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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810179193.X (22)申请日 2018.03.05 (71)申请人 复旦大学附属中山医院 地址 200032 上海市徐汇区医学院路136号 (72)发明人 程蕾蕾 许宇辰 赵睿 (74)专利代理机构 上海申汇专利代理有限公司 31001 代理人 翁若莹 王婧 (51)Int.Cl. A61K 31/704(2006.01) A61K 31/4439(2006.01) A61K 35/742(2015.01) (54)发明名称 用于建立比格犬心功能不全模型的方法和 。
2、试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种用于建立比格犬心功能 不全模型的方法和试剂盒。 所述的试剂盒， 其特 征在于， 包含静脉滴注用预混粉剂或含有静脉滴 注用预混粉剂的注射液， 所述的静脉滴注用预混 粉剂由盐酸多柔比星， 奥美拉唑钠和地衣芽孢杆 菌组成， 含有静脉滴注用预混粉剂的注射液中静 脉滴注用预混粉剂的浓度为0.4mg/mL， 盐酸多柔 比星， 奥美拉唑钠和地衣芽孢杆菌的质量比为3 1 1。 采用上述比格犬心功能不全模型的试剂盒 可以方便、 高效地建立比格犬的心功能不全模 型， 可以运用于临床医学的研究。 权利要求书1页 说明书4页 附图7页 CN 108464985 A 2018.08。
3、.31 CN 108464985 A 1.一种用于建立比格犬心功能不全模型的试剂盒， 其特征在于， 包含静脉滴注用预混 粉剂或含有静脉滴注用预混粉剂的注射液， 所述的静脉滴注用预混粉剂由盐酸多柔比星、 奥美拉唑钠和地衣芽孢杆菌组成， 盐酸多柔比星， 奥美拉唑钠和地衣芽孢杆菌的质量比为3 0.5-1.5 0.5-1.5。 2.如权利要求1所述的用于建立比格犬心功能不全模型的试剂盒， 其特征在于， 所述的 含有静脉滴注用预混粉剂的注射液中静脉滴注用预混粉剂的浓度为0.35-0.45mg/mL。 3.如权利要求1所述的用于建立比格犬心功能不全模型的试剂盒， 其特征在于， 所述的 盐酸多柔比星， 奥美。
4、拉唑钠和地衣芽孢杆菌的质量比为3 1 1。 4.如权利要求1所述的用于建立比格犬心功能不全模型的试剂盒， 其特征在于， 所述的 含有静脉滴注用预混粉剂的注射液中静脉滴注用预混粉剂的浓度为0.4mg/mL。 5.如权利要求1所述的用于建立比格犬心功能不全模型的试剂盒， 其特征在于， 所述的 盐酸多柔比星、 奥美拉唑钠及地衣芽孢杆菌的总含量为200mg。 6.如权利要求1所述的用于建立比格犬心功能不全模型的试剂盒， 其特征在于， 还包含 9氯化钠注射液500mL。 7.如权利要求1所述的用于建立比格犬心功能不全模型的试剂盒， 其特征在于， 还包含 静脉留置针、 输液器、 输液贴以及注射液专用容器中。
5、的至少一种。 8.权利要求1-7中任一项所述的用于建立比格犬心功能不全模型的试剂盒的使用方 法， 其特征在于， 包括： 取含有静脉滴注用预混粉剂的注射液或采用静脉滴注用预混粉剂配 制所述的含有静脉滴注用预混粉剂的注射液， 按照静脉滴注用预混粉剂的用量为2.0- 3.0mg/kg体重的剂量给比格犬静脉滴注， 每1-2周进行一次， 共进行7-9次， 得到比格犬心功 能不全模型。 9.如权利要求8所述的用于建立比格犬心功能不全模型的试剂盒的使用方法， 其特征 在于， 按照静脉滴注用预混粉剂的用量为2.5mg/kg体重的剂量给比格犬静脉滴注。 10.一种建立比格犬心功能不全模型的方法， 其特征在于， 。
6、包括： 取含有静脉滴注用预 混粉剂的注射液或采用静脉滴注用预混粉剂配制所述的含有静脉滴注用预混粉剂的注射 液， 所述的静脉滴注用预混粉剂由盐酸多柔比星、 奥美拉唑钠和地衣芽孢杆菌组成， 盐酸多 柔比星， 奥美拉唑钠和地衣芽孢杆菌的质量比为3 0.5-1.5 0.5-1.5， 所述的含有静脉滴注 用预混粉剂的注射液中静脉滴注用预混粉剂的浓度为0.35-0.45mg/mL， 按照静脉滴注用预 混粉剂的用量为2.0-3.0mg/kg体重的剂量给比格犬静脉滴注， 每1-2周进行一次， 共进行7- 9次， 得到比格犬心功能不全模型。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108464985 A 2 。
