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1、10申请公布号CN104215768A43申请公布日20141217CN104215768A21申请号201410386506022申请日20140807G01N33/68200601C12Q1/68200601C12Q1/04200601C12N15/1120060171申请人北京大学地址100871北京市海淀区颐和园路5号北京大学金光生命科学大楼430室申请人北京大学深圳研究生院北京瑞普晨创科技有限公司72发明人邓宏魁刘海松朱迪聪杨欢梁振74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅54发明名称SUSD2蛋白作为标记物的用途57摘要本发明公开了SUSD2蛋白作为标记物的用。
2、途，具体为SUSD2蛋白作为标记物在鉴定、筛选或分选胰腺内分泌前体细胞和/或新生的胰腺内分泌细胞中的应用；以及编码所述SUSD2蛋白的前体蛋白的MRNA作为标记物在鉴定胰腺内分泌前体细胞和/或新生的胰腺内分泌细胞中的应用。本发明通过分析人多能干细胞定向诱导分化来源的胰腺内胚层细胞的基因表达，发现SUSD2基因在胰腺内分泌前体细胞及新生的胰腺内分泌细胞中富集表达，而且其编码的蛋白为细胞膜上的受体蛋白，以该蛋白作为标记物可以用于鉴定、筛选或分选胰腺内分泌前体细胞及新生的胰腺内分泌细胞，对研究各发育阶段的胰腺相关细胞具有重要意义。51INTCL权利要求书1页说明书13页序列表7页附图8页19中华人民。
3、共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书13页序列表7页附图8页10申请公布号CN104215768ACN104215768A1/1页21一种分选或辅助分选待测细胞群体中的胰腺内分泌前体细胞或新生的胰腺内分泌细胞的方法，包括如下步骤检测待测细胞群体中的细胞是否表达SUSD2基因，若某些细胞表达SUSD2基因，则某些细胞为或候选为胰腺内分泌前体细胞或新生的内分泌细胞；若某些细胞不表达SUSD2基因，则某些细胞不为或候选不为胰腺内分泌前体细胞或新生的内分泌细胞；所述SUSD2基因的核苷酸序列为序列表中序列2。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述检测待测细胞群体中的细胞是否表达。
4、SUSD2基因是通过检测待测细胞群体中的细胞是否含有SUSD2基因表达的蛋白，所述检测待测细胞群体中的细胞是否含有SUSD2基因表达的蛋白的方法为如下1或2或31免疫荧光抗体法检测，采用抗体为抗SUSD2单抗；2流式分析检测，采用抗体为抗SUSD2单抗；3磁珠分选，采用抗体为抗SUSD2单抗。3根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述待测细胞为胰腺内胚层细胞。4根据权利要求13中任一所述的方法，其特征在于所述胰腺内胚层细胞为人源胰腺内胚层细胞。5SUSD2蛋白或其编码基因或编码所述SUSD2蛋白的前体蛋白的MRNA作为标记物在鉴定、筛选或分选胰腺内分泌前体细胞和/或新生的胰腺内分泌细胞中的。
5、应用；所述SUSD2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列1所示；所述SUSD2蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2所示。6能够与所述SUSD2蛋白特异性结合的抗体在制备鉴定、筛选或分选胰腺内分泌前体细胞和/或新生的胰腺内分泌细胞试剂中的应用。7如权利要求6所述的应用，其特征在于所述抗体携带荧光标记；所述抗体为单抗。8如权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述应用为从胰腺内胚层细胞中筛选或分选胰腺内分泌前体细胞和/或新生的胰腺内分泌细胞；所述筛选或分选的方法为免疫磁珠分离法及流式细胞分选法；所述鉴定的方法为免疫荧光抗体法及流式细胞分析法。9能够与编码所述SUSD2蛋白的前体蛋白的MRNA特异性结合。
