抗胰高血糖素受体的抗体及其用途.pdf

本发明公开了一种抗胰高血糖素受体的抗体及其用途，更具体地说，本发明涉及的是能与人胰高血糖素受体特异性结合的单克隆抗体，以及它们用于治疗或预防哺乳动物中的II型糖尿病以及相关疾病的用途。本发明提供了一类新的抗胰高血糖素受体的抗体，可以和胰高血糖素受体特异性结合，通过抑制胰高血糖素与其受体的结合，降低细胞内cAMP水平。

1.  一种抗胰高血糖素受体的抗体，其特征在于：所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列：
a．选自以下序列之一的轻链CDR3序列:
与选自L1-L6的轻链CDR3序列：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 50其中之一相差总共不超过三个氨基酸添加、替换和／或缺失的轻链CDR3序列；
b．选自以下序列之一的重链CDR3序列：
与选自H1-H6的重链CDR3序列：SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:55其中之一相差总共不超过四个氨基酸添加、替换和／或缺失的重链CDR3序列；
c．方案a的轻链CDR3序列和方案b的重链CDR3序列；
所述抗体与人胰高血糖素受体特异性结合。

2.  根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述抗体还包含以下方案的一种或几种组合的氨基酸序列：
a．选自以下之一的轻链CDR1序列：
与选自L1-L6的轻链CDR1序列:SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:58其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和／或缺失的轻链CDR1；
b．选自以下之一的轻链CDR2序列：
与选自L1-L6的轻链CDR2序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:49其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和／或缺失的轻链CDR2；
c．选自以下之一的重链CDR1序列：
与选自H1-H6的重链CDR1序列：SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:53其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和／或缺失的重链CDR1；
d．选自以下之一的重链CDR2序列：
与选自H1-H6的重链CDR2序列：SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:54其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和／或缺失的重链序列。

3.  一种抗胰高血糖素受体的抗体，其特征在于：所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列：
a．选自以下方案之一的轻链可变结构域序列：
i．具有与选自L1-L6的轻链可变结构域序列:SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 59其中之一至少80%相同的氨基酸序列；
ii．具有与编码L1-L6的轻链可变结构域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 60其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列编码的氨基酸序列；
b．选自以下方案之一的重链可变结构域序列：
i．具有与H1-H6的重链可变结构域序列： SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 56其中之一至少80%相同的氨基酸序列；
ii．具有与编码H1-H6的重链可变结构域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:37、 SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:57其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列编码的氨基酸序列；
c．a的轻链可变结构域序列和b的重链可变结构域序列；
所述抗体与人胰高血糖素受体特异性结合。

4.  根据权利要求3所述的抗体，其特征在于：方案c中a的轻链可变结构域序列与b的重链可变结构域序列的组合选自以下之一：L1H1、L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5和L6H6。

5.  根据权利要求3所述的抗体，其特征在于：所述抗体选自鼠源抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、Fab片段、F(fa’)x片段、结构域抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体中的一种。

6.  根据权利要求3所述的抗体，其特征在于：当所述抗体与人胰高血糖素受体结合时：
a．与人胰高血糖素受体的氨基酸Gln27至Gln142特异性结合；
b．以≤100 nM的IC50值降低胰高血糖素信号传导；
c．在动物模型中降低血糖；
d．(a)和(b)两者；
e．(a)、(b)和(c)。