7、用于建立比格犬心功能不全模型的方法和试剂盒 技术领域 0001 本发明属于生物制模领域， 涉及一种用于建立比格犬心功能不全模型的试剂盒， 用于建立蒽环类化疗药物心脏毒性动物模型。 背景技术 0002 蒽环类药物是一类细胞毒类抗肿瘤的蒽环类药物， 由于其抗肿瘤谱广、 抗肿瘤作 用强、 疗效确切， 因此被广泛应用于血液系统恶性肿瘤与各类实体肿瘤的一线治疗方案中， 但与之相对， 其严重的心脏毒性限制其在临床上的进一步使用。 近年来， 对多柔比星致心脏 毒性的基础研究揭示了一些可能的分子机制， 如自由基诱导的心肌氧化损伤， 心肌细胞线 粒体功能障碍， 产生药物-铁复合物加重氧化损伤等。 尸体解剖发现，。
8、 蒽环类药物能导致心 肌细胞出现空泡变性， 纤维化等病理改变。 但由于缺乏有效的组织病理标本与细胞样本， 其 确切的致心脏损伤的过程尚未完全阐明。 由于医学伦理的相关要求， 对已有多柔比星致心 功能损害的患者， 研究其心脏的细胞与病理改变在实际科研中难以开展。 因此急需合适的 动物模型来模拟临床中出现的多柔比星相关性心功能不全， 并追踪其整个过程， 从而对临 床策略的制定提供重要的参考。 0003 此前报道的一些动物模型大多是用小鼠制备的， 而小鼠心脏与人类心脏差异较大 且小鼠的心率是人的8-10倍， 使得对小鼠心功能的评估受到限制。 此外小鼠模型采用短时 间、 大剂量腹腔注射表柔比星的方式给。
9、药， 这与临床上的给药剂量、 给药方式均有很大的差 异， 其所导致的不良反应也不尽相同。 而比格犬的心血管系统与人类高度相似， 表柔比星的 给药方式与剂量也与人类相近， 因此， 是研究蒽环类药物致心功能不全的良好载体。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种用于建立比格犬心功能不全模型的方法和用于实施该 方法的试剂盒， 以提高建模成功率。 0005 为了达到上述目的， 本发明提供了一种用于建立比格犬心功能不全模型的试剂 盒， 其特征在于， 包含静脉滴注用预混粉剂或含有静脉滴注用预混粉剂的注射液， 所述的静 脉滴注用预混粉剂由盐酸多柔比星、 奥美拉唑钠和地衣芽孢杆菌组成， 盐酸多柔比星， 奥。
10、美 拉唑钠和地衣芽孢杆菌的质量比为3 0.5-1.5 0.5-1.5。 0006 优选地， 所述的含有静脉滴注用预混粉剂的注射液中静脉滴注用预混粉剂的浓度 为0.35-0.45mg/mL。 0007 更优选地， 所述的盐酸多柔比星， 奥美拉唑钠和地衣芽孢杆菌的质量比为3 1 1。 0008 更优选地， 所述的含有静脉滴注用预混粉剂的注射液中静脉滴注用预混粉剂的浓 度为0.4mg/mL。 0009 优选地， 所述的盐酸多柔比星和奥美拉唑钠皆为分析纯。 0010 优选地， 所述的盐酸多柔比星、 奥美拉唑钠及地衣芽孢杆菌的总含量为200mg。 0011 优选地， 所述的用于建立比格犬心功能不全模型的。
11、试剂盒还包含9氯化钠注射 说 明 书 1/4 页 3 CN 108464985 A 3 液500mL。 0012 优选地， 所述的用于建立比格犬心功能不全模型的试剂盒还包含静脉留置针、 输 液器、 输液贴以及注射液专用容器中的至少一种。 0013 本发明还提供了上述的用于建立比格犬心功能不全模型的试剂盒的使用方法， 其 特征在于， 包括： 取含有静脉滴注用预混粉剂的注射液或采用静脉滴注用预混粉剂配制所 述的含有静脉滴注用预混粉剂的注射液， 按照静脉滴注用预混粉剂的用量为2.0-3.0mg/kg 体重的剂量给比格犬静脉滴注， 每1-2周进行一次， 共进行7-9次， 得到比格犬心功能不全模 型。 。
12、0014 优选地， 按照静脉滴注用预混粉剂的用量为2.5mg/kg体重的剂量给比格犬静脉滴 注。 0015 本发明还提供了一种建立比格犬心功能不全模型的方法， 其特征在于， 包括： 取含 有静脉滴注用预混粉剂的注射液或采用静脉滴注用预混粉剂配制所述的含有静脉滴注用 预混粉剂的注射液， 所述的静脉滴注用预混粉剂由盐酸多柔比星、 奥美拉唑钠和地衣芽孢 杆菌组成， 盐酸多柔比星， 奥美拉唑钠和地衣芽孢杆菌的质量比为3 0.5-1.5 0.5-1.5， 所 述的含有静脉滴注用预混粉剂的注射液中静脉滴注用预混粉剂的浓度为0.35-0.45mg/mL， 按照静脉滴注用预混粉剂的用量为2.0-3.0mg/k。