6、的引物对、探针或它们的互补链在制备鉴定胰腺内分泌前体细胞和/或新生的内分泌细胞试剂中的应用。10如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述引物对由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成。权利要求书CN104215768A1/13页3SUSD2蛋白作为标记物的用途技术领域0001本发明涉及生物技术领域，尤其涉及SUSD2蛋白作为标记物的用途。背景技术0002人多能干细胞来源的胰腺BETA细胞能够为糖尿病特别是I型糖尿病的细胞替代治疗提供充足的供体胰岛细胞来源。此外，人多能干细胞向胰腺BETA细胞的定向诱导分化也能够为研究人胰腺发育过程提供一个体外研究模型。通过模。
7、拟体内发育过程，人多能干细胞向胰腺BETA细胞定向诱导分化主要包括以下几个分步阶段胚内内胚层、肠管、前肠后部、胰腺内胚层和胰腺内分泌细胞。其中，胰腺内胚层阶段的细胞为混杂细胞，通常包括胰腺前体细胞、胰腺内分泌前体细胞以及新生的胰腺内分泌细胞等。目前主要通过胰腺发育相关基因的表达来指征细胞命运。胰腺前体细胞主要由相关基因如PDX1、HNF1B、SOX9、NKX61、HNF6等基因的表达来指征。胰腺内分泌前体细胞最主要的一个标记基因是NGN3，但由于其瞬时表达特征，通常会结合其下游基因如NKX22、NEUROD1等基因的表达以及CHROMOGRANINA、INSULIN、GLUCAGON等内分泌相。
8、关基因的不表达来指征胰腺内分泌前体细胞命运。虽然这些标记基因的表达虽然可以用来指征特定细胞的命运，但是由于其都为转录因子或分泌蛋白等，通常定位于胞浆或细胞核内，因而无法利用这些蛋白的表达来分离纯化特定的细胞类群特别是人胰腺内分泌前体细胞和新生的胰腺内分泌细胞，从而对其分子特征进行更为详细的研究。0003目前，人多能干细胞能够通过定向诱导分化得到胰腺前体细胞，但是这类细胞在体外向功能成熟的胰腺BETA细胞的分化效率低。虽然，将人多能干细胞来源的胰腺前体细胞移植到免疫缺陷小鼠体内后，能够得到功能成熟的胰岛细胞，但是由于胰腺前体细胞具有一定的增殖能力，其致瘤性限制了其向临床运用的推广。相较于胰腺前体。
9、细胞，功能成熟的胰腺BETA细胞是更为理想的供体细胞来源。但如何在体外将胰腺前体细胞诱导分化成为功能成熟的胰腺BETA细胞大大限制了糖尿病细胞替代治疗方案的实现，而在胰腺前体细胞向胰腺BETA细胞分化的过程中，正确的胰腺内分泌前体细胞的高效诱导分化的实现是最为首要的一步。通过对小鼠等模式动物的研究，大大促进了对胰腺BETA细胞发育过程的了解，这些研究对指导体外胰腺BETA细胞的定向分化起了决定性的作用。尽管如此，针对胰腺内分泌前体细胞命运特化、不同内分泌细胞之间的命运选择的研究仍然较少，此外，人与小鼠等模式动物之间也存在一定的物种差异性，因此，如果能够找到相关分子标记来直接分离特定发育阶段的胰。
10、腺相关细胞进行研究的话，能够大大加快体外功能成熟的胰腺BETA细胞的获得。发明内容0004本发明的一个目的是提供一种分选或辅助分选待测细胞群体中的胰腺内分泌前体细胞或新生的内分泌细胞的方法。0005本发明提供的方法，包括如下步骤检测待测细胞群体中的细胞是否表达SUSD2说明书CN104215768A2/13页4基因，若某些细胞表达SUSD2基因，则某些细胞为或候选为胰腺内分泌前体细胞或新生的内分泌细胞；若某些细胞不表达SUSD2基因，则某些细胞不为或候选不为胰腺内分泌前体细胞或新生的内分泌细胞；0006所述SUSD2基因的核苷酸序列为序列表中序列2。0007上述方法中，所述检测待测细胞群体中的。
11、细胞是否表达SUSD2基因是通过检测待测细胞群体中的细胞是否含有SUSD2基因表达的蛋白，所述检测待测细胞群体中的细胞是否含有SUSD2基因表达的蛋白的方法为如下1或2或300081免疫荧光抗体法检测，采用抗体为抗SUSD2单抗；00092流式分析检测，采用抗体为抗SUSD2单抗；00103磁珠分选，采用抗体为抗SUSD2单抗。0011上述方法中，所述待测细胞为胰腺内胚层细胞。0012上述方法中，所述胰腺内胚层细胞为人源胰腺内胚层细胞。0013本发明另一个目的是通过分析胰腺内胚层细胞的基因表达，发现SUSD2基因在胰腺分泌前体细胞及新生的分泌细胞中富集表达，即该基因表达的SUSD2蛋白为两者的。
12、分子标记。0014基于上述发现，本发明提供了SUSD2蛋白作为标记物在鉴定、筛选或分选胰腺内分泌前体细胞和/或新生的胰腺内分泌细胞中的应用，所述SUSD2蛋白的氨基酸序列如序列1所示。0015所述SUSD2蛋白在NCBI的登录号为NCBIREFERENCESEQUENCENP_0625471。0016所述新生的胰腺内分泌细胞在人多能干细胞向胰腺BETA细胞定向诱导分化的过程中，产生的一群激素包括INSULIN，GLUCAGON，GHRELIN，PANCREATICPOLYPEPTIDE，SOMATOSTATIN等阳性的细胞，这一群细胞通常是多激素共表达的，与成熟的胰腺内分泌细胞相比功能并不成熟。