7.  根据权利要求6所述的抗体，其特征在于：所述动物模型为ob/ob小鼠模型。

8.  一种分离的核酸，其特征在于：其包含编码权利要求3的抗体的轻链可变结构域、重链可变结构域或轻链可变结构域和重链可变结构域两者的多聚核苷酸序列。

9.  一种重组表达载体，其特征在于：其包含权利要求8的核酸。

10.  一种宿主细胞，其特征在于：其包含权利要求9的载体。

11.  一种生产抗胰高血糖素受体的抗体的方法，其特征在于：包括在允许表达所述抗体的条件下培养权利要求10的宿主细胞。

12.  一种药用组合物，其特征在于：其包含与药用可接受载体混合的权利要求3的抗体或人源化抗体。

13.  一种用于治疗II型糖尿病的试剂盒，其特征在于：其包含权利要求12的药用组合物。

抗胰高血糖素受体的抗体及其用途
技术领域
本发明涉及一种抗体，特别涉及一种抗胰高血糖素受体的抗体及其用途。
背景技术
人胰高血糖素是与胰岛素一起作用的重要激素类物质，参与人体血液中葡萄糖含量的调控。胰高血糖素和胰岛素都是多肽类激素。胰高血糖素是在胰腺的α胰岛细胞中产生的，胰岛素是在β胰岛细胞中产生的。当血糖水平降低时，胰高血糖素主要通过刺激一些靶细胞（主要是肝细胞）释放葡萄糖，胰高血糖素和胰岛素调节血糖的作用正好相反，胰岛素在血糖升高时刺激细胞摄取并储存葡萄糖，降低血糖浓度。
天然人胰高血糖素是由29个氨基酸残基：
NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH
胰高血糖素通过结合其受体并激活下游信号通路，胰高血糖素受体（简称GCGR）属于七次跨膜G蛋白偶联受体家族分泌素亚型，配体-受体结合后，通过激活第二信使腺苷酸环化酶来行使功能，升高细胞内cAMP水平，继而启动葡萄糖的从头合成途径和肝糖原降解途径，使得血糖浓度升高（Wakelam等， Nature (1986) 323:68-71, Pittner和Fain，Biochem J (1991) 277:371-378）。
糖尿病是常见的葡萄糖代谢症，其特征是高血糖，分为胰岛素依赖的I型糖尿病和胰岛素非依赖的II型糖尿病。I型糖尿病患者表现出高血糖和低胰岛素血症，并且对该病的常规治疗措施为提供胰岛素。但是，在某些I型或II型糖尿病中，绝对或相对高的胰高血糖素导致高血糖。在健康的动物或I型II型糖尿病模型动物中，用选择性或特异性的抗体清除血液循环中的胰高血糖素可以使血糖水平下降（Brand等， Diabetes (1996) 45:1076；Jiang 和 Zhang, AJP Endo（2003）284：E671）。这些研究表明，抑制胰高血糖素或拮抗胰高血糖素受体可以作为糖尿病常规高血糖治疗的辅助手段。
通过靶向胰高血糖素受体的抗体阻断胰高血糖素和胰高血糖素受体的结合，也可以作为控制或降低血糖的一种手段，从而成为治疗糖尿病的新方法（U.S.Pat. No.2008/036341 A2和U.S.Pat. No.2012/0128679 A1）。这样，胰高血糖素或胰高血糖素受体的拮抗剂可以是小分子，也可以是多肽或抗体类的生物大分子。
发明内容
本发明的目的在于提供一类新的抗胰高血糖素受体的抗体，可以和胰高血糖素受体特异性结合，通过抑制胰高血糖素与其受体的结合，降低细胞内cAMP水平，以及制备和应用这类生物大分子的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 
一种抗胰高血糖素受体的抗体，所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列：
a．选自以下序列之一的轻链CDR3序列:
与选自L1-L6的轻链CDR3序列：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 50其中之一相差总共不超过三个氨基酸添加、替换和／或缺失的轻链CDR3序列；
b．选自以下序列之一的重链CDR3序列：
与选自H1-H6的重链CDR3序列：SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:55其中之一相差总共不超过四个氨基酸添加、替换和／或缺失的重链CDR3序列；
c．方案a的轻链CDR3序列和方案b的重链CDR3序列；
所述抗体与人胰高血糖素受体特异性结合。
所述抗体还包含以下方案的一种或几种组合的氨基酸序列：
a．选自以下之一的轻链CDR1序列：
与选自L1-L6的轻链CDR1序列:SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:58其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和／或缺失的轻链CDR1；
b．选自以下之一的轻链CDR2序列：
与选自L1-L6的轻链CDR2序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:49其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和／或缺失的轻链CDR2；
c．选自以下之一的重链CDR1序列：
与选自H1-H6的重链CDR1序列：SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:53其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和／或缺失的重链CDR1；
d．选自以下之一的重链CDR2序列：
