确定放射敏感性的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201480028981.9	申请日：	20140328
公开号：	CN105263578B	公开日：	20181002
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	A61B6/00	主分类号：	A61B6/00
申请人：	蒙彼利埃大学医疗中心,蒙彼利埃大学,蒙彼利埃癌症区域研究所
发明人：	D·阿兹里亚,J·拉孔巴,J·索拉索尔,A·曼格
地址：	法国蒙彼利埃
优先权：	EP2014056265W,EP13305399A
专利代理机构：	北京戈程知识产权代理有限公司	代理人：	程伟;程云
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内容摘要

本发明涉及用于体外确定受试者的放射敏感性的方法。更具体地，本发明涉及这样的方法，其包括在来自受试者的生物样本中诱导外源胁迫的步骤，接着在所述生物样本中以及在参考样本中比较一组限定化合物中所选的至少一种化合物的存在或水平。本发明还涉及所述至少一种化合物作为受试者的放射敏感性的预测生物标记物的用途。本发明还涉及可用在根据本发明的方法中的检测所述化合物中至少一种的存在或水平的试剂盒。

权利要求书

1.至少一种试剂在制备用于体外确定受试者的放射敏感性的试剂盒中的用途，其中所述的试剂特异性检测至少一种化合物的存在或水平，所述化合物选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2、DNA-脱嘌呤或脱嘧啶位点裂解酶、热休克同源蛋白71kDa、腺苷酸激酶2、膜联蛋白A1、其特定片段、其编码核酸以及其组合；其中所述的体外确定包括以下步骤：a)在包含细胞的生物样本的第一部分诱导外源胁迫，b)在步骤a)的部分中确定所述至少一种化合物的存在或水平，c)在所述生物样本未承受所述外源胁迫的第二部分中确定所述至少一种化合物的存在或水平，d)比较在所述第一部分以及在所述第二部分中确定所述至少一种化合物的存在或水平的结果，并选择在所述第一和所述第二部分中差异表达的至少一种化合物，e)在来自所述受试者的包含细胞的生物测试样本中诱导外源胁迫，f)在步骤e)的测试样本中确定在步骤d)中选择的所述至少一种化合物的存在或水平，g)将所述步骤f)中确定的所述至少一种化合物的存在或水平的结果与在生物参考样本中相同化合物的存在或水平相比较，以及h)根据步骤g)的比较确定所述受试者的放射敏感性。 2.根据权利要求1所述的用途，其中通过选自以下的至少一种方法诱导所述外源胁迫：放射、与至少一种拟放射剂接触及其组合。 3.根据权利要求2所述的用途，其中放射剂量包含在0.1至16Gy之间。 4.根据权利要求2所述的用途，其中放射剂量包含在2至14Gy之间。 5.根据权利要求2所述的用途，其中放射剂量高于4Gy。 6.根据权利要求2所述的用途，其中放射剂量为8Gy。 7.根据权利要求2所述的用途，其中所述至少一种拟放射剂选自：阿非迪霉素、博莱霉素、烯二炔抗生素和过氧化氢。 8.根据权利要求1所述的用途，其中所述生物样本选自：全血、含有白细胞的全血提取物、含有淋巴细胞的全血提取物以及含有T淋巴细胞的全血提取物。 9.根据权利要求1或8所述的用途，其中所述生物样本通过包含以下步骤的方法进行制备：a)从全血提取物中分离淋巴细胞，b)对步骤a)的所述分离的淋巴细胞进行放射，以及c)从步骤b)的淋巴细胞中提取蛋白。 10.