13、。在体内发育过程中，所述新生的胰腺内分泌细胞主要是指胚胎发育时期功能并不成熟的胰腺内分泌细胞。0017本发明还提供了能够与所述SUSD2蛋白特异性结合的抗体在制备鉴定、筛选或分选胰腺内分泌前体细胞和/或新生的胰腺内分泌细胞试剂中的应用。0018所述SUSD2蛋白是基因SUSD2表达的蛋白，它既不是转录因子，也不是分泌蛋白，而是位于细胞膜上的受体蛋白。0019通过免疫荧光抗体法检测待测细胞是否含有SUSD2蛋白，从而确定待测细胞是否为胰腺分泌前体细胞或新生的胰腺内分泌细胞。0020所述的抗体可以是完整的抗体分子、嵌合抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、重链和轻链的同二聚体和异二聚体。
14、，以及抗原结合片段和衍生物。完整的抗体分子可以是多抗或单抗，优选为单抗。0021如上所述，一般可以通过免疫荧光抗体法检测SUSD2蛋白，所述抗体或抗该抗体的二抗需携带相应的荧光标识。0022所述胰腺内分泌前体细胞和新生的胰腺内分泌细胞是指胰腺内胚层细胞中的一群细胞，在适当条件下能够产生功能成熟的胰腺内分泌细胞。0023所述的人胰腺内胚层细胞主要是指人多能干细胞向胰腺BETA细胞定向诱导分化过程中胰腺内胚层阶段的细胞，或新鲜分离的及经离体培养的相应发育阶段的人胚胎胰腺说明书CN104215768A3/13页5组织细胞，主要包括胰腺前体细胞、胰腺内分泌前体细胞以及新生的胰腺内分泌细胞，本发明的主要。
15、目的在于从胰腺内胚层细胞群中筛选或分选胰腺内分泌前体细胞以及新生的胰腺内分泌细胞。0024所述胰腺内胚层细胞的来源包括1、人多能干细胞定向诱导分化获得；2、从分离的人胚胎胰腺组织获取；3、分离的人胚胎胰腺内胚层细胞经体外培养后的细胞。0025所述筛选或分选的方法主要采用免疫磁珠分离法或流式分选法。0026SUSD2基因表达过程中首先转录成MRNA，然后再翻译成SUSD2蛋白前体蛋白，再经过加工后产生成熟的SUSD2蛋白。0027基于以上原因，本发明还提供了编码所述SUSD2蛋白的前体蛋白的MRNA作为标记物在鉴定胰腺内分泌前体细胞和/或新生的胰腺内分泌细胞中的应用。0028本发明又提供了能够与。
16、MRNA特异性结合的引物、探针或它们的互补链在制备鉴定胰腺内分泌前体细胞和/或新生的胰腺内分泌细胞试剂中的应用。0029所述引物可以是扩增整个MRNA的引物，也可以是扩增MRNA特征区域的引物，所述探针是识别MRNA特定区域的核苷酸，一般携带标识。0030根据实施例的记载，本发明提供了一对具体扩增所述MRNA的引物，如下所示0031上游引物GGCACCGCCAACACCTCA0032下游引物GCGTGGGCAGCGACTTGA。0033所述鉴定的方法可以采用荧光定量PCR。0034本发明通过分析内胚层细胞的基因表达，发现SUSD2基因在胰腺分泌前体细胞及新生的胰腺内分泌细胞中富集表达，而且其编。
17、码的蛋白为细胞膜上的受体蛋白，以该蛋白作为标记物可以用于鉴定、筛选或分选胰腺内分泌前体细胞及新生的胰腺内分泌细胞，对研究各发育阶段的胰腺相关细胞具有重要意义。附图说明0035图1为人多能干细胞定向分化产生胰腺内胚层细胞。A人多能干细胞向胰腺BETA细胞定向诱导分化示意图；B免疫荧光染色检测分化第四阶段末胰腺内胚层相关蛋白及标记NGN3基因的绿色荧光蛋白EGFP的表达的染色图。0036图2为流式分析法鉴定胰腺内胚层中的NGN3EGFP细胞为胰腺内分泌前体细胞或新生的内分泌细胞的结果图。A流式分析法检测胰腺内胚层细胞中NGN3EGFP及NGN3，NKX22，NEUROD1，CHROMOGRANIN。
18、ACHGA等胰腺内分泌相关蛋白的表达；B流式分析法检测胰腺内胚层细胞中NGN3EGFP与胰腺前体细胞标记蛋白PDX1的表达，表明NGN3EGFP细胞低表达或不表达胰腺前体相关蛋白PDX1。0037图3为MRNA测序分析分选获得的NGN3EGFP细胞、NGN3EGFP细胞中胰腺相关基因的表达情况，表明NGN3EGFP的胰腺内分泌前体细胞及新生的内分泌细胞群相对富集胰腺内分泌相关基因的表达。0038图4为免疫有关染色检测SUSD2和NGN3EGFP的共染情况，说明SUSD2可以用来标记人多能干细胞分化来源的NGN3EGFP细胞。0039图5为流式分析检测人多能干细胞来源的胰腺内胚层细胞中SUSD2。