与选自H1-H6的重链CDR2序列：SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:54其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和／或缺失的重链序列。
一种抗胰高血糖素受体的抗体，所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列：
a．选自以下方案之一的轻链可变结构域序列：
i．具有与选自L1-L6的轻链可变结构域序列:SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 59其中之一至少80%相同的氨基酸序列；
ii．具有与编码L1-L6的轻链可变结构域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 60其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列编码的氨基酸序列；
b．选自以下方案之一的重链可变结构域序列：
i．具有与H1-H6的重链可变结构域序列： SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 56其中之一至少80%相同的氨基酸序列；
ii．具有与编码H1-H6的重链可变结构域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:37、 SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:57其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列编码的氨基酸序列；
c．a的轻链可变结构域序列和b的重链可变结构域序列；
所述抗体与人胰高血糖素受体特异性结合。
方案c中a的轻链可变结构域序列与b的重链可变结构域序列的组合选自以下之一：L1H1、L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5和L6H6。
所述抗体选自鼠源抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、Fab片段、F(fa’)x片段、结构域抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体中的一种。
当所述抗体与人胰高血糖素受体结合时：
a．与人胰高血糖素受体的氨基酸Gln27至Gln142特异性结合；
b．以≤100 nM的IC50值降低胰高血糖素信号传导；
c．在动物模型中降低血糖；
d．(a)和(b)两者；
e．(a)、(b)和(c)。
所述动物模型为ob/ob小鼠模型。
一种分离的核酸，其包含编码权利要求3的抗体的轻链可变结构域、重链可变结构域或轻链可变结构域和重链可变结构域两者的多聚核苷酸序列。
一种重组表达载体，其包含权利要求8的核酸。
一种宿主细胞，其包含权利要求9的载体。
一种生产抗胰高血糖素受体的抗体的方法，包括在允许表达所述抗体的条件下培养权利要求10的宿主细胞。
一种药用组合物，其包含与药用可接受载体混合的权利要求3的抗体或人源化抗体。
一种用于治疗II型糖尿病的试剂盒，其包含权利要求12的药用组合物。
本发明的有益效果是：提供一类新的抗胰高血糖素受体的抗体，可以和胰高血糖素受体特异性结合，通过抑制胰高血糖素与其受体的结合，降低细胞内cAMP水平。
附图说明
图1 是单克隆抗体A-1和表达有hGCGR的CHO-DHFR细胞特异性结合的流式分析结果，灰色峰和虚线峰为阴性对照，杂交瘤细胞上清结合CHO-DHFR-GCGR对应的实线峰有明显右移。
图2 是单克隆抗体A-2和表达有hGCGR的CHO-DHFR细胞特异性结合的流式分析结果，灰色峰和虚线峰为阴性对照，杂交瘤细胞上清结合CHO-DHFR-GCGR对应的实线峰有明显右移。
图3 是单克隆抗体A-3和表达有hGCGR的CHO-DHFR细胞特异性结合的流式分析结果，灰色峰和虚线峰为阴性对照，杂交瘤细胞上清结合CHO-DHFR-GCGR对应的实线峰有明显右移。
图4  是HitHunter cAMP方法检测纯化的杂交瘤细胞上清中的抗体抑制Glucagon对GCGR受体的激活作用图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
本发明涉及抗体例如可与人胰高血糖素受体（GCGR）特异性结合的抗体。这些包括可抑制或阻断胰高血糖素与人GCGR结合并降低胰高血糖素经受体信号传导的抗原结合蛋白。在一个实施方案中提供了包括拮抗性抗体的可降低动物血糖的鼠源抗体。
本发明进一步提供可特异性结合至人胰高血糖素受体的抗体相关的组合物、试剂盒和方法。也提供了核酸分子及其衍生物和片段，其包含编码与胰高血糖素受体结合的多肽的全部或部分的多聚核苷酸，例如编码全部或部分抗胰高血糖素受体抗体、抗体片段或抗体衍生物的核酸。本发明进一步提供包含该类核酸的载体和质粒以及包含该类核酸和/或载体和质粒的细胞和细胞系。所提供方法包括，例如，制备、鉴定或分离与人GCGR结合的抗体例如抗GCGR抗体的方法，测定该抗体是否与GCGR结合的方法、以及将与GCGR结合的抗体给予动物模型的方法。
定义
使用标准的单字母或三字母缩写表明多聚核苷酸和多肽序列。除非另外指明，多肽序列的氨基端在左而它们的羧基端在右，单链核酸序列和双链核酸序列的上游链的5’端在左而它们的3’端在右。多肽的具体部分可由氨基酸残基编号表示，例如氨基酸27至142，或由该位点的实际残基表示例如Gln27至Gln142。也可通过解释其与参比序列的差异描述具体的多肽或多聚核苷酸序列。具体轻链和重链可变结构域的多聚核苷酸和多肽可表示为L1（“轻链可变结构域1”），H1（“重链可变结构域1”）。包含轻链和重链的抗原结合蛋白或抗体可通过结合轻链的名称和重链可变结构域的名称表示。例如，  “L4H7"表示包含L4轻链可变结构域和H7重链可变结构域的抗体。
