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1、10申请公布号CN104099361A43申请公布日20141015CN104099361A21申请号201410328514X22申请日20140710C12N15/70200601C12N15/37200601C12N15/1020060171申请人青岛大学附属医院地址266000山东省青岛市市南区江苏路16号检验科72发明人宗金宝王昌媛孙桂荣74专利代理机构北京众合诚成知识产权代理有限公司11246代理人龚燮英54发明名称一种HPV16AE7/HUHSP70融合蛋白质的制备方法57摘要本发明公开了一种HPV16AE7/HUHSP70融合蛋白质的制备方法，将野生型E7WE7蛋白的PRB结合。
2、位点CYS24GLY，GLU26GLY，CKII位点SER31GLY，SER32GLY以及锌指结合区CYS58GLY，CYS91GLY突变，同时在蛋白E7蛋白N端和C端分别添加E7特异性的CTL抗原表位1120AA，4957AA和TH辅助细胞抗原表位3067AA，获得改造优化后的HPV16ME7基因，构建PET30AME7原核表达载体，构建好HUHSP70的原核表达载体PET30AHUHSP70，将ME7与HUHSP70融合，插入原核表达载体，构建原核表达质粒PET30AME7/HUHSP70，在大肠杆菌BL21DE3进行蛋白诱导表达，用SDSPAGE和免疫印迹法鉴定三种蛋白的表达活性，然后进。
3、行重组蛋白的可溶性分析及纯化。具有简便、易行、通用性强，且治疗肿瘤效果好的优点。51INTCL权利要求书2页说明书5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书5页10申请公布号CN104099361ACN104099361A1/2页21一种HPV16AE7/HUHSP70融合蛋白质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤将野生型E7蛋白的PRB结合位点CYS24GLY，GLU26GLY，CKII位点SER31GLY，SER32GLY以及锌指结合区CYS58GLY，CYS91GLY突变，同时在蛋白E7蛋白N端和C端分别添加E7特异性的CTL抗原表位1120AA，4957A。
4、A和TH辅助细胞抗原表位3067AA，获得改造优化后的HPV16ME7基因，构建PET30AME7原核表达载体，构建好HUHSP70的原核表达载体PET30AHUHSP70，将ME7与HUHSP70融合，插入原核表达载体，构建原核表达质粒PET30AME7/HUHSP70，在大肠杆菌BL21DE3进行蛋白诱导表达，用SDSPAGE和免疫印迹法鉴定三种蛋白的表达活性，然后进行重组蛋白的可溶性分析及纯化。2根据权利要求1所述的HPV16AE7/HUHSP70融合蛋白质的制备方法，其特征在于通过基因合成法合成ME7基因，利用ME7基因上游引物P1和下游引物P2，PCR扩增ME7基因并将其克隆到PMD。
5、18T，然后再亚克隆至原核表达载体PET30ANOVAGEN,DARMSTADT,GERMANY构建PET30AME7，用NDEI与BAMHI双酶切ME7和表达载体PET30A，进行琼脂糖凝胶电泳；分别回收目的片段和表达载体，以T4DNA连接酶于16连接2H，转化感受态大肠杆菌DH5；筛选阳性克隆，提取质粒及酶切鉴定，构建表达质粒PET30AME7；以PMSHSP70质粒为模板，利用HUHSP70上游引物P1和下游引物P2，PCR扩增获得HUHSP70基因GENBANKNM_005345，BAMHI与XHOI双酶切HUHSP70和PET30A，酶切片段连接构建PET30AHUHSP70；用OV。
6、ERLAPPCR的方法将ME7与HUHSP70连接，按以上方法构建不含ME7基因终止密码子的PET30AME7/HUHSP70；酶切鉴定、DNA测序验证构建载体的正确性；ME7基因上游引物P15GCCATATGATGGACAGCTCAGAGGAGG3NDEIME7基因下游引物P25CGGGATCCGGTTACAATATTGTAATG3BAMHIHUHSP70上游引物P15GCGGATCCCATGGCCAAAGCCGCGGC3BAMHIHUHSP70下游引物P25CGCTCGAGCTAATCTACCTCCTCAATGGTG3XHOI。3根据权利要求2所述的HPV16AE7/HUHSP70融合蛋白。
