够显著降低无效杂质含量，保留了药物的有效成分，极大地提高了样品纯度，进而提高了皂苷的提取率，本方法制得的黄芪总皂苷提取物中黄芪总皂苷含量高达98100，是一种有效的黄芪总皂苷的提取分离方法。51INTCL权利要求书2页说明书6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页10申请公布号CN104107211ACN104107211A1/2页21黄芪总皂苷提取物的制备方法，其特征在于，包括对黄芪的水提液进行两次醇沉一次水沉，再使用大孔树脂吸附三次，浓缩后即得黄芪总皂苷提取物。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤1。
3、用水煎煮提取黄芪药材,浓缩，得到黄芪水煎膏；2对步骤1得到的黄芪水煎膏进行一次醇沉，浓缩，得到黄芪总皂苷一次醇沉膏；3对步骤2得到的黄芪总皂苷一次醇沉膏进行二次醇沉，浓缩，得到黄芪总皂苷二次醇沉膏；4对步骤3得到的黄芪总皂苷二次醇沉膏进行水沉，浓缩，得到黄芪总皂苷水沉膏；5步骤4得到的黄芪总皂苷水沉膏经水稀释后经过大孔树脂进行一次吸附，收集洗脱液；6步骤5收集的洗脱液经过大孔树脂进行二次吸附，收集洗脱液；7步骤6收集的洗脱液经过大孔弱碱性阴离子树脂进行三次吸附，浓缩，得到黄芪总皂苷提取物。3根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤1提取用黄芪药材612倍重量的水煎煮提取黄芪药材23次。
4、，每次提取12小时，合并提取液，浓缩，得到黄芪水煎膏；2一次醇沉在搅拌条件下，向步骤1得到的黄芪水煎膏中加入浓度93以上的乙醇，使含醇量达745755，搅拌，静置12小时以上，过滤，收集滤液挥干乙醇至无醇味，并浓缩至在80测定相对密度为111120，得到黄芪总皂苷一次醇沉膏；3二次醇沉在搅拌条件下，向步骤2得到的醇沉膏中加入浓度93以上的乙醇，使含醇量达845855，搅拌15MIN，冷藏12小时以上，滤取上清液挥干乙醇至无醇味，并浓缩至在80测定相对密度为111120，得到黄芪总皂苷二次醇沉膏；4水沉在搅拌条件下，向步骤3得到的醇沉膏中加水稀释至1ML溶液中含醇沉膏0510G，搅拌15MIN，。
5、冷藏12小时以上，滤取上清液浓缩至在80测定相对密度为111120，得到黄芪总皂苷水沉膏；5大孔树脂一次吸附向黄芪总皂苷水沉膏中加水稀释至每1ML含水沉膏5G，药液经045M微孔滤膜过滤后，滤液以1BV/H速度通过大孔吸附树脂，上样量为树脂体积的8倍，经树脂吸附后用2倍树脂体积的水洗脱，洗脱流速为3BV/H，弃去洗脱液，再使用2倍树脂体积的30乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/H，弃去洗脱液，再用3倍树脂体积的50乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/H，收集洗脱液；6大孔树脂二次吸附将步骤5收集的洗脱液，以1BV/H速度过大孔吸附树脂，上样量为树脂体积的8倍，经树脂吸附后分别用2倍树脂体积的水和2倍树脂体积。
6、的30乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/H，弃去洗脱液，再用3倍树脂体积的50乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/H，收集洗脱液；7大孔弱碱性阴离子树脂三次吸附将步骤6收集的洗脱液直接以2535BV/H的流速过弱碱性阴离子树脂柱，待露出树脂面时，加入树脂等重量的浓度为85的乙醇以相同流速冲洗树脂柱，合并初流液和洗脱液，真空减压干燥后即得黄芪总皂苷提取物。4根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，使用的水为纯化水、蒸馏水或注射用权利要求书CN104107211A2/2页3水。5根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，利用大孔树脂进行一次吸附和二次吸附，使用的大孔树脂的型号为D101、ADSF8、ADS17。