除非本文另外定义，与本文相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。进一步，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数并且复数含义术语应包括单数含义。通常，与本文所述细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质核酸化学以及杂交相关的命名法和技术为本领域熟知和经常使用的。本发明的方法和技术通常根据本领域已知的常规方法以及本说明书引用和讨论的各种普通和更具体的参考文献所描述的进行，除非另外说明。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版．, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)，以及Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)，均以参考形式并于本文。酶反应和纯化技术根据操作说明进行，如本领域通常完成或本文所述。与本文描述的分析化学、合成有机化学和医学和药学化学相关的木语学以及实验操作和技术均为本领域熟知和普遍使用者。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和给药以及患者的治疗。
以下术语，除非另外指明，应理解为具有以下含义：术语“分离的分子”（其中所述分子为例如多肽、多聚核苷酸或抗体）为就其来源或衍生源而言( 1)与在天然状态下与其相伴的天然相关组分分离，(2)基本与同种的其它分子游离(3)由不同种细胞表达或(4)不天然存在。因此，化学合成或由与其天然来源的细胞不同的细胞体系表达的分子将与天然相关组分“分离”。也可使用本领域已知的纯化技术通过分离使分子基本与其天然相关组分游离。例如，可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定多肽样品的纯度并使用本领域熟知的技术将凝胶染色以观察该多肽。对于某些目的，可使用HPLC或其它本领域熟知的纯化方法提供更高的分辨率。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”均指包含两个或多个通过肽健相互连接的氨基酸的分子。这些术语涵盖例如天然和人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物（例如突变蛋白、变异体和融合蛋白）以及转录后或否则为共价或非共价修饰的蛋白。肽、多肽或蛋白可为单体或多聚体。
多肽（例如抗体）的“变异体”包含相对于另一多肽序列在氨基酸序列中插入、缺失和／或替换了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。本发明的变异体包括融合蛋白。
多肽的“衍生物”为经化学修饰的多肽（例如，抗体），例如通过与其它化学部分例如聚乙二醇、白蛋白（例如人血清白蛋白）结合、磷酸化和糖基化。除非另外说明，术语“抗体”包括除包含两个全长重链和两个全长轻链的抗体外的其衍生物，变异体、片段和突变蛋白，其实例见下文。
“抗体”为包含与抗原结合部分并任选为允许抗原结合部分采取促进该抗体与该抗原结合的构象的支架或框架部分的蛋白。抗体的实例包括抗体、抗体片段（例如抗体的抗原结合部分）、抗体衍生物和抗体类似物。该抗体可包含例如可选择的蛋白支架或具有移植CDRs或CDRs衍生物的人工支架。该支架包括但不限于包含被引入的例如以稳定化该抗原结合蛋白的三维结构的抗体衍生支架以及包含例如生物相容性多聚体的全合成支架。参见，例如，Korndorfer等，2003，Proteins: Structure，Function，and Bioinformatics, Volume 53, Issue l:121-129; Roque等，2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654。此外，可使用模拟肽抗体(“PAMs”)以及基于模拟抗体的支架，其如支架一样利用纤维蛋白连接素。
抗体可具有例如天然免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”为四聚体分子。在天然的免疫球蛋白中，各四聚体由两个相同的多肽链对组成，各对具有一个“轻”(约25 kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。各链的氨基端包括约100至110或更多氨基酸的可变结构域，主要与抗原识别相关。各链的羧基端部分确定了主要与效应器作用相关的恒定区。人的轻链分为κ和λ轻链。重链分为μ、δ、α或ε，并确定了抗原的同种型，例如分别为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变和恒定区由约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链也包括约10多个氨基酸的“D”区。参见，Fundamental Immunology Ch.7(Paul编著，第2版．Raven Press (1989))（其完整内容以参考形式并于本文用于任何目的）。各轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，这样一个完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。