根据权利要求1所述的用途，其中所述至少一种化合物的存在或水平由选自以下的至少一种方法确定：基于免疫检测的方法、基于western印迹的方法、基于质谱的方法、基于色谱的方法、基于流式细胞术的方法以及用于特异性检测核酸的存在或水平的方法。 11.根据权利要求1所述的用途，其中所述至少一种化合物包含：-线粒体异柠檬酸脱氢酶2、其特定片段或其编码核酸，以及-选自以下的至少一种：DNA-脱嘌呤或脱嘧啶位点裂解酶、热休克同源蛋白71kDa、腺苷酸激酶2、膜联蛋白A1、其特定片段、其编码核酸以及其组合。 12.根据权利要求1所述的用途，其中所述受试者患有对放射疗法治疗易感的疾病，所述疾病选自：癌症、巴塞杜氏病、垂体腺瘤、脑脊膜瘤和talalgy。 13.至少一种试剂在制备用于体外确定受试者的放射敏感性的试剂盒中的用途，其中所述的试剂特异性检测至少一种化合物的存在或水平，所述化合物选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2、DNA-脱嘌呤或脱嘧啶位点裂解酶、热休克同源蛋白71kDa、腺苷酸激酶2、膜联蛋白A1、其特定片段、其编码核酸以及其组合；其中所述的体外确定包括以下步骤：a)在来自所述受试者的含有细胞的生物测试样本中诱导外源胁迫，b)在步骤a)的样本中确定所述至少一种化合物的存在或水平，c)将所述至少一种化合物的存在或水平与参考样本中相同化合物的存在或水平进行比较，以及d)根据步骤c)的比较确定所述受试者的放射敏感性。 14.根据权利要求13所述的用途，所述的体外确定包括以下步骤：a)在来自所述受试者的含有淋巴细胞的生物测试样本中诱导外源胁迫，b)在所述生物测试样本中确定诱导的凋亡的水平，c)在来自相同受试者的生物测试样本中诱导外源胁迫，并确定所述生物测试样本中所述至少一种化合物的存在或水平，d)将所述至少一种化合物的存在或水平与参考样本中相同化合物的存在或水平进行比较，以及e)根据步骤b)诱导的凋亡水平以及步骤d)的比较确定所述受试者的放射敏感性。 15.根据权利要求13或14所述的用途，其中通过选自以下的至少一种方法诱导所述外源胁迫：放射、与至少一种拟放射剂接触及其组合。 16.根据权利要求15所述的用途，其中放射剂量包含在0.1至16Gy之间。 17.根据权利要求15所述的用途，其中放射剂量包含在2至14Gy之间。 18.根据权利要求15所述的用途，其中放射剂量高于4Gy。 19.根据权利要求15所述的用途，其中放射剂量为8Gy。 20.根据权利要求15所述的用途，其中所述至少一种拟放射剂选自：阿非迪霉素、博莱霉素、烯二炔抗生素和过氧化氢。 21.根据权利要求13所述的用途，其中所述生物测试样本选自：全血、含有白细胞的全血提取物、含有淋巴细胞的全血提取物以及含有T淋巴细胞的全血提取物。 22.根据权利要求13或21所述的用途，其中所述生物测试样本通过包含以下步骤的方法进行制备：a)从全血提取物中分离淋巴细胞，b)对步骤a)的所述分离的淋巴细胞进行放射，以及c)从步骤b)的淋巴细胞中提取蛋白。 23.根据权利要求13所述的用途，其中所述至少一种化合物的存在或水平由选自以下的至少一种方法确定：基于免疫检测的方法、基于western印迹的方法、基于质谱的方法、基于色谱的方法、基于流式细胞术的方法以及用于特异性检测核酸的存在或水平的方法。 24.根据权利要求13所述的用途，其中所述至少一种化合物包含：-线粒体异柠檬酸脱氢酶2、其特定片段或其编码核酸，以及-选自以下的至少一种：DNA-脱嘌呤或脱嘧啶位点裂解酶、热休克同源蛋白71kDa、腺苷酸激酶2、膜联蛋白A1、其特定片段、其编码核酸以及其组合。 