LINC01094在诊治缺血性脑卒中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611053234.8 (22)申请日 2016.11.24 (71)申请人 汕头大学医学院第一附属医院 地址 515041 广东省汕头市长平路57号 (72)发明人 何文贞 陈思洽 徐声亮 蔡德 (74)专利代理机构 北京中誉威圣知识产权代理 有限公司 11279 代理人 孟祥斌 李红伟 (51)Int.Cl. A61K 45/00(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) A61P 9/10(2006.01) (54)发明名称 LINC01094在诊治缺血。

2、性脑卒中的应用 (57)摘要 本发明涉及LINC01094在诊治缺血性脑卒中 的应用。 发明通过采集缺血性脑卒中和健康人群 外周血进行高通量测序， 运用生物信息学工具分 析， 初步筛选到在脑卒中组差异表达的mRNA和 1ncRNA， 并挑选部分候选基因进行大样本验证和 初步干扰实验。 本发明所提供的LINC01094为临 床早期缺血性脑卒中分子检测奠定基础。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图2页 CN 107029238 A 2017.08.11 CN 107029238 A 1.调控LINC01094表达的制剂在制备防治缺血性脑卒中试剂中的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 。

3、其特征在于， 防治缺血性脑卒中试剂包括下调 LINC01094的转录， 或抑制LINC01094活性的试剂， 优选的， 通过siRNA、 shRNA、 反义核酸等方 法下调LINC01094的转录和/或阻断LINC01094的活性。 3.一种检测LINC01094表达的制剂在制备诊断缺血性脑卒中试剂中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 诊断缺血性脑卒中试剂包括基于高通量测 序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测缺血性脑卒中样本中 LINC01094转录或基于免疫检测方法检测缺血性脑卒中样本中LINC01094调控的基因的表 达情况。 5.根据权利要求3所述。

4、的应用， 其特征在于， 缺血性脑卒中样本为外周血。 6.一种防治缺血性脑卒中的试剂， 所述试剂调控与LINC01094表达相关的基因的表达。 7.根据权利要求6所述的试剂， 其特征在于， 防治缺血性脑卒中试剂包括下调与 LINC01094表达正相关的基因的转录， 或上调与LINC01094表达负相关的基因的转录。 8.根据权利要求7所述的试剂， 其特征在于， 所述正相关的基因为TESC、 JAZF1、 NEDD4L、 EIF3B、 ANP32B、 RAD23A、 STRADB、 BCKDK、 CCNY、 ASCC2、 UTS2或/和MMP17； 所述负相关的基因为 KIAA1324L、 MIS。

5、18A、 C1QTNF6、 MTERF2、 MAP6D1、 ZNF530、 DNAH1、 CRACR2A、 TTC22和/或MIB2。 9.一种诊断缺血性脑卒中生物制剂， 所述生物制剂检测与LINC01094表达相关的基因。 10.权利要求6-8任意一项所述的试剂、 权利要求9所述的生物制剂在制备诊治缺血性 脑卒中工具中的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107029238 A 2 LINC01094在诊治缺血性脑卒中的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医药技术领域， 具体涉及缺血性脑卒中的分子生物标志物， 更具 体的涉及LINC01094及其相关基因在诊治缺血性脑卒中的。

6、应用。 背景技术 0002 长链非编码RNA(long non-coding RNA， lncRNA)是一类转录本长度超过200个核 苷酸的非编码RNA， 根据其基因位置可分为五种类型： 正义lncRNA(sense lncRNA)、 反义 lncRNA(antisense lncRNA)、 双向lncRNA(bidirectional lncRNA)、 基因内lncRNA (intronic lncRNA)及基因间lncRNA(intergenic lncRNA)。 未来， lncRNA有望成为肿瘤诊 断、 治疗和预后新的标志物， 同时也为肿瘤的治疗提供了新的靶点。 但是脑卒中后1ncRNA。