天然免疫球蛋白链显示出由三个高度可变区连接的相对保守骨架区( FR)的相同基本结构，也被称作互补决定区或CDRs。从N端到C端，轻和重链均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各结构域氨基酸的分配与Kabat等在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，,US Dept. of Health and Human Services, PHS，NIH，NIH Publication no. 91--3242．1991中的定义一致。
除非另外指明，“抗体”指完整的免疫球蛋白或其可与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合部分。可由重组DNA技术或通过酶或化学裂解完整抗体生产抗原结合部分。抗原结合部分包括，尤其是，Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、结构域抗体(dAbs)，包括互补决定区(CDRs)的片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双链抗体(diabodies)、三链抗体(triabodies)、四链抗体(tetrabodies)和至少包含足以赋予多肽特异抗原结合的免疫球蛋白的一部分的多肽。
Fab片段为具有V_L、V_H、C_L和C_H1结构域的单价片段；F(ab’)₂片段为具有两个在铰链区由二硫键连接的Fab片段的二价片段；Fd片段具有V_H或V_L结构域；dAb片段具有V_H结构域、V_L结构域，或V_H或V_L结构域的抗原结合片段（美国专利号6846634、6696245，美国专利申请公开号05/0202512、04/0202995、04/0038291、04/0009507、03/0039958, Ward等，1989，Nature 341:544-546).
单链抗体(scFv)为其中的V_L扣V_H区由接头（例如，合成的氨基酸残基序列）连接以形成连续蛋白质的抗体，其中该接头足够长以允许该蛋白链折叠回自身并形成单价抗原结合位点（参见，例如，Bird等，1988, Science 242:423-26 and Huston 等, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83)。双链抗体为包含两个多肽链的二价抗体，其中各多肽链包含由接头连接的V_H和V^L结构域，该接头很短以致于不允许两个结构域在相同链上的配对，因此允许各结构域与另一多肽链上的互补结构域配对(参见，例如，Holliger等，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48，和Poljak 等，1994，Structure 2:1121-23)。如果双链抗体的两个多肽链是相同的，那么由它们配对得到的双链抗体将具有相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可用于制备具有不同抗原结合位点的双链抗体。相似地，三链抗体和四链抗体分别为包含三个和四个多肽链的抗体并分别形成三个和四个抗原结合位点，其可相同或不同。
可使用Kabat等在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版, US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242，1991中描述的方法鉴定给定抗体的互补决定区(CDRs)和骨架区(FR)。可向分子中共价或非共价并入一个或多个CDRs使其成为抗体。抗体可以较大多肽链并入CDR(s)。可将CDR(s)共价连接至另一乡肽链，或非共价并入CDR(s)。CDRs允许抗体与具体的相关抗原特异性结合。
抗体可有一个或多个结合位点。如果多于一个结合位点，该结合位点可与另一个相同或不同。例如，天然人免疫球蛋白通常具有两个相同的结合位点，而“双特异性”或“双功能’’抗体具有两个不同的结合位点。
术语“鼠源抗体”包括具有一个或多个来源于小鼠免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的所有抗体。
“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”为包含与抗原相互作用的氨基酸残基（或其它部分）并有助于抗体对抗原的特异性和亲和力的抗体的部分。对与其抗原特异性结合的抗体而言，这将包括至少部分的至少一个其CDR结构域。
“表位”为与抗体结合的分子部分。表位可包含分子的非连续部分（例如，在多肽中，在多肽的一级序列中不连续的氨基酸残基在该多肽的三级和四级结构中相互足够接近以致于被一个抗体结合）。
两个多聚核苷酸或两个多肽序列的“相同百分比”由使用GAP计算机程序( GCG Wisconsin Package；version 10.3 (Accelrys，San Diego，CA)的一部分）使用其默认参数比较序列测定。
术语“多聚核苷酸”、“寡聚核苷酸”和“核酸”可在全文中交替使用并包括DNA分子（例如，cDNA或基因组DNA）、RNA分子（例如mRNA）、使用核苷酸类似物（例如，肽核酸和非天然核苷酸类似物）生成的DNA或RNA类似物及其杂交体。核酸分子可为单链或双链。在一个实施方案中，本发明的核酸分子包含编码本发明抗体或其片段、衍生物、突变蛋白或变异体连续的开放阅读框。