7、质的制备方法，其特征在于挑选含有PET30AME7，PET30AHUHSP70，PET30AME7/HUHSP70质粒的大肠杆菌BL21DE3阳性克隆，接种至含100G/ML卡那霉素的LB培养液，37振荡培养过夜，取过夜菌以1100接种500ML100G/ML卡那霉素的LB培养液，37剧烈振荡180R/MIN培养至OD60010，加入01M的异丙基D硫代半乳糖苷ISOPROPLYDTHIOGALACTOSIDE，IPTG至终浓度为03MMOL/L，20诱导表达过夜。4根据权利要求3所述的HPV16AE7/HUHSP70融合蛋白质的制备方法，其特征在于取1ML诱导后菌液，离心，去上清，加入100。
8、LTE和100L2蛋白电泳缓冲液，煮沸10MIN。行SDSPAGE，取出凝胶将其从凝胶电转印至硝酸纤维素膜，电转印条件4，250MA，3H；丽春红S复染5MIN，水中脱色2MIN，标记蛋白质MAKER的位置。5ML含5脱脂奶粉的TTBS缓冲液01TWEEN20，100MMOL/LTRISC1，09NAC1，PH75，室温下封闭2H，用TTBS缓冲液稀释ANTIHISTAGIGG或MOUSEANTIHUMANE7IGG、MOUSEANTIHUMANHSP70IGG，室温孵育2H，TTBS缓冲液洗涤，共3次，每次10MIN，二抗为GOATANTIMOUSEIGGHRP，室温孵育2H，洗涤同上，采用。
9、DAB显色方案显色。5根据权利要求4所述的HPV16AE7/HUHSP70融合蛋白质的制备方法，其特征在于500ML培养液离心，沉淀重悬于25ML冰冷的STE液，加入25L溶菌酶，冰浴15MIN，超声裂解细菌，至菌体90裂解，412000G离心15MIN，分别取上清和沉淀，行SDSPAGE；保存权利要求书CN104099361A2/2页3剩余上清液以备活性分析和蛋白纯化，将不溶的包涵体沉淀组分存于冰上，备蛋白复性。权利要求书CN104099361A1/5页4一种HPV16AE7/HUHSP70融合蛋白质的制备方法技术领域0001本发明涉及一种HPV16AE7/HUHSP70融合蛋白质的制备方法。
10、。背景技术0002大肠杆菌表达系统，具有生长快，遗传背景清晰、表达水平高及成本低的特点，是理想的外源蛋白表达系统，但是，这个表达系统最大的不足是外源蛋白往往不能正确折叠而以无活性的包涵体形式存在，包涵体再折叠的产率通常很低。寻找简便、易行、通用性强的改善或防止包涵体形成的方法是目前大肠杆菌表达体系的一个难点和瓶颈环节。发明内容0003本发明主要是解决现有技术所存在的技术问题，从而提供一种简便、易行、通用性强，且治疗肿瘤效果好的HPV16AE7/HUHSP70融合蛋白质的制备方法。0004本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的一种HPV16AE7/HUHSP70融合蛋白质的制备方法。
11、，包括以下步骤将野生型E7蛋白的PRB结合位点CYS24GLY，GLU26GLY，CKII位点SER31GLY，SER32GLY以及锌指结合区CYS58GLY，CYS91GLY突变，同时在蛋白E7蛋白N端和C端分别添加E7特异性的CTL抗原表位1120AA，4957AA和TH辅助细胞抗原表位3067AA，获得改造优化后的HPV16ME7基因，构建PET30AME7原核表达载体，构建好HUHSP70的原核表达载体PET30AHUHSP70，将ME7与HUHSP70融合，插入原核表达载体，构建原核表达质粒PET30AME7/HUHSP70，在大肠杆菌BL21DE3进行蛋白诱导表达，用SDSPAGE。
12、和免疫印迹法鉴定三种蛋白的表达活性，然后进行重组蛋白的可溶性分析及纯化。0005作为优选，通过基因合成法合成ME7基因，利用ME7基因上游引物P1和下游引物P2，PCR扩增ME7基因并将其克隆到PMD18T，然后再亚克隆至原核表达载体PET30ANOVAGEN,DARMSTADT,GERMANY构建PET30AME7，用NDEI与BAMHI双酶切ME7和表达载体PET30A，进行琼脂糖凝胶电泳；分别回收目的片段和表达载体，以T4DNA连接酶于16连接2H，转化感受态大肠杆菌DH5；筛选阳性克隆，提取质粒及酶切鉴定，构建表达质粒PET30AME7；以PMSHSP70质粒为模板，利用HUHSP70。