7、、HPD750、HPD100、HPD450、AB8或DM130。6根据权利要求5所述的方法，其特征在于，大孔树脂进行一次吸附和二次吸附使用的大孔树脂的型号为D101。7根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，使用的大孔弱碱性阴离子树脂的型号为D900、D301R、D301G、D370、D371、D380或D382。8根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使用的大孔弱碱性阴离子树脂的型号为D900。权利要求书CN104107211A1/6页4黄芪总皂苷提取物的制备方法技术领域0001本发明涉及中药材提取物的制备方法，具体地说，涉及黄芪总皂苷提取物的制备方法。背景技术0002黄芪为豆科植物蒙古黄。
8、芪ASTRAGALUSMEMBRANACEUSFISCHBGEVARMONGHOLICUSBGEHSIAO或膜荚黄芪ASTRAGALUSMEMBRANACEUSFISCHBGE的干燥根。有益气固表、敛汗固脱、托疮生肌、利水消肿之功效。用于治疗气虚乏力，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，痈疽难溃，久溃不敛，血虚萎黄，内热消渴，慢性肾炎，蛋白尿，糖尿病等。炙黄芪益气补中，生用固表托疮。0003黄芪中的主要活性成分为以黄芪甲苷为代表的皂苷类及多糖。黄芪总皂苷的动物实验研究表明，能明显抑制中性粒细胞的增生和降低炎症关节局部的细胞因子，如白细胞介素1和一氧化氮的水平，减轻一氧化氮引起的软骨细胞凋亡。
9、等，而且毒性低，副作用小。0004近年来，已有较多关于黄芪总皂苷成分提取方法的研究，目标是提高黄芪总皂苷的含量，降低大分子等杂质的含量，以提高黄芪制剂的有效性及安全性。0005ZL021550026公开了黄芪总皂苷的制备方法，该方法包括步骤黄芪经水热回流提取2次以上，提取液过滤后直接上大孔吸附树脂柱，进行脱糖，脱色处理，再分离纯化得到黄芪总皂苷混合物。该方法将含大量杂质的提取液直接经由大孔吸附树脂柱分离纯化，造成去除杂质的同时有效成分损失也较大的缺点。0006ZL2006100142116公开了一种黄芪总皂苷的制备方法，该方法包括步骤取黄芪药材加入溶剂，将溶液调至碱性后再进行提取，得提取液；提。
10、取液上大孔型碱性阴离子交换柱，先用碱水和纯水冲洗，冲洗液弃去，再用含水乙醇洗脱，洗脱液浓缩，即得黄芪总皂苷。该方法仅经一次树脂纯化，存在杂质去除不彻底的缺点。0007CN102488742A公开了一种黄芪总皂苷的制备方法，该方法包括步骤黄芪煎煮13次，合并过滤；浓缩提取液，加入25倍量的80100的乙醇，过滤浓缩至清膏；将清膏放入大孔树脂柱中洗脱后，即得黄芪总皂苷。该方法存在只经一次醇沉一次树脂纯化，杂质去除不彻底的缺点。发明内容0008本发明的目的是提供一种改进的黄芪总皂苷提取物的制备方法。0009为了实现本发明目的，本发明的一种黄芪总皂苷提取物的制备方法，包括对黄芪的水提液进行两次醇沉一次。
11、水沉，再使用大孔树脂吸附三次，浓缩后即得黄芪总皂苷提取物。0010上述方法具体包括以下步骤00111用水煎煮提取黄芪药材,浓缩，得到黄芪水煎膏；00122对步骤1得到的黄芪水煎膏进行一次醇沉，浓缩，得到黄芪总皂苷一次醇沉说明书CN104107211A2/6页5膏；00133对步骤2得到的黄芪总皂苷一次醇沉膏进行二次醇沉，浓缩，得到黄芪总皂苷二次醇沉膏；00144对步骤3得到的黄芪总皂苷二次醇沉膏进行水沉，浓缩，得到黄芪总皂苷水沉膏；00155步骤4得到的黄芪总皂苷水沉膏经水稀释后经过大孔树脂进行一次吸附，收集洗脱液；00166步骤5收集的洗脱液经过大孔树脂进行二次吸附，收集洗脱液；00177步。