 “载体”为可用于将与其相连的另一核酸引入细胞的核酸。载体的一种类型为“质粒”，其指可连接附加核酸区段的线性或环状双链DNA分子。载体的另一类型为病毒载体（例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺病毒伴随病毒），其中可将附加DNA区段引入病毒基因组。某些载体可在它们被引入的宿主细胞中自主复制（例如，包含细菌复制起点的细菌载体以及游离型哺乳动物载体）。其它载体（例如，非游离型哺乳动物载体）在引入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组中并因此与宿主基因组一起复制。“表达载体”为可引导所选多聚核苷酸表达的载体类型。
如果调控序列影响核苷酸序列的表达（例如，表达水平、时间或位点）那么核苷酸序列与调控序列“可操作地相连”。“调控序列”为可影响与其可操作相连的核酸的表达（例如，表达水平、时间或位点）的核酸。调控基因，例如，直接对受调控核酸发挥作用或通过一个或多个其它分子（例如，与调控序列和/或核酸结合的多聚核苷酸）的作用。调控序列的实例包括启动子、增强子和其它表达控制元件（例如，多腺苷酸化信号）。调控序列的进一步实例描述于例如Goeddel，1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press and Baron 等, 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06。
“宿主细胞”为用于表达核酸例如本发明核酸的细胞。宿主细胞可为原核生物，例如大肠杆菌，或者其可为真核生物，例如单细胞真核生物（例如，酵母或其它真菌）、植物细胞（例如烟草或番茄植物细胞）、动物细胞（例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞）或杂交瘤。通常，宿主细胞为可用多肽编码核酸转化或转染的培养细胞，其可接着在宿主细胞中表达。短语“重组宿主细胞”可用于表述用预期表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可为包含该核酸但是不以期望水平表达的细胞，除非向该宿主细胞引入了调控序列这样其与核酸可操作地相连。应理解的是术语宿主细胞不仅指具体的受试者细胞也指该细胞的子代或可能的子代。由于例如突变或环境影响后续世代会出现某些修饰，该子代事实上可能与母体细胞不同但是仍然属于本文使用的术语范围。
胰高血糖素受体
胰高血糖素受体( GCGR)属于7-跨膜受体家族的B亚家族，其通过异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白）与一个或多个胞内信号传导途径偶联(Jelinek等，Science 259:1614-1616 (1993), Segre 等, Trends Endocrinol. Metab. 4:309-314 (1993)。如本文所使用“胰高血糖素受体”和“GCGR”可交替使用。
在一个实施方案中，可选择本发明的抗体结合表达于细胞上的膜结合胰高血糖素受体并通过胰高血糖素受体抑制或阻断胰高血糖素信号传导。在一个实施方案中，本发明的抗体与人胰高血糖素受体特异性结合。在进一步的实施方案中，与人胰高血糖素受体结合的抗体也可与其它物种的胰高血糖素受体结合，例如大鼠。下文中的实施例提供生成与人细胞膜结合胰高血糖素受体结合的鼠源抗体，在进一步的实施方案中与其它物种的胰高血糖素受体结合。
hGCGR（human glucagon receptor, 胰高血糖素受体）包括477个氨基酸残基。hGCGR氨基酸的序列见SEQ ID NO: 2，其核苷酸编码序列见SEQ ID NO:1。小鼠的GCGR氨基酸的序列见SEQ ID NO: 3，其核苷酸编码序列见SEQ ID NO:4。
抗体
一方面，本发明提供与人胰高血糖素受体特异性结合的抗体（例如，抗体、抗体片段、抗体衍生物、抗体突变蛋白和抗体变异体）。在一个实施方案中该抗体为鼠源抗体。
根据本发明的抗体包括与人胰高血糖素受体结合并通过胰高血糖素受体抑制胰高血糖素信号传导的抗体。在一个实施方案中，该抗体的IC₅₀值为100 nM或更低。另一方面，该抗体与胰高血糖素受体特异性结合，抑制信号传导并显示出治疗性生物作用，例如降低动物模型的血糖。在一个实施方案中，该抗体为与胰高血糖素受体特异性结合并通过胰高血糖素受体抑制信号传导的鼠源抗体。
在一个实施方案中，该抗体包含与下表中A1-A6的CDR序列各相差5、4、3、2、1或0个单氨基酸添加、替换和／或缺失的序列。如本文所使用，与下表所示的CDR序列最多不超过例如四个氨基酸添加、瞽换和或缺失的CDR序列指与下表中的序列相比具有4、3、2、1或0个单氨基酸添加、替换和/或缺失的序列。
在另一个实施方案中，该抗体包含一个或多个下文所示的CDR一致序列(consensus sequences)。提供了轻链CDR1、CDR2、CDR3和重链CDR1、CDR2和CDR3的一致序列。
抗原结合蛋白（抗体）Al-A6的轻链CDRs以及示例性抗原结合蛋白（抗体）Al-A6的重链CDRs见下表。A-l至A-6对应于下文的Ll至L6以及下文的H1至H6。也显示了编码CDRs氨基酸序列的多聚核苷酸序列。
另一方面，本发明提供包含选自L1-L6的轻链可变区或选自H1-H6的重链可变区及其片段、衍生物、突变蛋白或变异体的抗体。可用名称“LxHy”表示该类抗体，其中“x”对应于轻链可变区并且“y”对应于重链可变区。本发明抗体包括例如包含选自组合LIH1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5和L6H6的轻链和重链可变结构域的组合。在一个实施方案中，该抗体为鼠源抗体。
 