13、上游引物P1和下游引物P2，PCR扩增获得HUHSP70基因GENBANKNM_005345，BAMHI与XHOI双酶切HUHSP70和PET30A，酶切片段连接构建PET30AHUHSP70；用OVERLAPPCR的方法将ME7与HUHSP70连接，按以上方法构建不含ME7基因终止密码子的PET30AME7/HUHSP70；酶切鉴定、DNA测序验证构建载体的正确性；0006ME7基因上游引物P15GCCATATGATGGACAGCTCAGAGGAGG3NDEI0007ME7基因下游引物P25CGGGATCCGGTTACAATATTGTAATG3BAMHI0008HUHSP70上游引物P15G。
14、CGGATCCCATGGCCAAAGCCGCGGC3BAMHI0009HUHSP70下游引物P25CGCTCGAGCTAATCTACCTCCTCAATGGTG3XHOI。0010作为优选，挑选含有PET30AME7，PET30AHUHSP70，PET30AME7/HUHSP70质说明书CN104099361A2/5页5粒的大肠杆菌BL21DE3阳性克隆，接种至含100G/ML卡那霉素的LB培养液，37振荡培养过夜，取过夜菌以1100接种500ML100G/ML卡那霉素的LB培养液，37剧烈振荡180R/MIN培养至OD60010，加入01M的异丙基D硫代半乳糖苷ISOPROPLYDTHIOGA。
15、LACTOSIDE，IPTG至终浓度为03MMOL/L，20诱导表达过夜。0011作为优选，取1ML诱导后菌液，离心，去上清，加入100LTE和100L2蛋白电泳缓冲液，煮沸10MIN。行SDSPAGE，取出凝胶将其从凝胶电转印至硝酸纤维素膜，电转印条件4，250MA，3H；丽春红S复染5MIN，水中脱色2MIN，标记蛋白质MAKER的位置。5ML含5脱脂奶粉的TTBS缓冲液01TWEEN20，100MMOL/LTRISC1，09NAC1，PH75，室温下封闭2H，用TTBS缓冲液稀释ANTIHISTAGIGG或MOUSEANTIHUMANE7IGG、MOUSEANTIHUMANHSP70IG。
16、G，室温孵育2H，TTBS缓冲液洗涤，共3次，每次10MIN，二抗为GOATANTIMOUSEIGGHRP，室温孵育2H，洗涤同上，采用DAB显色方案显色。0012作为优选，500ML培养液离心，沉淀重悬于25ML冰冷的STE液，加入25L溶菌酶，冰浴15MIN，超声裂解细菌，至菌体90裂解，412000G离心15MIN，分别取上清和沉淀，行SDSPAGE；保存剩余上清液以备活性分析和蛋白纯化，将不溶的包涵体沉淀组分存于冰上，备蛋白复性。0013本发明HPV16AE7/HUHSP70融合蛋白质的制备方法的有益效果是具有简便、易行、通用性强，且治疗肿瘤效果好的优点。具体实施方式0014一种HPV。
17、16AE7/HUHSP70融合蛋白质的制备方法，包括以下步骤00151HPV16ME7基因的优化改造及基因克隆0016在E7基因的两侧增加E7特异性的MHCI类和MHCII类抗原表位，在E7基因PRB结合位点CYS24GLY，GLU26GLY，与转化有关的CKII磷酸化位点SER31GLY，SER32GLY以及锌指结合区CYS58GLY，CYS91GLY突变，通过基因合成法获得优化改造后的E7基因ME7，实现即可增强细胞免疫和体液免疫应答又可消除其转化活性的目的。00172PET30AME7，PET30AHUHSP70，PET30AME7/HUHSP70的构建0018通过上海捷瑞生物科技有限公。
18、司基因合成法合成ME7基因，利用ME7基因上游引物P1和下游引物P2，PCR扩增ME7基因并将其克隆到PMD18T，然后再亚克隆至原核表达载体PET30ANOVAGEN,DARMSTADT,GERMANY构建PET30AME7，用NDEI与BAMHI双酶切ME7和表达载体PET30A，进行琼脂糖凝胶电泳。分别回收目的片段和表达载体，以T4DNA连接酶于16连接2H，转化感受态大肠杆菌DH5。筛选阳性克隆，提取质粒及酶切鉴定，构建表达质粒PET30AME7。以PMSHSP70质粒美国西北大学RICHARDIMORIMOTO教授惠赠，内含HUHSP70的完整基因序列为模板，利用HUHSP70上游引。