7、s 的表达变化如何， 1ncRNAs是否参与脑卒中的病程调控， 目前尚不清楚。 0003 脑卒中是一种严重危害人类健康和生命安全的脑血管疾病， 具有发病率高、 致残 率高和死亡率高等特点， 数据显示， 我国每年新发脑卒中患者约200万人， 其中70-80的 脑卒中患者因为残疾不能独立生活， 给家庭带来巨大的生活压力和精神压力， 全国每年用 于该病的治疗费用高达100亿元之多， 给国家造成了沉重的经济负担。 探求脑卒中的发病机 制及有效提前预防和治疗方法的研究愈显重要。 由血栓形成或栓子脱落导致的大脑主干血 管或其分支血管阻塞而引起的缺血性脑卒中约占全部脑卒中的80左右。 寻找到有效的分 子调控。

8、靶点， 通过血液检测早期诊断缺血性脑卒中会使患者获益良多， 用血液标志早期诊 断缺血性脑卒中将有望成为一个具有实际应用价值的辅助诊断方法。 0004 本发明通过高通量测序检测脑卒中和正常对照人群中mRNA和1ncRNAs的表达谱变 化， 运用生物信息学工具分析在脑卒中组差异表达的mRNA和1ncRNAs， 筛选出候选基因 LINC01094， 继而采用RT-PCR实验进行大样本验证和相关性分析以及初步的干扰实验， 结果 表明本发明挑选的LINC01094与缺血性脑卒中密切相关， 为临床早期缺血性脑卒中分子检 测奠定基础。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种防治脑卒中的试剂， 所述试剂。

9、包含： 0006 (a)抑制剂和/或抑制剂组合物， 所述抑制剂和/或抑制剂组合物下调LINC01094的 转录和/或阻断LINC01094的活性； 0007 (b)药剂学上能接受的载体。 0008 进一步的， 所述脑卒中为缺血性脑卒中。 0009 优选的， 通过siRNA、 shRNA、 反义核酸等方法下调LINC01094的转录和/或阻断 LINC01094的活性。 0010 优选的， 所用siRNA靶序列为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11。 0011 优选的， 所用siRNA序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10； 或SEQ ID NO.12和SEQ ID 。

10、NO.13。 说 明 书 1/8 页 3 CN 107029238 A 3 0012 本发明的目的在于提供调控LINC01094表达的制剂在制备防治脑卒中试剂中的应 用。 0013 进一步， 防治脑卒中试剂包括下调LINC01094的转录， 或抑制LINC01094活性的试 剂。 0014 本发明的目的在于提供一种脑卒中诊断制剂， 该试剂检测LINC01094表达。 0015 进一步， 脑卒中诊断制剂能够检测脑卒中样本中LINC01094的转录或免疫检测方 法检测脑卒中样本中LINC01094调控的基因的表达情况。 0016 进一步的， 所述脑卒中为缺血性脑卒中。 0017 优选的， 缺血性脑。

11、卒中样本为外周血。 0018 进一步， 诊断缺血性脑卒中试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法 和/或基于探针杂交方法检测缺血性脑卒中样本中LINC01094转录或基于免疫检测方法检 测缺血性脑卒中样本中LINC01094调控的基因的表达情况。 0019 优选的， 基于定量PCR方法包括特异性扩增LINC01094的引物， 进一步优选， 特异性 扩增LINC01094的引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2； 基于探针杂交方法包括与 LINC01094的核酸序列杂交的探针； 免疫检测方法包括与LINC01094调控基因表达蛋白特异 性结合的抗体。 0020 本发明。

12、的目的在于提供上述脑卒中诊断制剂在制备脑卒中检测工具中的应用。 0021 本领域人员熟知， 本发明提供的lncRNA序列既可通过生物学方法获得， 又可通过 化学合成方法获得， 若通过化学合成方法制备， 只要将其核苷酸序列提供给有关专业公司， 委托其合成即可。 lncRNA还可含有另外的或可替换的碱基修饰体或取代体， 如硫代修饰或/ 和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。 与其90以上同源的核苷酸序列也在本发明保护范围之 内。 0022 本发明的目的在于提供一种诊断脑卒中生物制剂， 该生物制剂检测与LINC01094 表达相关的基因。 0023 所述与LINC01094表达相关的基因包括正相关基因和负相。