25.根据权利要求13所述的用途，其中所述受试者患有对放射疗法治疗易感的疾病，所述疾病选自：癌症、巴塞杜氏病、垂体腺瘤、脑脊膜瘤和talalgy。 26.至少一种试剂在制备用于预测受试者对晚期放射诱导毒性的易感性的试剂盒中的用途，其中所述的试剂特异性检测至少一种化合物的存在或水平，所述化合物选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2、DNA-脱嘌呤或脱嘧啶位点裂解酶、热休克同源蛋白71kDa、腺苷酸激酶2、膜联蛋白A1、其特定片段、其编码核酸以及其组合；其中所述的预测包括：根据权利要求1至25中任一项所述的用途，以及当所述至少一种化合物存在于所述生物测试样本中以及不存在于所述参考样本中时和/或当所述生物测试样本中所述至少一种化合物的水平高于所述参考样本中相同化合物的水平时，预测所述受试者对晚期放射诱导毒性的易感性的步骤。 27.根据权利要求26所述的用途，其中通过选自以下的至少一种方法诱导所述外源胁迫：放射、与至少一种拟放射剂接触及其组合。 28.根据权利要求27所述的用途，其中放射剂量包含在0.1至16Gy之间。 29.根据权利要求27所述的用途，其中放射剂量包含在2至14Gy之间。 30.根据权利要求27所述的用途，其中放射剂量高于4Gy。 31.根据权利要求27所述的用途，其中放射剂量为8Gy。 32.根据权利要求27所述的用途，其中所述至少一种拟放射剂选自：阿非迪霉素、博莱霉素、烯二炔抗生素和过氧化氢。 33.根据权利要求26所述的用途，其中所述生物测试样本选自：全血、含有白细胞的全血提取物、含有淋巴细胞的全血提取物以及含有T淋巴细胞的全血提取物。 34.根据权利要求26或33所述的用途，其中所述生物测试样本通过包含以下步骤的方法进行制备：a)从全血提取物中分离淋巴细胞，b)对步骤a)的所述分离的淋巴细胞进行放射，以及c)从步骤b)的淋巴细胞中提取蛋白。 35.根据权利要求26所述的用途，其中所述至少一种化合物的存在或水平由选自以下的至少一种方法确定：基于免疫检测的方法、基于western印迹的方法、基于质谱的方法、基于色谱的方法、基于流式细胞术的方法以及用于特异性检测核酸的存在或水平的方法。 36.根据权利要求26所述的用途，其中所述至少一种化合物包含：-线粒体异柠檬酸脱氢酶2、其特定片段或其编码核酸，以及-选自以下的至少一种：DNA-脱嘌呤或脱嘧啶位点裂解酶、热休克同源蛋白71kDa、腺苷酸激酶2、膜联蛋白A1、其特定片段、其编码核酸以及其组合。 37.根据权利要求26所述的用途，其中所述受试者患有对放射疗法治疗易感的疾病，所述疾病选自：癌症、巴塞杜氏病、垂体腺瘤、脑脊膜瘤和talalgy。 38.一种适用于确定受试者的放射敏感性的试剂盒，其包括：用于特异性检测至少一种化合物的至少一种试剂、以及用于检测细胞凋亡的试剂，所述化合物选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2、DNA-脱嘌呤或脱嘧啶位点裂解酶、热休克同源蛋白71kDa、腺苷酸激酶2、膜联蛋白1、其特定片段、其编码核酸分子及其组合。 39.一种适用于确定受试者的放射敏感性的试剂盒，其至少包括：用于检测至少两种化合物的试剂、以及用于检测细胞凋亡的试剂，所述化合物选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2、DNA-脱嘌呤或脱嘧啶位点裂解酶、热休克同源蛋白71kDa、腺苷酸激酶2、膜联蛋白1、其特定片段、其编码核酸及其组合。