13、g体重的剂量给比格犬静脉滴注， 每1-2周 进行一次， 共进行7-9次， 得到比格犬心功能不全模型。 0016 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 0017 1、 本发明在使用多柔比星建立比格犬心功能不全模型的同时， 加以辅助的奥美拉 唑钠， 避免上消化道出血等其他药物相关的不良反应， 同时增加肠益生菌如地衣芽孢杆菌 来调节肠道菌群以保护肠粘膜， 以防止下消化道出血， 并通过多次试验， 确定了合理的给药 剂量与给药间隔， 改进给药方式， 从而有效提高了建模的成功率， 简化了建模步骤。 本发明 操作简便、 可重复性高、 成功率高， 采用上述比格犬心功能不全模型的试剂盒可以方便、 高 效地建立。
14、比格犬的心功能不全模型， 可以运用于临床医学的研究。 0018 2、 本发明在给予科学的给药剂量， 给药次数和给药周期后， 能在短时间内(16周) 快速建立比格犬心功能不全的模型。 相较于此前已有报道的可重复的建模方式(静脉推注 多柔比星1.5mg/kg/次， 三周一次， 累积剂量12-13mg/kg， 24周成模)能提前平均60天的时间 完成模型建立， 因此更为快速高效。 0019 3、 本发明确定了奥美拉唑钠与地衣芽孢杆菌用于预防多柔比星静滴后比格犬胃 肠道出血的合理剂量。 附图说明 0020 图1为使用配套软件对图像进行分析图； 其中， A1为人工定位左室二尖瓣、 心尖、 左 室流出道位。
15、置， apex定位心尖部， MV定位左室二尖瓣； B1为软件对心肌运动进行跟踪， 电脑 自动在左心室长轴两腔心、 三腔心、 四腔心切面及左心室短轴切面描记了心内膜边界； Cl为 软件分析得到左心室舒张末期容积、 收缩末期容积、 射血分数等数据； 图中左下角部分显示 分析数据为： EDV(舒张末容积)24.2mlESV(收缩末容积)11.0ml EF(射血分数)54.4。 0021 图2为显示基线(0周)-A2、 4次给药后(8周)， -B2、 8次给药(16周)-C2、 最终成模(20 周)-D2四个时间点的分析结果图(包括左心室舒张末期容积(ESV)、 收缩末期容积(EDV)、 射 说 明 。
16、书 2/4 页 4 CN 108464985 A 4 血分数(EF)等)。 0022 A2中图中左下角部分显示分析数据为： EDV(舒张末容积)24.2ml ESV(收缩末容 积)11.0ml EF(射血分数)54.4； B2图中左下角部分显示分析数据为： EDV(舒张末容积) 25.9ml ESV(收缩末容积)13.8ml EF(射血分数)46.7； C2图中左下角部分显示分析数据 为： EDV(舒张末容积)20.7ml， ESV(收缩末容积)11.7ml EF(射血分数)43.2； D2图中左下 角部分显示分析数据为EDV(舒张末容积)27.1ml； ESV(收缩末容积)16.8ml EF。
17、(射血分数) 38.2。 0023 图3为四个时间点： 0周、 8周、 16周、 20周比格犬的左心室射血分数(LVEF)平均值的 柱状图(20周与0周相比左心室射血分数发生了显著下降P0.05) 具体实施方式 0024 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 本实施例中的静脉留置针、 输液器、 输液贴以及注射液专用容器皆为市售产品。 0025 实施例 0026 一种用于建立比。
18、格犬心功能不全模型的试剂盒， 包含静脉滴注用预混粉剂、 9氯 化钠注射液500mL、 静脉留置针、 输液器、 输液贴以及注射液专用容器。 所述的静脉滴注用预 混粉剂由盐酸多柔比星， 奥美拉唑钠及地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis， 荷兰帝斯 曼(DSM)公司， 含活菌约1*1011菌落单位/g)， 盐酸多柔比星， 奥美拉唑钠及地衣芽孢杆菌的 质量比为3 1 1， 盐酸多柔比星和奥美拉唑钠皆为分析纯， 盐酸多柔比星， 奥美拉唑钠及地 衣芽孢杆菌的总含量为200mg。 0027 使用时， 首先称量10只成年比格犬的体重并对其进行麻醉。 根据其体重按2.5mg/ kg的剂量取。