13、关基因。 所述正相关基 因为表达趋势与LOC105372881表达一致的基因， 所述负相关基因为表达趋势与 LOC105372881表达相反的基因。 0024 进一步， 正相关的基因为TESC、 JAZF1、 NEDD4L、 EIF3B、 ANP32B、 RAD23A、 STRADB、 BCKDK、 CCNY、 ASCC2、 UTS2或/和MMP17。 0025 进一步， 负相关的基因为KIAA1324L、 MIS18A、 C1QTNF6、 MTERF2、 MAP6D1、 ZNF530、 DNAH1、 CRACR2A、 TTC22和/或MIB2。 0026 优选的， 与LINC01094表达相。

14、关的基因为JAZF1。 0027 进一步， 脑卒中为缺血性脑卒中。 0028 进一步， 诊断缺血性脑卒中生物制剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR 方法和/或基于探针杂交方法检测缺血性脑卒中样本中与LINC01094表达相关的基因转录 或基于免疫检测方法检测缺血性脑卒中样本中与LINC01094表达相关的基因的表达情况。 0029 优选的， 缺血性脑卒中样本为外周血。 0030 优选的， 基于定量PCR方法包括特异性扩增与LINC01094表达相关的基因的引物， 进一步优选， 特异性扩增JAZF1基因的引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4； 基于探针杂 说 明 书 。

15、2/8 页 4 CN 107029238 A 4 交方法包括与JAZF1核酸序列杂交的探针； 免疫检测方法包括与JAZF1基因表达蛋白特异性 结合的抗体。 0031 本发明的目的在于提供上述生物制剂在制备诊断脑卒中工具中的应用。 0032 本发明的目的在于提供一种防治脑卒中的试剂， 该试剂调控与LINC01094表达相 关的基因的表达。 0033 进一步， 脑卒中为缺血性脑卒中。 0034 进一步， 防治脑卒中试剂包括下调与LINC01094表达正相关的基因的转录， 或上调 与LINC01094表达负相关的基因的转录。 0035 优选的， 通过siRNA、 shRNA、 反义核酸等方法下调与L。

16、INC01094表达正相关的基因 的转录或通过构建过表达载体等方法上调与LINC01094表达负相关的基因的转录。 0036 本发明的目的在于提供上述防治脑卒中的试剂在制备脑卒中治疗药物中的应用。 0037 定义： 0038 在此所用的 “同源的” 是指两个聚合分子之间(例如， 两个核酸分子如两个DNA分子 之间)的亚单元序列相似性。 当两个分子中的亚单元位置都被相同的单体亚单元所占据(例 如， 如果两个DNA分子的一个位置都被腺嘌呤所占据)， 则它们在那个位置上是同源的。 两个 序列之间的同源性是相配的或同源的位置的数量的直接函数。 例如， 两个化合物序列的10 个位置中的5个是相配的或同源。

17、的， 则两个序列是50同源的， 如果10个位置中的9个是相 配的或同源的， 则两个序列是90同源的。 0039 “诊断” 表示对病理状况的存在或特性进行检测。 诊断方法在敏感度和特异性上是 有区别的。 诊断方法的 “灵敏度” 是指被检测为阳性的患病个体的百分比( “真阳性” 的百分 比)。 方法未检测到的患病个体是 “假阴性” 。 在所述方法中， 未患病的且被检测为阴性的受 试者被称为 “真阴性” 。 诊断方法中的 “特异性” 为1减去假阳性率的差值， 其中 “假阳性” 率被 定义为： 无病却并检测为阳性的个体比例。 虽然某一特定诊断方法不能够为一种病状提供 权威性的诊断， 但它足以提供作为辅。

18、助诊断的阳性指示方法。 0040 现阶段检测lncRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、 基于核苷酸 杂交和基于PCR的lncRNA检测方法。 基于探针杂交技术的lncRNA检测方法是一种直接检测 法， 不需要对样本RNA进行预扩增。 0041 实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR， RT-PCR) 0042 荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。 在反 应混合体系中靶序列的起始浓度越大， 要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数(一般用 特定阈值循环数Ct来表达)越少。 qRT-PCR具有特异性高、 灵敏度好、 快速简单等多种优点。。

19、 0043 高通量测序(High-throughput sequencing)又称下一代测序技术(next generation sequencing)是对传统测序一次革命性的改变， 一次对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定， 极大提高了测序效率。 这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗 传信息的解读速度， 为获取所有lncRNA的序列信息， 解密lncRNA图谱提供了保证。 同时高通 量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能， 所以又被称为深 度测序(deep sequencing)。 高通量测序平台的代表是罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roch GSF。