19、物P1和下游引物P2，PCR扩增获得HUHSP70基因GENBANKNM_005345，BAMHI与XHOI双酶切HUHSP70和PET30A，酶切片段连接构建PET30AHUHSP70。用OVERLAPPCR的方法将ME7与HUHSP70连接，按以上方法构建不含ME7基因终止密码子的PET30AME7/HUHSP70。酶切鉴定、DNA测序验证构建载体的正确性。0019ME7基因上游引物P15GCCATATGATGGACAGCTCAGAGGAGG3NDEI0020ME7基因下游引物P25CGGGATCCGGTTACAATATTGTAATG3BAMHI说明书CN104099361A3/5页600。
20、21HUHSP70上游引物P15GCGGATCCCATGGCCAAAGCCGCGGC3BAMHI0022HUHSP70下游引物P25CGCTCGAGCTAATCTACCTCCTCAATGGTG3XHOI00233融合蛋白在大肠杆菌的诱导表达0024挑选含有PET30AME7，PET30AHUHSP70，PET30AME7/HUHSP70质粒的大肠杆菌BL21DE3阳性克隆，接种至含100G/ML卡那霉素的LB培养液，37振荡培养过夜，取过夜菌以1100接种500ML100G/ML卡那霉素的LB培养液，37剧烈振荡180R/MIN培养至OD60010，加入01M的异丙基D硫代半乳糖苷ISOPRO。
21、PLYDTHIOGALACTOSIDE，IPTG至终浓度为03MMOL/L，20诱导表达过夜。00254免疫印迹鉴定融合蛋白的表达0026取1ML诱导后菌液，离心，去上清，加入100LTE和100L2蛋白电泳缓冲液，煮沸10MIN。行SDSPAGE，取出凝胶将其从凝胶电转印至硝酸纤维素膜，电转印条件4，250MA，3H；丽春红S复染5MIN，水中脱色2MIN，标记蛋白质MAKER的位置。5ML含5脱脂奶粉的TTBS缓冲液01TWEEN20，100MMOL/LTRISC1，09NAC1，PH75，室温下封闭2H，用TTBS缓冲液稀释ANTIHISTAGIGG或MOUSEANTIHUMANE7IG。
22、G、MOUSEANTIHUMANHSP70IGG，室温孵育2H，TTBS缓冲液洗涤，共3次，每次10MIN，二抗为GOATANTIMOUSEIGGHRP，室温孵育2H，洗涤同上，采用DAB显色方案显色。00275融合蛋白的可溶性分析与纯化0028500ML培养液离心，沉淀重悬于25ML冰冷的STE液，加入25L溶菌酶，冰浴15MIN，超声裂解细菌，至菌体90裂解，412000G离心15MIN，分别取上清和沉淀，行SDSPAGE。保存剩余上清液以备活性分析和蛋白纯化，将不溶的包涵体沉淀组分存于冰上，备蛋白复性。0029小鼠蛋白疫苗免疫方案0030将68周雌性C57BL/6小鼠随机分为四组，每组8。
23、只，根据纯化后的重组蛋白浓度，以2NMOL蛋白量，分别将02ML的PBS、ME7、HUHSP70、ME7/HUHSP70注射于小鼠股四头肌内，10天后加强免疫1次。0031ELISA法检测免疫小鼠血清中E7特异性抗体水平0032于加强免疫后第10天，尾静脉取100L血样，收集于15MLEP管中，离心分离血清备用。微量反应板上每孔加入1G/ML的GSTE7蛋白过夜孵育，5W/VBSA封闭1H，加入100L120稀释的血清4过夜，加入13000稀释的100LGOATANTIMOUSEIGGHRP，邻苯二胺OPD底物显色，2MH2SO4终止反应，酶标仪于490NM波长检测其光密度。0033流式细胞术。
24、分析E7特异性CD4T、CD8T细胞的活化情况0034于加强免疫后第10天，分离小鼠脾细胞于96孔板中，加入IL2刺激T细胞生长，分别加入E74957RAHYNIVTF,2G/ML和E73067肽NDSSEEEDEDGPAGQAEPDRAHTNIVTFC,2G/ML刺激，37孵育12小时，细胞收集前的6小时加入BDGOLGISTOP，收集细胞，05G/L封闭蛋白24G2封闭30MIN，加入GOATANTIMOUSECD4FITC或CD8FITC。表面染色30MIN后，加入CYTOX/CYTOPERM穿膜液，冰浴30MIN，在CD4T细胞的管中分别加入20G/ML的GOATANTIMOUSEIF。