说明书

技术领域

本发明涉及用于体外确定受试者放射敏感性的方法。更具体地说，本发明涉及一种方法，其包括在来自受试者的生物样本中诱导外源胁迫并比较所述生物样本和参考样本之间至少一种鉴定的化合物水平。本发明还涉及所述至少一种化合物作为受试者放射敏感性的预测生物标记物的用途。本发明还涉及可用在根据本发明方法中用于检测所述鉴定化合物中至少一个的水平的试剂盒。

背景技术

放射疗法的成功主要依赖于总施用剂量。在组织对电离放射损伤的敏感性上个体差异很大。每年在世界范围内，大约400万人通过放射疗法进行治疗。目前的估计表明，5-10％接受放射疗法的患者由于高度敏感显示不良反应。患者对电离放射的高度敏感可发展为严重的放射诱导副作用。目前仍然不可能预测这些副作用，其牵涉到限制给定的剂量具有降低患者治疗收益的风险。到现在为止，用于评估放射敏感性的实验方法对于待检查的大群体而言太费力。

已经开发了一些用于预测放射毒性的测试，但到目前为止，没有一个可使用在临床常规中。

克隆形成(clonogenic)测试评估放射之后淋巴细胞增殖能力的丧失(West等，1995)。其它测试基于放射后检测微核(Floyd和Cassoni，1994)。然而，常规实施中这些测试是有限的，其中没有用于临床的。

放射诱导的淋巴细胞凋亡(RILA)分析通过流式细胞术测量在放射(0.5-8Gy)之后CD4和CD8T-淋巴细胞的凋亡(Ozsahin等人，1997，Azria等人，2009)。在399个患者的群体中证实这种结果(Ozsahin等人，2005)。这种测量是基于伴随凋亡的特异性染色质变化导致的核DNA荧光减少并且能够鉴定过度敏感的患者。RILA分析的阳性预测值较弱，群体中80％患者检测出具有弱凋亡水平，这不代表任何晚期毒性。RILA分析具有0.70的灵敏度和低于0.50的特异性(Ozsahin等人，2005)。

研究了一些遗传变异(例如单核苷酸多态性(SNP)、拷贝数变异(CNV)或表观遗传修饰和放射毒性)之间的相关性(Azria等人，2008，Azria等人，2012)。已经鉴定了在氧化胁迫或炎症期间与DNA修复相关的、并与早期或晚期毒性相关的一些基因。然而，到现在为止，尚未证明基因型和放射毒性之间的关联以及缺少放射毒性的强遗传标记物。

一些蛋白质组学研究已初步解决了放射敏感性标记物的确定。WO2013/001507描述了一种方法，其包括为经受放射疗法的患者制定或调整治疗方案，其中所述方法是基于患者一组指示放射性毒性的血清多肽。在暴露至电离放射的小鼠模型的血清中，发现α1抗胰蛋白酶、APOA1和补体C3上调(Guipaud等人，2007)。Cai等人(2011)公开了接受放射的非小细胞肺癌患者的蛋白质组学分析。还发现在一小群放射诱导的肺毒性>2级的患者中，补体C3、C4b结合蛋白α链和玻璃体结合蛋白(Vitronectin)上调(Cai等，2010；Cai等，2011)。Skvortsova等人(2008)公开了前列腺癌细胞系和放射耐受的前列腺癌细胞系的蛋白质组谱。Stenmark等人(2011)公开了接受放射疗法的患者的循环(circulating)细胞因子水平。最后，Oh等人提出在硅(silico)分析中的原因(original)以及鉴定α-2巨球蛋白可能与肺癌患者放射诱导的肺部炎症风险增加相关，但没有在独立的群中证实这种结果(Oh等人，2011)。

针对放射敏感性的现有预测性测试中没有可用于临床常规的，由于两个主要的缺点：i)其缺乏灵敏度和/或特异性，没有同时具有足够好的阳性和阴性预测值，ii)其缺乏技术可行性以及需要长期延迟，需要训练有素的从业者、其成本高以及生物样本的侵入性采集。

因此，仍然需要显示受试者的放射敏感性的高度阳性和阴性预测值的简单、快速和可靠的方法。

本发明人已经证明，通过在来自受试者或患者的生物样本中诱导外源胁迫，确定至少一种鉴定的差异表达的化合物反映出所述受试者或患者的放射敏感性。因此，这种测试允许预测晚期放射诱导的毒性。

根据本发明的方法和用途将组织放射敏感性的详情提供给医师，从而有助于早期识别与恰当处理这些高度敏感性的患者。此外，对绝大多数被预测不具有高度敏感性的患者，这种方法或分析可以增加总放射剂量并可能在这些患者中会获得更高的治愈或控制率。在理论范围中，通过适度增加总放射剂量在一些患者中可以显著提高局部肿瘤控制。据建议，控制率增加20％是可行的。