19、及胰腺发育相关蛋白的表达情况分析图，说明SUSD2可用于标记体外分化得到的胰腺内分泌前体细胞说明书CN104215768A4/13页6及新生的内分泌细胞。A流式分析检测胰腺内胚层细胞中SUSD2及胰腺内分泌相关蛋白NGN3，NKX22，NEUROD1，CHROMOGRANINACHGA等的表达情况；B流式分析检测胰腺内胚层细胞中SUSD2与胰腺前体细胞相关蛋白PDX1的表达。0040图6为RTQPCR鉴定流式分选获得的SUSD2细胞，SUSD2细胞及未分选的胰腺内胚层细胞中胰腺发育相关基因的表达情况，表明SUSD2细胞相对富集胰腺内分泌前体细胞相关基因及胰腺内分泌细胞相关基因的表达，相对低表达。
20、胰腺前体细胞相关基因的表达，证明SUSD2标记的是胰腺内分泌前体细胞和/或新生的内分泌细胞。0041图7为SUSD2抗体用于磁珠分选来富集胰腺内分泌前体细胞及新生的胰腺内分泌细胞。A流式分析检测用SUSD2抗体对体外分化获得的胰腺内胚层细胞进行磁珠分选所富集的SUSD2细胞、SUSD2细胞中胰腺内分泌前体细胞及胰腺内分泌细胞的标记蛋白NKX22的表达，说明SUSD2抗体用于磁珠分选能够高效富集NKX22胰腺内分泌前体细胞及新生的胰腺内分泌细胞。B对磁珠分选获得的SUSD2细胞、SUSD2细胞及未分选的胰腺内胚层细胞进行延长培养后，免疫组化检测胰腺前体及胰腺内分泌相关蛋白的表达，表明SUSD2细。
21、胞能够大量产生内分泌细胞，证明其为内分泌前体细胞或新生的内分泌细胞；C将磁珠分选获得的SUSD2细胞、SUSD2细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，19周后对移植物免疫荧光染色，检测胰腺内分泌相关蛋白的表达，表明SUSD2细胞能够产生多种类型的胰腺内分泌细胞，而SUSD2细胞主要产生导管样细胞，证明SUSD2富集的是胰腺内分泌前体细胞或新生的胰腺内分泌细胞。0042图8为SUSD2能够用于标记人胚胎来源的胰腺内分泌前体细胞及新生的胰腺内分泌细胞。A免疫组化检测胚胎胰腺组织及成体胰腺组织中SUSD2与胰腺内分泌前体细胞相关蛋白、胰腺内分泌细胞相关蛋白的共表达，表明SUSD2仅在胚胎胰腺组织中的胰腺内分泌。
22、前体或内分泌细胞中表达。B免疫荧光检测胚胎胰腺组织中SUSD2与胰腺内分泌相关蛋白及胰腺导管相关蛋白的表达。0043图9为SUSD2能够用于富集人胚胎来源的胰腺内分泌前体细胞及新生的胰腺内分泌细胞。具体实施方式0044下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。SUSD2基因如序列2所示，编码的蛋白的氨基酸序列为序列1。0045实施例1、SUSD2作为胰腺内分泌前体细胞标记基因的发现及应用0046一、SUSD2作为修饰过人多能干细胞分化得到的胰腺内分泌前体细胞标记基因004711、胰腺内胚层细胞的获得0048将EGF。
23、P基因NC_013179133134126通过同源重组NGN3CONTIG编号NT_03005913，位于CHROMOSOME10，左侧同源臂在基因组中的位置7132565471332154；右侧同源臂在基因组中的位置7133215871467568离体的人多能干细胞系H1WICELLRESEARCHINSTITUTE，NIH编号为WA01，得到修饰后细胞的人多能干细胞系NGN3EGFP。将其按1520接种到细胞培养液I，培养1天；再直接换用细胞培养液II，培养12天；再直接换用细胞培养液III，培养1天；继续直接换用细胞培养液说明书CN104215768A5/13页7IV，培养2天；直接换用。
24、细胞培养液V，培养1天；直接换用细胞培养液VI，培养3天；直接换用细胞培养液VII，培养4天；直接换用细胞培养液VIII，培养46天；直接换用细胞培养液IX，培养46天，得到胰腺内胚层细胞。0049通过免疫荧光抗体法检测该阶段细胞群体中胰腺内胚层相关的多个标识转录因子的表达情况。0050检测NKX22的抗体是鼠来源的单抗该抗体购自DSHB，产品目录号为745A5；检测PDX1的是山羊来源的多抗该抗体购自RDSYSTEMS，产品目录号为AF2419；检测EGFP的是鸡来源的多抗该抗体购自ABCAM，产品目录号为AB13970；检测NGN3的抗体是绵羊来源的多抗该抗体购自RDSYSTEM，产品目录。