轻链L1-L6

重链L1-L6

本发明抗体的具体实施方案包含与一个或多个上文所列CDRs和/或FRs(骨架区)的氨基酸序列相同的一个或多个氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗体包含上文所列轻链CDR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的轻链CDR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的轻链CDR3序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的重链CDR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的重链CDR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含上文所列的重链CDR3序列。
在另一个实施方案中，至少一个抗体的CDR3序列与来自A1-A6的CDR3序列的差异最多不超过6、5、4、3、2、1或0个单氨基酸添加、替换和/或缺失，如上文所述。在另一个实施方案中，抗体的轻链CDR3序列与上述Al-A6的轻链CDR3序列的差异不得超过6、5、4、3、2、1或0个单氨基酸添加、替换和/或缺失并且抗体的重链CDR3序列与上文所述Al-A6的重链CDR3序列的差异最多不超过6、5、4、3、2、1或0个单氨基酸添加、替换和/或缺失。在另一个实施方案中，抗体进一步包含1、2、3、4或5个CDR序列，各序列独自与Al-A6的CDR序列的差异最多不超过6、5、4、3、2、1或0个单氨基酸差异。在另一个实施方案中，抗体包含上文所列轻链可变区的CDRs和重链可变区的CDRs。在另一实施方案中，抗体包含上文所述的1、2、3、4、5和/或6个一致CDR序列。在进一步的实施方案中，该抗体包含L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5和L6H6中任何之一的CDRs。在一个实施方案中，该抗体为鼠源抗体。
在一个实施方案中，该抗体（例如抗体或抗体片段）包含轻链可变结构域，其包含与选自L1-L6的轻链可变结构域序列存在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸差异的氨基酸序列，其中各该序列的差异独立为一个氨基酸残基的缺失、插入或替换。在另一个实施方案中，该轻链可变结构域包含与选自L1-L6的轻链可变结构域至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该轻链可变结构域包含与下文所列L1-L6多聚核苷酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该轻链可变结构域包含在中等条件下与编码选自L1-L6的轻链可变结构域的多聚核苷酸互补序列杂交的多聚核苷酸编码的氨基酸序列。在另一个实施方棠中，该轻链可变结构域包含在严格条件下与编码选自L1-L6的轻链可变结构域的多聚核苷酸的互补序列杂交的多聚核苷酸编码的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供包含重链可变结构域的抗体，该可变结构域包含选自H1-H6的重链可变结构域序列存在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个残基存在差异的氨基酸序列，其中各该序列差异独立为一个氨基酸的缺失、插入或替换。在另一个实施方案中，该重链可变结构域包含与选自H1-H6的重链可变结构域序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该重链可变结构域包含在中等严格条件下与编码选自H1-H6的重链可变结构域的多聚核苷酸互补序列杂交的多聚核苷酸编码的氨基酸序列。在一个实施方案中，该重链可变结构域包含在严格条件下与编码选自H1-H6的重链可变结构域的多聚核苷酸互补序列杂交的的多聚核苷酸编码的氨基酸序列。
附加实施方案包括包含组合L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5和L6H6的抗体。
本发明抗体包括例如包含组合L1H1、L2H2、  L3H3、L4H4、L5H5和L6H6并具有期望表型（例如，IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgE和IgD）以及其Fab或F(ab')₂片段的那些。
本发明的抗体优选在本文描述的基于细胞的测定法中和/或本文描述的体内测定法中调节胰高血糖素信号传导和/或交叉阻断本申请所述抗体之一的结合和/或经本申请所述抗体之一被结合GCGR交叉阻断。因此可使用本文所述测定法鉴定该类结合体。
在一些实施方案中，通过首先鉴定在本文描述的基于细胞的和/或体内测定法中与过表达GCGR的细胞结合和/或中和和/或交叉阻断本申请描述的抗体和／或经本申请描述的抗体之一被结合GCGR交叉阻断的抗体以生成抗体。
生产鼠单克隆抗体的可选择方法为将杂交瘤细胞注入同系基因小鼠的腹膜腔，例如经处理（例如降植烷）促进形成包含单克隆抗体的腹水的小鼠。可通过多种已确立的技术分离和纯化单克隆抗体。该类分离技术包括使用蛋白A-琼脂糖的亲和色谱法、分子排阻色谱法和高子交换色谱法(参见，例如，Coligan第2.7.1-2.7.12页和第
2.9.1-2.9.3页；Baines等，“Purification of Immunoglobulin G(IgG),”Methods in Molecular Biology，第10卷，第79-104页(The Humana Press，Inc.， 1992)。可使用基于抗体的特殊性质（例如，重链或轻链同种型、结合特异性等）筛选的适当配基通过亲和色谱法纯化单克隆抗体。固定化于固体载体的适当配基的实例包括蛋白A、蛋白G、抗恒定区（轻链或重链）抗体、抗独特型抗体以及TGF-p结合蛋白或其片段或变异体。