20、LX sequencer)， Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和 ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。 说 明 书 3/8 页 5 CN 107029238 A 5 0044 包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载 体， 该载体包含乳糖(lactose)、 右旋糖(dextrose)、 蔗糖(sucrose)、 山梨醇(sorbitol)、 甘 露醇(mannitol)、 淀粉、 阿拉伯橡胶、 磷酸钙、 藻酸盐(alginate)、 凝胶(gelatin)、 硅酸钙、。

21、 微晶纤维素、 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、 纤维素(cellulose)、 水、 糖浆、 甲 基纤维素(methyl cellulose)、 羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、 丙基羟基苯 甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、 滑石、 硬脂酸镁(stearic acid magnesium)及矿物 油(mineral oil)等， 但并非局限于此。 0045 本发明的药剂学组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、 湿润剂、 甜味剂、 香 味剂、 乳化剂、 悬浮剂、 防腐剂等。 药剂学上许可的适合的载体和制剂详。

22、细记载于雷明登氏 药学全书。 0046 本发明的药剂学组合物能通过口服或非口服进行给药， 作为非口服给药时， 能通 过静脉内注射， 鼻腔内注射， 局部注射， 脑室内注射， 脊髓腔注射， 皮下注射， 腹腔注射， 经皮 给药等方式进行给药。 0047 本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、 给药方式、 患者的年 龄、 体重、 性别、 病态、 食物、 给药时间、 给药途径、 排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以 进行多种处方， 通常， 熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给 药剂量。 0048 本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施 的。

23、方法， 利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化， 从而能够以单位用量形态 制备或者内装在多容量容器内来制备。 此时， 剂型是油性或者水性介质中的溶液、 悬浮液或 乳化液形态， 或者也可以是浸膏剂、 粉末剂、 颗粒剂、 片剂或者胶囊剂形态， 还可以包括分散 剂或者稳定剂。 附图说明 0049 图1是LINC01094在脑卒中组和健康对照组相对表达情况图 0050 图2是JAZF1在脑卒中组和健康对照组相对表达情况图 0051 图3是转染后各组LINC01094相对表达情况图 具体实施方式 0052 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明， 仅用于解释本发明， 而不能理解为对本 发明的限。

24、制。 本领域的普通技术人员可以理解： 在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、 修改、 替换和变型， 本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。 0053 实施例1高通量测序及分析 0054 lncRNA是一类长度大于200nt的非编码RNA， 测序实验采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit方法进行链特异文库构建， 包括： 0055 提取总RNA。 从组织样品中提取total RNA， 利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和 纯度。

25、进行检测， 琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性， Agilent2100测定RIN值。 单次建库要求RNA 说 明 书 4/8 页 6 CN 107029238 A 6 总量5ug,浓度200ng/ L,OD260/280介于1.82.2之间。 0056 去除rRNA。 细胞内一部分(24)的长链非编码RNA都是缺少传统pol y A尾的， 因 此采用去除rRNA的方式建库可以获得更加全面的lncRNA信息 0057 片段化mRNA。 利用金属离子， 可以将mRNA随机断裂成200bp左右的小片段。 0058 反转合成cDNA。 在逆转录酶的作用下， 利用随机引物， 以mRNA为模板反转合成一链 。

26、cDNA， 进行二链合成时， dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP， 使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。 0059 连接adaptor。 链的cDNA结构为粘性末端， 加入End Repair Mix将其补成平末端， 随后在3 末端加上一个A碱基， 用于连接Y字形的接头。 0060 UNG酶消化cDNA二链。 在PCR扩增前， 用UNG酶将cDNA第二链消化， 从而使文库中仅 包含cDNA第一链。 0061 Illumina Hiseq4000上机测序。 0062 由于原始测序数据中会包含测序接头序列、 低质量读段、 N率较高序列及长度过短 序列， 这将严重影响后续组装的质量。 为保。