25、号为AF3444。0051所有抗体均为非直标抗体，检测中分别用JACKSONIMMUNORESEARCH公司购来的抗体复染ALEXAFLUOR488标记的驴来源的抗山羊的多抗产品目录号为705545147；CYANINECY3标记的驴来源的抗山羊的多抗产品目录号为705165147；CYANINECY3标记的驴来源的抗绵羊的多抗产品目录号为715165147ALEXAFLUOR488标记的驴来源的抗小鼠的多抗产品目录号为715545151；CYANINECY3标记的驴来源的抗小鼠的多抗产品目录号为715165151；ALEXAFLUOR488标记的驴来源的抗鸡的多抗产品目录号为70354515。
26、5。0052结果如图1所示，该阶段获得的细胞中，部分细胞表达PDX1这一胰腺前体的标记蛋白图1B中的A；另一部分细胞表达NGN3EGFP，两者几乎不共染图1B中的B；NGN3EGFP细胞表达胰腺内分泌前体细胞标识转录因子NGN3或者早期阶段内分泌细胞相关蛋白NKX22、CHROMOGRANINACHGA等图1B中的C和D；说明获得的细胞为胰腺内胚层阶段的细胞，其中存在NGN3EGFP标记的胰腺内分泌前体细胞或者新生的内分泌细胞。0053上述采用的培养液配方如下0054细胞培养液I按照如下方法配制得到将ESSENTIAL8培养基、和Y27632混合，得到细胞培养液I，其中ESSENTIAL8培养。
27、基和Y27632的配比为1ML10MOL。0055细胞培养液II为ESSENTIAL8培养基。0056细胞培养液III按照如下方法配制得到将DMEM/F12培养基，BSA，RMWNT3A和ACTIVINA混合，得到细胞培养液III，其中DMEM/F12培养基，BSA，RMWNT3A和ACTIVINA的配比为1ML01G25NG120NG。0057细胞培养液IV按照如下方法配制得到将DMEM/F12培养基，BSA和ACTIVINA混合，得到细胞培养液IV，其中DMEM/F12培养基，BSA和ACTIVINA的配比为1ML01G120NG。0058细胞培养液V按照如下方法配制得到将DMEM/F12。
28、培养基，BSA，ACTIVINA和WNTC59混合，得到细胞培养液V，其中DMEM/F12培养基，BSA，ACTIVINA和WNTC59的配比为1ML01G120NG50NMOL。0059细胞培养液VI按照如下方法配制得到将DMEM/F12培养基，B27SUPPLEMENTWITHOUTVITAMINA，KGF和SB525334混合，得到细胞培养液VI，其中DMEM/F12培养基，B27SUPPLEMENTWITHOUTVITAMINA，KGF和SB525334的配比为1ML10L50NG1MOL。0060细胞培养液VII按照如下方法配制得到将DMEMH培养基，B27SUPPLEMENT，说明。
29、书CN104215768A6/13页8ALLTRANSRETINOICACID，NOGGIN和SANT1混合，得到细胞培养液VII，其中DMEMH培养基，B27SUPPLEMENT，ALLTRANSRETINOICACID，NOGGIN和SANT1的配比为1ML10L2MOL250NG025MOL。0061细胞培养液VIII按照如下方法配制得到将DMEMH培养基，B27SUPPLEMENTWITHOUTVITAMINA，NOGGIN和TPB2S,5SE,E854TRIFLUOROMETHYLPHENYL2,4PENTADIENOYLAMINOBENZOLACTAM混合，得到细胞培养液VIII，。
30、其中DMEMH培养基，B27SUPPLEMENTWITHOUTVITAMINA，NOGGIN和TPB的配比为1ML10L250NG50NMOL。0062细胞培养液IX按照如下方法配制得到将DMEMH培养基，B27SUPPLEMENTWITHOUTVITAMINA，NOGGIN，HUMANLIF和ALK5INHIBITORII混合，得到细胞培养液VIII，其中DMEMH培养基，B27SUPPLEMENTWITHOUTVITAMINA，NOGGIN和TPB的配比为1ML10L250NG10NG1MOL。006312、流式分析鉴定NGN3EGFP细胞是否为胰腺内分泌前体细胞或新生的内分泌细胞0064。
31、将上述得到的胰腺内胚层细胞用BDFACSARIAIIU进行流式分析，得到NGN3EGFP含有胰腺内分泌前体来源的细胞群体、NGN3EGFP不含有胰腺内分泌前体来源的细胞群体两群细胞，EGFP为FL1通道。0065通过胞内流式分析检测NGN3EGFP和NGN3EGFP群体中是否含有胰腺内分泌前体细胞的多个标识转录因子或分泌蛋白。0066检测NKX22的抗体是鼠来源的单抗该抗体购自DSHB，产品目录号为745A5；检测NGN3的抗体是绵羊来源的多抗该抗体购自RDSYSTEMS，产品目录号为AF3444和小鼠来源的单抗该抗体购自DSHB，产品目录号为F25A1B3；检测NEUROD1的是山羊来源的多。