本发明公开确认了来自RILA分析的结果并具有更高阳性预测能力的方法。此外，根据本发明的所述方法可以与其它测试组合使用，因此提高检测的预测值。RILA分析和根据本发明方法的组合可以以10％的患病率产生0.90的灵敏度和0.80的特异性。这个结果可允许所述测试在每天临床实践中实施。

根据本发明的方法代表在治疗性操作规程中的有用工具、在决策中的宝贵帮助并且可用于预防放射疗法诱导的毒性。

根据本发明的方法允许从简单的血液收集中以及在五天之内确定个体的组织放射敏感性的蛋白谱。这种测试的快速、重复性和逻辑简单性是有利于其在临床常规实施的有力论据。

发明内容

通过本文给出的详细描述和附图将使本发明得到更加透彻的理解，所述描述和附图仅以说明方式给出并不限制本发明的预期范围。

本发明首先涉及用于体外确定受试者的放射敏感性的方法，包括以下步骤：

a)在包含细胞的生物样本的第一部分诱导外源胁迫，

b)在步骤a)的部分中确定至少一种化合物的存在或水平，

c)在所述生物样本未承受所述外源胁迫的第二部分中确定所述至少一种化合物的存在或水平，

d)比较在所述第一部分以及在所述第二部分中确定的所述至少一种化合物的存在或水平的结果，并选择在所述第一和所述第二部分中差异表达的至少一种化合物，

e)在来自所述受试者的包含细胞的生物测试样本中诱导外源胁迫，

f)在步骤e)的测试样本中确定在步骤d)中选择的所述至少一种化合物的存在或水平，

g)将在步骤f)中确定的所述至少一种化合物的存在或水平的结果与在生物参考样本中相同化合物的存在或水平相比较，以及

h)通过步骤g)的比较确定所述受试者的放射敏感性。

术语“放射敏感性”涉及细胞、组织、器官和/或生物体对有害电离放射损伤(致死或亚致死)的内在易感性。在根据本发明的方法中，所述暴露至电离放射发生在治疗性放射电离期间，也被称为“放射治疗”或“辐射疗法”。根据临床实践，患者经受医疗使用的电离放射以控制或杀死靶细胞，特别是到放射剂量，对于医师和放射治疗师而言是详细描述和公知的。

本发明首先涉及用于确定和/或用于预测受试者的内在放射敏感性的方法。

在组织中放射作用背后的机制涉及分子损伤，特别是靶向DNA和质膜的分子损伤，其导致形成自由基和双链DNA断裂、以及多种细胞机制，如细胞防御、凋亡、胁迫反应和修复过程(Lacombe等人，2013)。

在根据本发明的方法中，“外源性胁迫”是通过电离放射或拟放射(radiomimetic)剂在细胞、组织和/或器官中诱导的胁迫。在根据本发明的方法中，“包含细胞的生物样本”是从人体分离的，以及向所述包含细胞的生物样本离体诱导所述外源胁迫。

在根据本发明的方法的具体方面，“包含细胞的生物样本”包括任何类型的细胞，其中所述细胞优选地选自以下：血细胞，更优选白血细胞，甚至更优选淋巴细胞，甚至更优选CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴细胞。

在根据本发明的方法的具体方面中，在步骤a)、b)、c)和d)中，包含细胞的生物样本是从受试者、或从一组受试者中分离，所述受试者与期望确定放射敏感性的受试者不同。根据本发明方法的这种具体方面，所述包含细胞的生物样本分离自人类的身体。在根据本发明方法的具体方面中，在步骤a)、b)、c)和d)中，包含细胞的生物样本是从患有相同疾病的一组受试者中分离的，而不是从期望确定放射敏感性的受试者中分离。

在根据本发明的方法中，根据步骤b)、c)、d)、f)和g)中任一项所述的化合物优选是细胞内化合物。在本发明的具体实施方案中，所述化合物是由其氨基酸序列所定义的蛋白。在一种更具体的实施方案中，本发明包括检测所述蛋白或其特定片段的存在或水平。“其特定片段”意指从例如前体(这样一种蛋白，它是预-前-蛋白(pre-pro-protein)和预蛋白(pre-protein)的片段)的细胞内切割所得的片段。在具体的实施方案中，“特定片段”是由蛋白的配体(如抗体)特异性识别的蛋白的片段或表位。在另一具体实施方案中，本发明包括检测编码所述蛋白的核酸分子的存在或水平，所述分子优选为mRNA或cDNA分子，以及所述蛋白通过其核苷酸序列被限定。