27、证后续的生物信息分析的准确性， 首先对原始测 序数据进行过滤， 从而得到高质量的测序数据(clean data)以保证后续分析的顺利进行。 0063 进一步， 将质控后得到的高质量测序序列与指定的参考基因组比对， 参考基因组 版本是GRCh38。 首先， TopHat使用其内置软件Bowtie将高质量clean序列map到基因组上， 这 时所有参加mapping的序列将被分为两组： 一组为已map到基因组上， 另一组为没有map到基 因组上。 之后， TopHat将这些map到基因组上的序列进行组装， 这时就可以认为这些连续的 序列即为一组外显子。 同时， TopHat会检测到没有map到基因。

28、组上的序列map至剪切位点的 两端。 通常TopHat所检测的一对外显子之间的距离为70bp20kb之间的距离。 如果小于 70bp的话， tophat会认为这两个外显子可能属于同一个外显子， 由于基因的表达量比较低， 中间的部分没有测到， 因而形成了一个GAP。 通常采用默认参数运行软件， 同时根据实际情 况， 如测序数据量， 基因组情况对参数做适当的调整。 0064 最后， 使用软件cuffquant和cuffnorm用来进行表达量评估和标准化。 Cuffdiff利 用Tophat比对的结果， 调用Cufflinks计算每个基因/转录本的表达量。 通常采用默认参数 运行软件， 同时根据实际。

29、情况， 如测序数据量， 基因组情况对参数做适当的调整。 显著差异 lncRNA&mRNA筛选条件： q-value6时， 使用Pearson相关系数法分析样本间lncRNA与蛋白编码基因的相关性； 采用 Pearson相关系数法分析样本间lncRNA与蛋白编码基因的相关性， 阈值使用0.9。 0065 结果： LINC01094在缺血性脑卒中组中上调表达显著， TESC、 JAZF1、 NEDD4L、 EIF3B、 ANP32B、 RAD23A、 STRADB、 BCKDK、 CCNY、 ASCC2、 UTS2和MMP17基因在缺血性脑卒中组中也明显 表达上调， KIAA1324L、 MIS1。

30、8A、 C1QTNF6、 MTERF2、 MAP6D1、 ZNF530、 DNAH1、 CRACR2A、 TTC22和 MIB2基因在缺血性脑卒中组中明显表达下调， 他们和LINC01094具有很好的相关性。 挑选 JAZF1基因进行相关性验证。 0066 实施例2大样本验证LINC01094和JAZF1基因 0067 一、 样本采集 0068 46例脑卒中患者及31例健康人群对照均来自医院(2014年1月-2015年9月)， 抽取 他们的外周血， 4000rpm离心分离血浆加TRIzoI试剂(l:3)并保持在-80直至进行RNA提 说 明 书 5/8 页 7 CN 107029238 A 7。

31、 取。 所有受试者均签署了知情同意书。 0069 二、 实验方法 0070 2.1引物设计 0071 LINC01094扩增引物： 0072 上游引物： CATACCTGAGCCAACATACAAT(SEQ ID NO.1) 0073 下游引物： TAACTGCCTAACTAACGATGAAG(SEQ ID NO.2) 0074 扩增长度： 150bp。 0075 JAZF1基因扩增引物： 0076 上游引物： ATTGTATTGCGGTGGTAT(SEQ ID NO.3) 0077 下游引物： TGTGAGTTGATGTGTTGA(SEQ ID NO.4) 0078 扩增长度： 102bp。。

32、 0079 2.2 RNA提取及反转录 0080 1)解冻含TRIzoI试剂的血浆， 震荡后静止5分钟。 0081 2)加氯仿(三氯甲烷0.2m1)， 剧烈震荡30秒， 静止15分钟。 0082 3)离心15分钟(12000g， 15分钟、 4)。 0083 4)取上清， 加异丙醇(0.5m1)剧烈震荡， 静止10分钟。 0084 5)离心10分钟(12000g， 10分钟， 4)， 然后弃上清。 0085 6)加75去污乙醇1ml(无水乙醇用DEPC处理的去离子水配， 无水乙醇： DEPC水 3:1)。 用震荡器震荡0.5分钟。 0086 7)离心5分钟(7500g， 4)弃上清， 倒扣于卫。