12、骤6收集的洗脱液经过大孔弱碱性阴离子树脂进行三次吸附，浓缩，得到黄芪总皂苷提取物。0018更具体地，上述方法包括以下步骤00191提取用黄芪药材612倍重量的水煎煮提取黄芪药材23次，每次提取12小时，合并提取液，浓缩，得到黄芪水煎膏；00202一次醇沉在搅拌条件下，向步骤1得到的黄芪水煎膏中加入浓度93以上的乙醇，使含醇量达745755，搅拌，静置12小时以上，过滤，收集滤液挥干乙醇至无醇味，并浓缩至在80测定相对密度为111120，得到黄芪总皂苷一次醇沉膏；00213二次醇沉在搅拌条件下，向步骤2得到的醇沉膏中加入浓度93以上的乙醇，使含醇量达845855，搅拌15MIN，冷藏12小时以上。
13、，滤取上清液剩余药渣离心后过滤取上清液，挥干乙醇至无醇味，并浓缩至在80测定相对密度为111120，得到黄芪总皂苷二次醇沉膏；00224水沉在搅拌条件下，向步骤3得到的醇沉膏中加水稀释至1ML溶液中含醇沉膏0510G，搅拌15MIN，冷藏12小时以上，滤取上清液剩余药渣离心后过滤取上清液，浓缩至在80测定相对密度为111120，得到黄芪总皂苷水沉膏；00235大孔树脂一次吸附向黄芪总皂苷水沉膏中加水稀释至每1ML含水沉膏5G，药液经045M微孔滤膜过滤后，滤液以1BV/H速度通过大孔吸附树脂，上样量为树脂体积的8倍，经树脂吸附后用2倍树脂体积的水洗脱，洗脱流速为3BV/H，弃去洗脱液，再使用2。
14、倍树脂体积的30乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/H，弃去洗脱液，再用3倍树脂体积的50乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/H，收集洗脱液；00246大孔树脂二次吸附将步骤5收集的洗脱液，以1BV/H速度过大孔吸附树脂，上样量为树脂体积的8倍，经树脂吸附后分别用2倍树脂体积的水和2倍树脂体积的30乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/H，弃去洗脱液，再用3倍树脂体积的50乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/H，收集洗脱液；00257大孔弱碱性阴离子树脂三次吸附将步骤6收集的洗脱液直接以2535BV/H的流速过弱碱性阴离子树脂柱，待露出树脂面时，加入树脂等重量的浓度为85的乙醇以相同流速冲洗树脂柱，合并初流液和洗脱液，真空减压。
15、干燥后即得黄芪总皂苷提取物。0026本发明中使用的水为纯化水、蒸馏水或注射用水。0027利用大孔树脂进行一次吸附和二次吸附，使用的大孔树脂的型号为D101、ADSF8、ADS17、HPD750、HPD100、HPD450、AB8或DM130等。说明书CN104107211A3/6页60028优选使用的大孔树脂的型号为D101。D101树脂是一种非极性吸附剂，比表面积480520M2/G，平均孔径0029本发明中使用的大孔弱碱性阴离子树脂的型号为D900、D301R、D301G、D370、D371、D380或D382等。0030优选使用的大孔弱碱性阴离子树脂的型号为D900。D900树脂是一种弱。
16、碱性阴离子交换树脂，交换容量MMOL/G干80，粒度0315125MM90。0031采用上述方法制备的黄芪总皂苷提取物中，黄芪总皂苷含量98100，黄芪甲苷含量7080。0032由于黄芪总皂苷含量较低，且药材含大量糖类物质，提取分离比较困难。本发明能够显著降低无效杂质含量，保留了药物的有效成分，极大地提高了样品纯度，进而提高了皂苷的提取率，是一种有效的黄芪总皂苷的提取分离方法。具体实施方式0033以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。0034若未特别指明，以下实施例中涉及的百分号“”为体积。
17、百分比；“倍量”是指重量倍数；水为纯化水、蒸馏水或注射用水。0035实施例1黄芪总皂苷提取物的制备方法0036包括如下步骤00371提取用黄芪药材12倍量的水煎煮提取黄芪药材3次，每次提取2小时，合并提取液，浓缩，得到黄芪水煎膏，备用；00382一次醇沉在搅拌条件下，向步骤1得到的黄芪水煎膏中加入浓度95的乙醇，使含醇量达75，充分搅拌，静置14小时，过滤，收集滤液挥干乙醇至无醇味并浓缩至在80测定相对密度为113，得到黄芪总皂苷一次醇沉膏，备用；00393二次醇沉在搅拌条件下，向步骤2得到的醇沉膏中加入浓度95的乙醇，使含醇量达85，搅拌15MIN，冷藏12小时，滤取上清液剩余药渣离心后过滤。