25、NPE检测TH1细胞和GOATANTIMOUSEIL4PE抗体检测TH2细胞，在检测CD8T细胞的管中分别加入20G/ML的GOATANTIMOUSEIFNPE，通过BD公司的FACSCALIBAR流式细胞仪检测。ELISPOT法分析E7特异性CD4T、说明书CN104099361A4/5页7CD8T细胞的活化情况0035细胞刺激收集方法同上，用100LPBS稀释的ANTIMOUSEIFN或IL45G/ML包被贴有PVDF膜的微孔板上，4放置过夜。10胎牛血清室温封闭2小时，调细胞数依次为1106，5105，25105，和125105个，每孔液体为100L并设三个复孔，37，5CO2的条件下孵。
26、育40小时。每孔加入生物素标记的25G/ML的IFN单克隆抗体，4放置过夜，加入100LHRP连接的亲和素，室温孵育1H。加入100L底物溶液AECCHROMOGEN，监测颜色斑点的形成。双蒸水洗涤，终止反应，室温风干，用ELISPOTREADER进行结果分析，检测分泌IFN的TH1细胞数及分泌IL4的E7特异性TH2细胞数目与IFN的E7特异性CD8T细胞数目。0036HPV16ME7/HUHSP70蛋白疫苗的免疫原性与细胞免疫学活性检测0037加强免疫后的第10天，经尾静脉取血，收集血清备用，ELISA法检测免疫血清中E7特异性抗体水平。加强免疫后的第10天，分离小鼠脾细胞，体外经2G/M。
27、LE74957肽4957AA，RAHYNIVTF，MHCI类限制性表位和2G/MLE73067肽3067AA，NDSSEEEDEDGPAGQAEPDRAHTNIVTF，MHCII类限制性表位分别刺激后，利用流式细胞术进行细胞表面分子染色和细胞内分子穿膜染色，检测E7特异性CD8T杀伤细胞和CD4T辅助细胞反应，ELISPOT实验检测分泌IFN的E7特异性CD8T细胞数目和分泌IL4的E7特异性CD4T细胞数目。0038体外杀伤试验0039加强免疫后的第10天，分离小鼠脾细胞与体外经CO60照射的TC1或丝裂霉素C处理的TC1共同孵育后，添加刀豆蛋白CONA和IL2刺激，5天后收集成活的脾细胞用。
28、作杀伤效应细胞，表达E7蛋白的TC1用作靶细胞，利用非放射性污染的乳酸脱氢酶LDH释放法检测E7特异性的CD8T细胞对TC1的杀伤效应。0040体内肿瘤预防试验0041肿瘤预防实验中，所述方法进行蛋白疫苗肌肉免疫，加强免疫后的第10天在小鼠背部皮下接种75104个HPV16E6/E7阳性的TC1肿瘤细胞，接种后每隔两天观察小鼠成瘤情况，测量记录肿瘤体积大小，观察期限为152个月。0042体内肿瘤治疗试验0043肿瘤治疗实验中，预先在小鼠背部皮下接种75104个TC1肿瘤细胞，5天后按上述方法进行蛋白疫苗免疫和加强免疫，每隔2天观察小鼠成瘤情况，测量记录肿瘤体积大小。0044野生型WE7GENE。
29、序列0045ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAGTGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCA。
30、TAA0046改造后的ME7GENE序列0047ATGTACATGCTCGATCTGCAGCCCGAGACTACCGCCGCTTACATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACGGTTATGGACAATTAAGTGACGGCGGAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTGGCTGCAAGT说明书CN104099361A5/5页8GTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGGGTCCCATCTGTTCTCAGAAACCAGCCGCTTACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTAA0048上述实施例，只是本发明的一个实例，并不是用来限制本发明的实施与权利范围，凡与本发明权利要求所述内容相同或等同的技术方案，均应包括在本发明保护范围内。说明书CN104099361A。