32、抗该抗体购自RDSYSTEMS，产品目录号为AF2746；检测PDX1的是山羊来源的多抗该抗体购自RDSYSTEMS，产品目录号为AF2419；检测CHROMOGRANINA的是兔来源的多抗该抗体购自中杉金桥，产品目录号为ZA0507。0067所有抗体均为非直标抗体，检测中分别用JACKSONIMMUNORESEARCH公司购来的抗体复染。ALEXAFLUOR488标记的驴来源的抗山羊的多抗产品目录号为705545147；ALEXAFLUOR488标记的驴来源的抗小鼠的多抗产品目录号为715545151，ALEXAFLUOR647标记的驴来源的抗小鼠的多抗产品目录号为715605151；ALE。
33、XAFLUOR488标记的山羊来源的抗小鼠抗原亚型1的多抗产品目录号为115545205，ALEXAFLUOR647标记的山羊来源的抗小鼠的多抗产品目录号为115605205；ALEXAFLUOR488标记的山羊来源的抗小鼠抗原亚型2B的多抗产品目录号为115545207，ALEXAFLUOR647标记的山羊来源的抗小鼠抗原亚型2B的多抗产品目录号为115605207；ALEXAFLUOR488标记的驴来源的抗兔的多抗产品目录号为711545152。0068结果如图2所示，NGN3EGFP含有胰腺内分泌前体细胞或新生的内分泌细胞群体中有NKX22、NGN3、CHROMOGRANINACHGA的。
34、表达，而不表达或低表达胰腺前体相关基因PDX1，表明该细胞群的确主要为胰腺内分泌前体细胞或新生的内分泌细胞。0069NGN3EGFP群体中无NKX22、CHROMOGRANINACHGA、GFP的表达，主要高表达胰腺前体相关转录因子PDX1，有极少部分细胞表达NGN3或NEUROD1，表明该细胞群主要为胰说明书CN104215768A7/13页9腺前体细胞或非胰腺细胞类型细胞。007013、NGN3EGFP细胞群富集SUSD2的表达00711RNA测序显示SUSD2在NGN3EGFP细胞群里富集表达0072用QIAGEN的RNEAYPLUSMINIKIT对上述2获得的NGN3EGFP细胞以及N。
35、GN3EGFP细胞进行提取，各获得2G的总MRNA。将得到的MRNA纯化后进行反转录得到单链CDNA。用末端脱氧核苷酸转移酶TERMINALDEOXYNUCLEOTIDYLTRANSFERASE对得到的单链CDNA的3端加上POLYA尾巴。将CDNA扩增12个PCR循环之后，用ILLUMINAPAIREDENDDNASAMPLEPREPKIT进行CDNA文库的构建。然后用ILLUMINAHISEQ2000对其进行测序。用TOPHAT软件将测序结果RAWREADS和人参考基因组THEHUMANREFERENCEGENOME，NCBIBUILD37,HG19进行比对，通过将配对序列MAPPINGR。
36、EADS和NCBI的参考数据库REFSEQGENESHG19进行正向或反向匹配后重建转录组。通过计算所有基因的表达丰度，并将其用RPKM进行标准化以后，下列标准来判断一个基因在NGN3EGFP与NGN3EGFP细胞之间差异表达的显著性1表达倍比关系FOLDCHANGE大于2或小于05；2P值小于005。采用R软件的热图软件包HEATMAPPACKAGE对获得的数据基于RPKM采用LOG10进行热图分析。利用差异基因表达DIFFERENTIALGENEEXPRESSION,DGE进行GO分析。0073结果如图3所示，相较于NGN3EGFP细胞，NGN3EGFP细胞富集表达胰腺内分泌相关基因NGN。
37、3、NEUROD1、NKX22、PAX4、ARX等，低表达胰腺前体细胞相关基因PDX1、HNF1B、HNF6等，说明分选获得的NGN3EGFP细胞是胰腺内分泌前体细胞及新生的内分泌细胞。0074NGN3EGFP细胞富集表达SUSD2NR02212，表达倍比关系是230，说明从MRNA水平上，SUSD2基因序列2可以作为鉴定待测细胞是否为胰腺内分泌前体细胞或新生的胰腺内分泌细胞的标志。下一步鉴定SUSD2基因表达的蛋白是否也是同样的情况。00752免疫荧光抗体法验证SUSD2能够标记NGN3EGFP细胞群0076对上述2获得的NGN3EGFP细胞以及NGN3EGFP细胞用免疫荧光抗体法检测EGF。