18、取上清液，收集滤液挥干乙醇至无醇味并浓缩至在80测定相对密度为114，收膏得黄芪总皂苷二次醇沉膏，备用；00404水沉在搅拌条件下，向步骤3得到的醇沉膏中加入注射用水稀释至1ML含醇沉膏约10G，搅拌15MIN，冷藏12小时，滤取上清液剩余药渣离心后过滤取上清液，滤液浓缩至在80测定相对密度为112，收膏得黄芪总皂苷水沉膏，备用；00415D101大孔树脂精制取步骤4得到黄芪总皂苷水沉膏，加入注射用水稀释至每1ML含水沉膏5G，药液经045M微孔滤膜过滤澄清后，滤液以1BV/H速度过D101大孔吸附树脂上柱液树脂81，体积比吸附，吸附后用2BV即2个柱体积纯化水洗脱，洗脱流速为3BV/H，弃去。
19、洗脱液，再使用2BV的30乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/H，弃去洗脱液，再用3BV的70乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/H，收集洗脱液。00426ADS7大孔树脂精制自D101树脂流出来的洗脱液，以1BV/H速度过ADS7大孔吸附树脂上柱液树脂81，体积比吸附，吸附后分别用2BV纯化水和2BV的30乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/H，弃去洗脱液，再用3BV的50乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/H，收说明书CN104107211A4/6页7集洗脱液。00437D900树脂脱色自ADS7树脂流出来的洗脱液直接以3BV/H的流速过生药量2/3的D900脱色树脂，待露出树脂面时，加入树脂1倍量的85的乙醇以相同流速。
20、冲洗树脂柱，合并初流液和洗脱液，真空减压干燥，得到黄芪总皂苷。0044经检测，本实施例中制备的黄芪总皂苷，HPLC法测定含黄芪甲苷80，紫外分光光度法测定含总皂苷100。0045实施例2黄芪总皂苷提取物的制备方法0046包括如下步骤00471提取用黄芪药材6倍量的水煎煮提取黄芪药材2次，每次提取1小时，合并提取液，浓缩，得到黄芪水煎膏，备用；00482一次醇沉在搅拌条件下，向步骤1得到的黄芪水煎膏中加入浓度93的乙醇，使含醇量达745，充分搅拌，静置12小时，过滤，收集滤液挥干乙醇至无醇味并浓缩至在80测定相对密度为111，得到黄芪总皂苷一次醇沉膏，备用；00493二次醇沉在搅拌条件下，向步骤。
21、2得到的醇沉膏中加入浓度93的乙醇，使含醇量达845，搅拌15MIN，冷藏12小时，滤取上清液剩余药渣离心后过滤取上清液，收集滤液挥干乙醇至无醇味并浓缩至在80测定相对密度为112，收膏得黄芪总皂苷二次醇沉膏，备用；00504水沉在搅拌条件下，向步骤3得到的醇沉膏中加入注射用水稀释至1ML含醇沉膏约05，搅拌15MIN，冷藏12小时，滤取上清液剩余药渣离心后过滤取上清液，滤液浓缩至在80测定相对密度为111，收膏得黄芪总皂苷水沉膏，备用；00515D101大孔树脂精制取黄芪总皂苷水沉膏适量，加入注射用水稀释至每1ML含水沉膏5G，药液经045M微孔滤膜过滤澄清后，滤液以1BV/H速度过D101。
22、大孔吸附树脂上柱液树脂101吸附，吸附后用2BV纯化水洗脱，洗脱流速为3BV/H，弃去洗脱液，再使用1BV的30乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/H，弃去洗脱液，再用2BV的70乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/H，收集洗脱液。00526ADS7大孔树脂精制自D101树脂流出来的洗脱液，以1BV/H速度过ADS7大孔吸附树脂上柱液树脂101吸附，吸附后分别用2BV纯化水和2BV的30乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/H，弃去洗脱液，再用2BV的50乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/H，收集洗脱液。00537D900树脂脱色自ADS7树脂流出来的洗脱液直接以35BV/H的流速过生药量2/3的D900脱色树脂，待露出树脂。