化合物“存在”的确定导致指示其在样本中存在或不存在。化合物“水平”的确定可以产生其在样本中数量的估计。样本中化合物的水平可以是相对于参考样本进行表达的，例如以比率或百分比。根据所述确定所用的方法，所述水平也可以表达为信号的强度或定位。所述水平也可以表达为样本中所述化合物的浓度。优选地，在将样本中相关化合物的总浓度归一化之后表达所述样本中所述化合物的浓度。在根据本发明的方法中，将所述生物样本的第一部分中化合物的水平与所述生物样本的第二部分中相同化合物的水平进行比较，其中所述比较可能表示为在第一和第二部分中所述化合物的比率估计，或表示为在部分之一中所述化合物水平的百分比。在优选的实施方案中，根据本领域技术人员已知的方法，将每一部分中所述化合物的定量水平进行统计学比较以证明所述两个部分中化合物的差异表达。

在根据本发明的方法中，在来自所述受试者的测试样本中确定所述化合物的水平(在步骤f)中)。在具体的实施方案中，所述测试样本是相同性质的生物样本，而不是用于选择差异表达的化合物(在步骤d)中)的生物样本。作为一个示例，可以根据相同的方法收集和制备步骤d)和f)的样本。在另一具体的实施方案中，步骤f)的所述测试样本和步骤d)的所述样本是根据不同的方法制备的生物样本。

在根据本发明方法的实施方案中，参考样本是从同一受试者在诱导任何外源胁迫前制备的样本，并且优选为来自所述受试者所述生物测试样本的未承受外源胁迫的部分。在另一实施方案中，参考样本是来自已确定放射敏感性(例如，通过临床检测)的不同受试者的样本。

在具体的实施方案中，本发明涉及用于在体外确定受试者的放射敏感性的方法，包括以下步骤：

a)在来自所述受试者的含有细胞的生物测试样本中诱导外源胁迫，

b)在步骤a)的样本中确定至少一种化合物的存在或水平，所述化合物是选自以下的蛋白：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、膜联蛋白1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸以及其组合，

c)将所述至少一种化合物的存在或水平与参考样本中相同化合物的存在或水平进行比较，以及

d)根据步骤c)的比较确定所述受试者的放射敏感性。

在根据本发明方法的实施方案中，在承受或未承受外源胁迫的所述生物样本中差异表达的至少一种化合物选自参与这样机制的蛋白，所述机制包括代谢、能源生产、凋亡、钙结合蛋白、DNA损伤修复和细胞内活性氧(ROS)水平的调节。在另一具体实施方案中，在承受或未承受外源胁迫的样本中差异表达的至少一种化合物选自线粒体蛋白。在一种具体实施方案中，参与细胞内活性氧(ROS)水平调节的蛋白选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、APEX、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)和热休克同源蛋白71kDa(HSC70)。

根据具体实施方案，本发明包括在生物测试样本中确定至少一种蛋白的水平，所述蛋白选自已知参与细胞对胁迫响应的蛋白。在更具体的实施方案中，参与细胞对胁迫响应的蛋白选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)和热休克同源蛋白71kDa(HSC70)。

线粒体异柠檬酸脱氢酶2(NADP+)(氨基酸序列：SEQ ID N°1、mRNA序列：SEQ ID N°6，GeneID：3418；UniProt ID：P48735)也定义为IDH2、ICD-M、IDP、NADP+-特异性ICDH、草酰琥珀酸盐(Oxalosuccinate)脱羧酶或以基因名IDH2命名。它包含N-末端线粒体信号肽并定位于线粒体。它在多种组织中TCA循环调节中发挥重要作用，催化异柠檬酸可逆地转化为α-酮戊二酸、以及NADP+转化为NADPH。所以，因为NADPH是还原型谷胱甘肽(GSH)再生所必须的、以及是负责预防ROS损伤的主要抗氧化剂，所以IDH2是线粒体抗氧化剂途径的关键组分(Lee等人，2004)。IDH2由SIRT3调节，SIRT3能够脱乙酰化然后活化IDH2，导致在线粒体中NADPH水平增加以及还原型谷胱甘肽比氧化型谷胱甘肽的比率增加(Someya等人，2010)。IDH2也可以在调节电离放射诱导的凋亡中发挥重要作用(Lee等人，2007)。