33、生纸上片刻后正置5分钟。 0087 8)加5ul DEPC-H2O手掌离心机瞬时离心， 60水浴10分钟。 0088 9)测浓度， 用RNA浓度测量仪器。 0089 接着采用采用TaKaRa试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(货号RR047A)对提取的总RNA反转录合成第一链cDNA。 0090 2.3标准DNA模板的制备 0091 将逆转录反应得到的cDNA进行常规PCR， 反应体系和条件如下： 10Ex Taq buffer 10 L， dNTP Mixture(各2.5mmol/L)4 。

34、L， Sequence NO.3(10pmol)4 L， Sequence NO.4(10pmol)4 L， cDNA(0.1-2 g)5 L， Ex Taq DNA聚合酶0.5 L， 双蒸水补齐至100uL。 反应 条件为94预变性5min； 94变性50s， 50退火50s， 72延伸50s， 35cycles； 最后72延 伸10min。 0092 取样5 L， 对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 进行切胶回收并纯化(回收 使用试剂盒： EZ-10Spin Column DNA Gel Extraction Kit)， 将纯化产物连接到pGM-T克隆 载体， 随后转化到DH5 感。

35、受态细胞中。 通过序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的特异性引 物筛选阳性克隆。 阳性克隆扩增后提取质粒DNA， 质粒DNA采用NanoDrop ND-1000核酸定量 仪定量(NanoDrop Technologies， Wilmington， Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用 于标准曲线的制备(标准DNA模板浓度范围在108-102copies/ l)。 0093 2.4敏感性实验 0094 取重组质粒按比例稀释为108、 107、 106、 105、 104、 103、 102个拷贝/ L， 进行荧光定量 PCR， 以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵。

36、敏度。 本研究所建立的方法检测范围为 说 明 书 6/8 页 8 CN 107029238 A 8 108-102copies/ L， 最小检出浓度为100copies/ L。 0095 2.2 RT-PCR实验 0096 采用TAKARA SYBR Premix Ex TaqTM(TIi RNaseH Plus)荧光定量试剂盒(货号 RR820A)。 50 L qRT-PCR反应体系包括： 上游引物(10 mol/L)2 L； 下游引物(10 mol/L)2 L； 样品cDNA 4 L； 50ROX Reference Dye 1 L； 2SYBR Premex Ex Taq(TIi RNa。

37、seH Plus)25 L， 加离子水至50 L。 仪器采用Applied Biosystems 7300。 荧光定量PCR程序： 95 30s预变性， 接40个循环： 955s， 6035s。 0097 对qRT-PCR反应结果使用SPSS For Windows 11.5软件， 相关数据采用 2检验和 Fisher确切概率法进行处理， P0.05有统计学意义； qRT-PCR反应利用MedCalc统计分析软 件来计算。 0098 根据qRT-PCR的相对定量公式： 2-Ct100， 比较LINC01094和JAZF1在缺血性 脑卒中患者和健康人群中的表达水平。 结果显示qRT-PCR扩增结。

38、果稳定， 其中LINC01094在 缺血性脑卒中患者组中较健康人群整体高表达， 表达量约为健康人群的4倍(见图1)， JAZF1 在缺血性脑卒中患者组中较健康人群整体高表达， 表达量约为健康人群的1.8倍(见图2)， 以上结果说明在肿瘤组织中高表达。 进一步分析发现， 二者的相关系数r高达0.98。 0099 实施例4 RNAi抑制LINC01094表达 0100 一、 材料 0101 siRNA构建与合成 0102 根据LINC01094在GenBank(NCBI Reference Sequence:NR_038303.1)中序列设计 相应的siRNA。 设计后送往合成公司合成。 0103。

39、 siRNA的设计与合成： 0104 设计3条RNA干扰靶序列(表1)， 阴性对照由公司提供。 0105 表1 LINC01094-siRNA转录模板序列 0106 0107 二、 实验方法 说 明 书 7/8 页 9 CN 107029238 A 9 0108 (一)RNA干扰技术抑制HEK293细胞中LINC01094的表达 0109 1、 细胞分组及瞬时转染 0110 (1)细胞分组 0111 C组： 空白对照组； C1组： 转染非特异性的siRNA组； S1， S2， S3组： 转染特异性的 siRNA组。 0112 (2)转染 0113 按照LipofectamineTM2000Tr。