38、P和SUSD2的表达。0077检测EGFP的是鸡来源的多抗该抗体购自ABCAM，产品目录号为AB13970；检测SUSD2的是鼠来源的单抗该抗体购自BIOLEGEND，产品目录号为327401。0078所有抗体均为非直标抗体，检测中分别用JACKSONIMMUNORESEARCH公司购来的抗体复染。CYANINECY3标记的驴来源的抗小鼠的多抗产品目录号为715165151；ALEXAFLUOR488标记的驴来源的抗鸡的多抗产品目录号为703545155。0079结果如图4所示，免疫组化结果显示，SUSD2的表达与NGN3EGFP完全吻合，且在NGN3EGFP细胞中不表达，即在NGN3EGFP。
39、细胞中富集表达；说明SUSD2可以用来鉴定或标记NGN3EGFP细胞，即胰腺内分泌前体细胞或新生的胰腺内分泌细胞所组成的混合细胞群。0080二、SUSD2作为人多能干细胞分化得到的胰腺内分泌前体细胞标记基因008121、胰腺内胚层细胞的获得0082将离体的人多能干细胞系NGN3EGFP按照11的方法，分化得到胰腺内胚层细胞；008322、流式分析检测SUSD2基因的表达及胰腺内分泌前体细胞标记基因NKX22、说明书CN104215768A8/13页10NEUROD1的表达0084将上述21得到的胰腺内胚层细胞通过流式分析法检测SUSD2基因编码蛋白的表达，按照BDBIOSCIENCES购来的细。
40、胞固定/通透试剂盒产品目录号为554714进行，将上述21得到的胰腺内胚层细胞固定后使用对应抗体和SUSD2直标抗体小鼠来源的PE标记的抗SUSD2的单抗购自BIOLEGEND，产品目录号为327406；以及小鼠来源的APC标记单抗购自BIOLEGEND，产品目录号为327408。小鼠来源的未标记的单抗购自BIOLEGEND，产品目录号为327401染色，之后再用荧光二抗复染。用流式分选仪进行分析。0085检测NKX22的抗体是鼠来源的单抗该抗体购自DSHB，产品目录号为745A5；检测NGN3的抗体是绵羊来源的多抗该抗体购自RDSYSTEMS，产品目录号为AF3444和小鼠来源的单抗该抗体购。
41、自DSHB，产品目录号为F25A1B3；检测NEUROD1的是山羊来源的多抗该抗体购自RDSYSTEMS，产品目录号为AF2746；检测PDX1的是山羊来源的多抗该抗体购自RDSYSTEMS，产品目录号为AF2419；检测CHROMOGRANINA的是兔来源的多抗该抗体购自中杉金桥，产品目录号为ZA0507。0086二抗购自JACKSONIMMUNORESEARCHALEXAFLUOR488标记的驴来源的抗山羊的多抗产品目录号为705545147；ALEXAFLUOR488标记的山羊来源的抗小鼠抗原亚型2B的多抗产品目录号为115545207，ALEXAFLUOR647标记的山羊来源的抗小鼠抗。
42、原亚型2B的多抗产品目录号为115605207；ALEXAFLUOR488标记的驴来源的抗兔的多抗产品目录号为711545152；ALEXAFLUOR488标记的驴来源的抗鸡的多抗产品目录号为703545155。0087结果图如图5所示，在第四阶段第0天的时候，NGN3阳性或弱阳性的细胞并不表达SUSD2或NEUROD1，弱表达NKX22。在第四阶段第1天，分别有80、93AND88的SUSD2细胞表达NGN3，NKX22和NEUROD1。这表明绝大部分SUSD2细胞同时表达NGN3、NKX22和NEUROD1，说明这一群SUSD2细胞具有内分泌前体细胞特征。在第四阶段第4天的时候，大部分SU。
43、SD2细胞表达NKX22或CHROMOGRANINACHGA，并不表达NGN3，说明在该时期这群SUSD2/NGN3的细胞具有内分泌细胞的特征。此外，SUSD2细胞持续低表达或不表达胰腺前体的标记PDX1。说明SUSD2可以用来标记胰腺内分泌前体细胞及其子代内分泌细胞。0088在整个分化过程中，尽管存在部分SUSD2细胞表达胰腺内分泌相关蛋白NGN3、NKX22等，绝大部分SUSD2细胞不表达这些胰腺内分泌相关蛋白，而表达胰腺前体相关蛋白PDX1，说明SUSD2细胞主要包含胰腺前体细胞或非胰腺细胞类型细胞图5。0089上述结果表明，SUSD2细胞为胰腺内分泌前体细胞或新生的胰腺内分泌细胞，进一。