APEX1(氨基酸序列：SEQ ID N°2，mRNA序列：SEQ ID N°7，GeneID：328；UniProt ID：P27695)命名为APEX核酸酶(APEN)、脱嘌呤-脱嘧啶内切核酸酶1(AP内切核酸酶1，APE-1)、REF-1(氧化还原因子-1或基因名命名为APEX1、APE、APE1、APEX、APX、HAP1或REF1)。它是真核细胞中主要的脱嘌呤/脱嘧啶内切核酸酶，其在所有DNA损伤(尿嘧啶、烷基化和氧化、以及脱碱基位点)包括单链断裂的DNA碱基切除修复途径中起着核心作用，并且还通过调控由普遍存在(即，AP-1、Egr-1、NF-kB、p53和HIF)和组织特异性(即，PEBP-2、Pax-5和-8、以及TTF-1)的转录因子直接调节的基因表达而具有共转录活性。此外，其通过在Rac1上的抑制作用来抑制活性氧(ROS)产生进而控制细胞内氧化还原状态，所述Rac1是膜非吞噬(nonphagocytic)NAD(P)H氧化酶系统的调节亚基(Tell等人，2009)。这些活性都位于为两个功能上不同的结构域中：N-末端主要发挥氧化还原活性，而C末端对DNA脱碱基位点发挥酶活性。一些研究表明，APEX1的功能多态性可用作放射诱导的预测性生物标记物。Yin等人证明APEX1多态性可预测在接受明确的(definitive)放射疗法治疗的非小细胞肺癌患者中放射肺炎的风险(Yin等，2011)。Chang-Claude等人证明APE1 148Glu等位基因可能保护免于发展为放射治疗后的急性副作用(Chang-Claude等人，2005)。

热休克同源71kDa蛋白(氨基酸序列：SEQ ID N°3，mRNA序列：SEQ ID N°8，Gene ID：3312；UniProt ID：P11142)命名为热休克70kDa蛋白8或以基因名命名为HSPA8、HSC70、HSP73或HSPA10。它是属于热休克蛋白70(HSP70)家族的组成型表达的分子伴侣。HSC70与HSP70具有一些结构和功能上的相似性，但与HSP70以及其它热休克家族成员相比也具有不同性质。HSC70通过共伴侣的合作来执行其全部功能。其与许多其它分子相互作用以及调节各种细胞功能(Liu等人，2012)。其也参与各种疾病以及可能成为用于诊断的生物标记物和设计、发现和开发用于治疗各种疾病的新药的潜在治疗靶标(Liu等，2012)。研究表明HSC70过表达提供保护免于内源和外源生成的ROS的作用(Chong等人，1998)。其促进Nox蛋白的泛素化和降解，从而减少ROS产生(Chen等人，2012)。

在另一具体的实施方案中，本发明涉及检测至少一种化合物的水平，其中所述化合物是选自腺苷酸激酶(AK2)和膜联蛋白A1(ANX1)的蛋白。

腺苷酸激酶2(氨基酸序列：SEQ ID N°4，mRNA序列：SEQ ID N°：9，GeneID：204；UniProt ID：P54819)命名为AK 2、ATP-AMP磷酸转移酶2或以基因名命名为AK2或ADK2。它定位在线粒体膜间空间，其控制腺嘌呤核苷酸的水平。AK2是存在于从细菌到人类中的古老蛋白家族的成员，其催化ATP+AMP＝2ADP的可逆反应。AK的功能通常描述为维持腺嘌呤核苷酸的恒定浓度和固定比率以及通过核苷酸传感和信号传导来监测细胞能量状态，其是维持和细胞生长所必需的。最近的研究表明，AK2也是折叠蛋白反应(UPR)所需(Burkat等，2011)。在内质网(ER)动态平衡中的改变导致在ER中积累错误折叠/展开的蛋白，为保持ER动态平衡，细胞已经进化出UPR。所述UPR是响应代谢、氧化胁迫以及炎症应答途径中必需的适应性(adaptive)细胞内信号途径。