19、用静脉滴注用预混粉剂， 并用专用溶剂9氯化钠注射液将其溶解为0.4mg/mL 浓度， 溶解后的溶液呈亮红色， 将注射液注入专用容器。 使用静脉留置针穿刺比格犬的腿后 静脉， 将装有溶液的专用容器用输液器与静脉留置针连接。 调节速度旋钮控制速度， 保持试 剂注入相对匀速并控制注入速度使整个输液过程控制在30min左右， 取出静脉留置针并在 创口处粘贴输液贴止血， 于操作后对比格犬进行心脏超声检查从而监测其心功能， 如图1所 示， 以上步骤每2周进行一次， 共进行8次(多柔比星累积剂量达12mg/kg)， 得到比格犬心功 能不全模型。 0028 通过对历次超声心动图结果的分析发现， 在完成8次操作。
20、后的第4周， 如图2所示， 与基线相比， 比格犬的左心室射血分数平均下降20并低于正常值， 10条比格犬的左室射 血分数(LVEF)平均值如图3所示， 20周与0周相比左心室射血分数发生了显著下降， 两者差 异具有统计学意义， 并达到了临床上对于心功能不全的诊断标准， 建模成功， 成功率为 80。 0029 对比例1 0030 称量6只成年比格犬的体重， 配置浓度为1mg/m1的表柔比星溶液， 按1mg/kg或2mg/ kg的剂量， 手动静脉推注， 于10min内推注完成， 给药间隔为每周一次， 5只死亡， 1只引起严 重消化道出血而无法进行后续实验， 0只建模成功。 通过解剖结果， 发现此种。
21、建模方式极易 说 明 书 3/4 页 5 CN 108464985 A 5 引起比格犬严重的消化道出血而引起比格犬的死亡， 并且手动推注不能确保药物以匀速进 入血液， 容易引起阵发的心律失常， 并且由于较高的药物浓度与较短的给药时间， 注射部位 的静脉常发生血管的硬化， 为后续实验带来不便。 该建模方法复杂、 成功率低、 可重复性差， 无法广泛使用。 0031 对比例2 0032 称量9只成年比格犬的体重， 并随机分成A， B， C三组， 其中A组使用包含盐酸多柔比 星， 奥美拉唑钠及地衣芽孢杆菌的预混制剂， B组使用盐酸多柔比星与奥美拉唑钠， C组仅使 用盐酸多柔比星。 根据其体重按A组2.。
22、5mg/kg(盐酸多柔比星， 奥美拉唑钠， 地衣芽孢杆菌3 1 1)B组2.0mg/kg(盐酸多柔比星， 奥美拉唑钠3 1)C组1.5mg/kg(盐酸多柔比星)取用药剂， 并用专用溶剂9氯化钠注射液将其溶解， 溶解后的溶液均呈亮红色， 将注射液注入专用容 器。 使用静脉留置针穿刺比格犬的腿后静脉， 将装有溶液的专用容器用输液器与静脉留置 针连接。 调节速度旋钮控制速度， 保持试剂注入相对匀速并控制注入速度使整个输液过程 控制在30min左右， 以上步骤每2周进行一次， 共进行8次(多柔比星累积剂量达12mg/kg)。 当 实验进行至第二周时， C组中两只比格犬出现便血， 粪便呈深红色， 初步推。
23、测为消化道出血， 进行至第四周时， C组三只比格犬均出现便血， 其中两只因为严重消化道出血而退出实验。 在实验进行到第五周时， B组三只实验犬均轻微便血， 进行至第7周时， B组中一条比格犬因 消化道出血且不进食而退出实验。 而A组3只比格犬均顺利接受8次静滴后完成建模。 通过病 理解剖发现， 不使用奥美拉唑及地衣芽孢杆菌预混剂会导致实验犬的消化道出血， 而单独 使用奥美拉唑钠仅能预防上消化道出血， 无法避免下消化道的出血， 而在预混制剂中所包 含的奥美拉唑及地衣芽孢杆菌能保护肠粘膜能有效防止多柔比星对于上消化道与下消化 道的损伤导致的出血， 从而提高了建模的成功率。 说 明 书 4/4 页 6 CN 108464985 A 6 说 明 书 附 图 1/7 页 7 CN 108464985 A 7 图1 说 明 书 附 图 2/7 页 8 CN 108464985 A 8 说 明 书 附 图 3/7 页 9 CN 108464985 A 9 说 明 书 附 图 4/7 页 10 CN 108464985 A 10 说 明 书 附 图 5/7 页 11 CN 108464985 A 11 图2 说 明 书 附 图 6/7 页 12 CN 108464985 A 12 图3 说 明 书 附 图 7/7 页 13 CN 108464985 A 13 。