40、ansfection Reagent提供的步骤进行。 0114 转染前24h， 取对数生长期的细胞用胰酶消化并计数， 用DMEM培养基调整细胞浓 度为1105/ml， 取2m1接种于六孔板， 放置于37， 5CO2培养箱中培养， 在细胞达80融合 时用于转染。 在转染前用不含血清的DMEM培养基培养3-4h。 0115 配制转染液体： 0116 A液： 250u1无血清培养基稀释4.0ugDNA， 温和混匀； 0117 B液： 250u1无血清培养基稀释10u1Lipofectamine， 温和混匀， 室温放置5min； 0118 转染： A液与B液混合在一起， 室温保温20min， 直接将复。

41、合物加入到每孔中， 摇动 培养板， 轻轻混匀。 在CO2培养箱中37保温24-48h， 6h后换液， 加入含血清的培养基。 0119 2、 应用Real-time PCR方法检测转染前后LINC01094表达的变化 0120 标准曲线的构建： 选取在50mI培养瓶中正常培养的HEK293细胞1瓶， 提取RNA， 测 定RNA浓度和纯度， 进行逆转录反应， 将反应生成的DNA模板十倍稀释， 得到相当于104- 100copies/ul的DNA模板， 分别加入LINC01094引物和内参引物， 配制25u1反应体系， 使用 Real-time PCR扩增仪， 进行PCR扩增反应。 得到LINC01。

42、094和内参的标准曲线。 0121 Real-time PCR方法检测转染前后LINC01094表达的变化： 提取各组细胞的RNA， 测定RNA浓度和纯度， 进行逆转录反应， 每组DNA模板同时进行LINC01094和内参的Real- time PCR反应， 实验重复三次。 0122 对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。 0123 三、 实验结果 0124 应用Real-time PCR方法构建LINC01094和内参的标准曲线， 相关系数分别为 0.9937,0.9952， 线性关系良好， 符合要求。 用双标准曲线的方法比较各组LINC01094的表 达。 空白对照组、 非特异性转染组基因的表达。

43、基本相似， 差异无统计学意义。 LINC01094- siRNA1、 LINC01094-siRNA2、 LINC01094-siRNA3三组转染后均有抑制LINC01094表达的作 用， LINC01094-siRNA1和LINC01094-siRNA2的作用更明显， 抑制效率达65和67， 而 LINC01094-siRNA1的抑制作用为23， 与空白对照组、 非特异性转染组相比， 差异有统计学 意义， P0.05(图3)。 0125 发明采用高通量测序筛选出脑卒中相关基因LINC01094， 结合分子细胞生物学实 验验证， 证实了LINC01094与脑卒中具有很好的相关性。 本发明为脑卒。

44、中临床诊疗提供了新 的靶标， 具有很好的临床应用前景。 说 明 书 8/8 页 10 CN 107029238 A 10 SEQUENCE LISTING 汕头大学医学院第一附属医院 LINC01094在诊治缺血性脑卒中的应用 13 PatentIn version 3.3 1 22 DNA 人工序列 1 catacctgag ccaacataca at 22 2 23 DNA 人工序列 2 taactgccta actaacgatg aag 23 3 18 DNA 人工序列 3 attgtattgc ggtggtat 18 4 18 DNA 人工序列 4 tgtgagttga tgtgttg。

45、a 18 5 23 DNA 人工序列 5 ctcatcaata aaagattaaa tta 23 6 21 RNA 序 列 表 1/3 页 11 CN 107029238 A 11 人工序列 6 auuuaaucuu uuauugauga g 21 7 21 RNA 人工序列 7 caucaauaaa agauuaaauu a 21 8 23 DNA 人工序列 8 agcttttaaa attataaata tat 23 9 21 RNA 人工序列 9 auauuuauaa uuuuaaaagc u 21 10 21 RNA 人工序列 10 cuuuuaaaau uauaaauaua u 21 11 23 DNA 人工序列 11 tggcaatagc ttttaaaatt ata 23 12 21 RNA 人工序列 12 uaauuuuaaa agcuauugcc a 21 序 列 表 2/3 页 12 CN 107029238 A 12 13 21 RNA 人工序列 13 gcaauagcuu uuaaaauuau a 21 序 列 表 3/3 页 13 CN 107029238 A 13 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 14 CN 107029238 A 14 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 15 CN 107029238 A 15 。