44、步证明，SUSD2基因编码蛋白的表达可以鉴定细胞是否为目的细胞。009023、SUSD2细胞的MRNA水平上检测用流式分选获得了SUSD2细胞和SUSD2细胞，用定量PCR技术分析了这两群细胞及未分选的胰腺内胚层细胞的基因表达情况。采用POWERMASTERMIX试剂盒进行定量PCR购自LIFETECHNOLOGIES，产品目录号为4367659，扩增引物见表1，内参引物为GAPDH，具体操作参见说明书。0091表1为扩增引物0092说明书CN104215768A109/13页110093说明书CN104215768A1110/13页120094结果如图6所示，SUSD2细胞富集胰腺内分泌前体。
45、细胞及内分泌细胞相关基因的表达NGN3、NEUROD1、NKX22、PAX4、ARX等的表达，表明其为胰腺内分泌前体细胞或新生的内分泌细胞，而SUSD2细胞则富集胰腺前体相关基因PDX1、HNF6、SOX9、PTF1A的表达，表明其不为胰腺内分泌前体细胞或新生的内分泌细胞。0095三、磁珠分选SUSD2阳性细胞和SUSD2阴性细胞009631、胰腺内胚层细胞的获得0097将离体的人多能干细胞系H1按照11的方法，分化得到胰腺内胚层细胞；说明书CN104215768A1211/13页13009832、磁珠分选0099磁珠分选胰腺内胚层细胞，所需的抗体为SUSD2直标抗体小鼠来源的PE标记的抗SU。
46、SD2的单抗购自BIOLEGEND，产品目录号为327406，磁珠分选相关试剂购自MILTENYIBIOTEC，根据使用说明获得SUSD2阳性细胞和SUSD2阴性细胞。010033、检测0101A、流式分析0102对SUSD2细胞、SUSD2细胞以及未分选的细胞进行流式分析，检测方法同上。0103结果如图7A所示，SUSD2细胞能够高纯度富集NKX22细胞，该细胞为NGN3的内分泌前体细胞或新生的内分泌细胞图7A。0104B对SUSD2阳性细胞培养的子代细胞进行免疫荧光鉴定0105对分选获得的SUSD2细胞和SUSD2细胞以及未分选的胰腺内胚层细胞进行体外延长培养。将目标细胞重悬在细胞培养液X。
47、中，铺于MATRIGEL包被的细胞培养板上培养一天使其贴壁。第二天，去掉培养基之后用PBS洗一遍，换做细胞培养液XI继续培养5天。培养条件为37摄氏度，5的二氧化碳。0106细胞培养液X由如下方法得到DMEMHB27WITHOUTVITAMINAY276321ML10L10M。0107细胞培养液XI由如下方法得到DMEMHB27WITHOUTVITAMINANOGGINHUMANLIFALK5INHIBITORII1ML10L250NG10NG100NM0108进行免疫组化染色。0109结果如图7B所示，SUSD2培养获得的细胞能够产生大量的INSULIN，即可获得大量的内分泌细胞，SUSD2。
48、培养获得的细胞主要富集的是PDX1胰腺前体细胞，仅能够产生少量INSULIN细胞，说明SUSD2所富集的细胞是胰腺内分泌前体细胞。0110说明SUSD2富集的是胰腺内分泌前体细胞或新生的内分泌细胞。0111C免疫缺陷小鼠肾包囊移植0112对分选获得的SUSD2阳性细胞和SUSD2阴性细胞以及未分选的胰腺内胚层细胞进行免疫缺陷小鼠68周肾包囊移植。移植19周之后，取移植物进行冰冻切片免疫组化染色。0113结果如图7C所示，将MACS获得的SUSD2及SUSD2移植到小鼠体内，SUSD2细胞能够产生所有种类的内分泌细胞INSULIN的BETA细胞，GLUCAGON的ALPHA细胞，SST的DELT。
49、A细胞，GHRELIN的EPSILON细胞以及PPY的PPY细胞，而无导管样结构产生，说明SUSD2细胞是胰腺内分泌前体细胞或新生的内分泌细胞。0114四、SUSD2在体内分选人胚胎来源的胰腺内分泌前体细胞及新生的内分泌细胞011541、人胚胎组织的冰冻切片的免疫荧光染色0116组织切片将离体人胎胰组织用4的PFA在4固定2小时，用PBS在4洗三次时间分别是迅速,10分钟和2小时。随后将组织块放在30的蔗糖溶液中4过夜，直至组织沉降。将组织块用OPTIMALCUTTINGTEMPERATURECOMPOUNDOCTTISSUETEK包埋后,用液氮进行冰冻，用冰冻切片机CRYOSTATLEICA切成10M的切片。0117将上述切片采用11的免疫荧光抗体法检测，结果切片为胰腺内胚层阶段的细胞，SUSD2标记的是胰腺内分泌前体细胞和/或新生的胰腺内分泌细胞图8。说明书CN104215768A1312/13页14011842、磁珠分选富集人胚胎来源的胰腺内分泌前体细胞及新生的内分泌细胞0119将胎胰组织用冷的PBS洗涤两次后，用眼科剪剪成1立方MM的小块。用消化液PRMI1640，100400U/MLCOLLAGENASEIVLIFETECHNOLOGIES,12U/MLDISPASEIIROCHE,DNASEI002,WT/V。