23、面时，加入树脂1倍量的85的乙醇以相同流速冲洗树脂柱，合并初流液和洗脱液，真空减压干燥，得到黄芪总皂苷。0054经检测，本实施例中制备的黄芪总皂苷，HPLC法测定含黄芪甲苷74，紫外分光光度法测定含总皂苷98。0055实施例3黄芪总皂苷提取物的制备方法0056包括如下步骤00571提取用黄芪药材10倍量的水煎煮提取黄芪药材3次，每次提取15小时，合并提取液，浓缩，得到黄芪水煎膏，备用；00582一次醇沉在搅拌条件下，向步骤1得到的黄芪水煎膏中加入浓度95的乙说明书CN104107211A5/6页8醇，使含醇量达745，充分搅拌，静置16小时，过滤，收集滤液挥干乙醇至无醇味并浓缩至在80测定相对。
24、密度为114，得到黄芪总皂苷一次醇沉膏，备用；00593二次醇沉在搅拌条件下，向步骤2得到的醇沉膏中加入浓度95的乙醇，使含醇量达855，搅拌16MIN，冷藏13小时，滤取上清液剩余药渣离心后过滤取上清液，收集滤液挥干乙醇至无醇味并浓缩至在80测定相对密度为112，收膏得黄芪总皂苷二次醇沉膏，备用；00604水沉在搅拌条件下，向步骤3得到的醇沉膏中加入注射用水稀释至1ML含醇沉膏约08G，搅拌15MIN，冷藏14小时，滤取上清液剩余药渣离心后过滤取上清液，滤液浓缩至在80测定相对密度为115，收膏得黄芪总皂苷水沉膏，备用；00615大孔树脂吸附取黄芪总皂苷水沉膏适量，加入注射用水稀释至每1ML。
25、含水沉膏4G，药液经045M微孔滤膜过滤澄清后，滤液以1BV/H速度过大孔吸附树脂上柱液树脂81，体积比吸附，吸附后用2BV纯化水洗脱，洗脱流速为3BV/H，弃去洗脱液，再使用2BV的30乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/H，弃去洗脱液，再用4BV的50乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/H，收集洗脱液。00626大孔树脂精制自步骤5树脂流出来的洗脱液，以1BV/H速度过大孔吸附树脂上柱液树脂81，体积比吸附，吸附后分别用2BV纯化水和2BV的30乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/H，弃去洗脱液，再用4BV的50乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/H，收集洗脱液。00637阴离子树脂脱色自步骤6树脂流出来的洗脱液直接以2。
26、5BV/H的流速过生药量2/3的阴离子脱色树脂，待露出树脂面时，加入树脂2倍量的85的乙醇以相同流速冲洗树脂柱，合并初流液和洗脱液，真空减压干燥，得到黄芪总皂苷。0064经检测，本实施例中制备的黄芪总皂苷，HPLC法测定含黄芪甲苷77，紫外分光光度法测定含总皂苷99。0065对比例1参照ZL2006100142116实施例2中公开的方法制备黄芪总皂苷提取物。0066对比例2参照CN102488742A实施例2中公开的方法制备黄芪总皂苷提取物。0067表1本发明实施例13与对比例12的黄芪总皂苷提取物成分分析比较0068黄芪甲苷黄芪总皂苷实施例180100实施例27498实施例37799对比例17085对比例262860069以上实验结果表明，本发明能够显著降低无效杂质含量，保留了药物的有效成分，极大地提高了样品纯度，本方法制得的黄芪总皂苷提取物中黄芪总皂苷含量高达98说明书CN104107211A6/6页9100，是一种有效的黄芪总皂苷的提取分离方法。0070虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。说明书CN104107211A。