ANX1(氨基酸序列：SEQ ID N°5、mRNA序列：SEQ ID N°10，Gene ID：301；UniProt ID：P04083)命名为膜联蛋白I、膜联蛋白-1、依钙蛋白(Calpactin)II、依钙蛋白-2、嗜铬粒结合蛋白(Chromobindin)-9、脂皮质蛋白I、磷脂酶A2抑制蛋白、p35或者以基因名命名为ANXA1、ANX1或LPC1。它最早是在20世纪70年代末得以描述。这种37kDa的钙和磷脂结合蛋白是糖皮质激素诱导的类花生酸合成和PLA2的强抑制剂。最近对这种感兴趣分子的生物活性的兴趣已解开膜联蛋白1在以下中的重要功能特性：在多种炎症途径中、对细胞增殖机制、在细胞死亡信号传导的调节中、在凋亡细胞的吞噬清除中、以及最重要的癌变过程中(Lim等，2007)。

表1总结鉴定的蛋白及其参考

在本申请中，通过具体的氨基酸序列以及由相应的特定核酸序列，优选为mRNA或cDNA核酸序列来限定蛋白。本发明包括检测所述蛋白或核酸，包括所述具有选自SEQ ID N°1至SEQ ID N°5的序列的蛋白的任何天然变异体、或具有选自SEQ ID N°6至SEQ ID N°10的序列的核酸分子的变体。本发明还包括检测核酸分子的特定片段，所述核酸分子具有与选自SEQ ID N°6至SEQ ID N°10的序列的片段相对应的序列，其中所述核酸片段对应所述核酸分子的编码片段，或其中所述核酸片段编码具有选自SEQ ID N°1至SEQ ID N°5序列的蛋白的特定片段。

根据本发明的方法包括检测蛋白的变体，所述蛋白的变体包含或具有与选自SEQ ID N°1至SEQ ID N°5的序列具有至少80％、优选90％、更优选95％以及甚至更优选98％同一性的氨基酸序列。本发明包括检测mRNA的变体，其包含或具有与选自SEQ ID N°6至SEQ ID N°10的序列具有至少80％、优选90％、更优选95％以及甚至更优选98％同一性的核苷酸序列。如本文所使用，术语“同一性”在本文是指两条氨基酸序列或核酸序列在比较窗口中是相同的(即，在氨基酸以氨基酸计，或在核酸中以及核酸碱基计)。

术语“序列百分比同一性”是通过以下来计算：在比较窗口中比较两条最佳比对的序列，确定在两条序列中存在相同的氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数(即，窗口尺寸)，然后将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。氨基酸序列的序列同一性百分比也可以用BLAST软件使用默认或用户定义的参数计算出来。当应用于多肽时，术语基本相同是指当两条肽序列最佳比对时共享至少约80％序列同一性，优选至少约90％的序列同一性，更优选至少约95％的序列同一性或更多(例如，99％的序列同一性)。如本文所用，“衍生物”或“序列源自于”是指具有至少80％同一性，更优选至少90％同一性，甚至更优选至少95％同一性或更多，如99％同一性的氨基酸序列。

根据优选的实施方案，本发明包括在生物样本中确定选自以下的化合物的存在或水平：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、其特定片段、其编码核酸及其组合。

根据另一实施方案，本发明包括在生物样本中确定选自以下的化合物的存在或水平：DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、其特定片段、其编码核酸及其组合。

根据另一实施方案，本发明包括在生物样本中确定选自以下的化合物的存在或水平：热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、其特定片段、其编码核酸及其组合。

根据另一实施方案，本发明包括在生物样本中确定选自以下的化合物的存在或水平：腺苷酸激酶(AK2)、其特定片段、其编码核酸及其组合。

根据另一实施方案，本发明包括在生物样本中确定选自以下的化合物的存在或水平：膜联蛋白A1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸及其组合。