可使用抗体结合位点中央的互补决定区(CDRs)的分子进化分离亲和性增加的抗体，例如对c-erbB-2亲和性增加的抗体，如Schier等，1996，J．Mol. Biol. 263：551所述。因此，该类技术可用于制备人胰高血糖素受体的抗体。
例如可在检测是否存在胰高血糖素受体的体外或体内测定法中使用针对人胰高血糖素受体的抗体。
也可通过任何传统技术制备抗体。例如，可从天然表达这些抗体的细胞将其纯化（例如，可从生产抗体的杂交瘤将其纯化）或使用本领域任何已知的技术在重组表达系统中生产。参见，例如，Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet等编著，Plenum Press (1980)；和Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land编著,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)。这在下文的核酸部分讨论。
可通过任何已知技术制备抗体并筛选期望性质。一些技术涉及分离编码相关抗体（例如，抗胰高血糖素受体抗体）的多肽链（或其部分）的核酸，并通过重组DNA技术操作核酸。该核酸可与另一相关核酸融合或经修饰（例如通过诱变或其它传统技术）以添加、缺失或替换一个或多个氨基酸残基。
当需要提高根据本发明包含一个或多个上述CDRs的抗体的亲和性时，可通过多种亲和成熟方案包括维持CDRs(Yang等，1995，J．Mol. Biol.，254：392-403)、链替换(Marks等，1992，Bio/Technology，10：779-783)、使用大肠杆菌的突变株(Low等，1996，J．Mol. Biol.，250：350-368) DNA重排(Patten等，1997，Curr. Opin. Biotechnol.，8：724-733)、噬菌体展示(Thompson等，1996，J．Mol. Biol.，256：7-88)以及其它PCR技术 (Crameri等，1998，Nature，391：288-291)。所有这些亲和力成熟方法讨论于Vaughan等，1998，Nature Biotechnology, 16：535-539 中。
抗体片段
在另一方面本发明提供本发明抗胰高血糖素受体片段。该片段可完全由抗体衍生序列组成或可包含附加序列。抗原结合片段的实例包括Fab、F(ab’)2、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体和结构域抗体，其它实例提供于Lunde等，2002，Biochem, Soc. Trans. 30:500-06。
可经氨基酸桥（短肽接头）连接重链和轻链可变结构域（Fv区）形成单链抗体，从而得到单多肽链。已通过将编码肽接头的DNA融合在编码两个可变结构域多肽(V_L和V_H)的DNAs之间制备该单链FVs(scFvs)。所得多肽可折叠回自身形成抗原结合单体，或它们可形成多聚体（例如，二聚体、三聚体或四聚体），取决于两个可变结构域之间的柔性接头的长度(Kortt等，1997，Prot．Eng. 10:423；Kortt等2001，Biomol. Eng. 18:95-108)。通过组合包含多肽的不同V_L和V_H，可形成与不同表型结合的多体scFvs(Kriangkum等，2001，Biomol. Eng. 18:31-40)。已研发的用于生产单链抗体的技术包括美国专利号4946778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston等，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward等，1989, Nature 334:544, de Graaf等，2002, Methods Mol Biol. 178:379-87申描述的那些。来源于本文提供的抗体的单链抗体包括但不限于包含可变结构域组合L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5和L6H6的scFvs，均涵盖于本发明。
也可通过抗体的蛋白水解作用例如根据传统方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整的抗体获得来源于抗体的抗原结合片段。举例而言，可用胃蛋白酶酶裂解抗体提供称作F(ab’)2的SS片段生产抗体片段。可使用巯基还原剂进一步裂解这一片段产生3.5S Fab’单价片段。可选择性的，可使用巯基保护基团进行该裂解反应得到二硫键的裂解。作为可选择的，使用木瓜蛋白酶的酶裂解直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法描述于例如Goldenberg，美国专利号4,331,647，Nisonoff等，Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem.J. 73:119，1959; Edelman等，Methods in Enzymology l:422 (Academic Press，1967)； 以及Andrews和Titus, Current Protocols in Immunology (Coligan 等编著),John Wiley&Sons (2003)，第2.8.1-2.8.10页和第2.10A.1-2.10A.5页。其它裂解抗体的方法，例如制备重链以形成单价重、轻链片段(Fd)，进一步裂解片段或也可使用其它酶、化学或基因技术，只要片段与可被该完整抗体识别的抗原结合。
另一种形式的抗体片段为包含一个或多个抗体互补决定区(CDRs)的肽。可通过构建编码相关CDR的多肽获得CDRs。例如可通过使用聚合酶链式反应用抗体生成细胞的mRNA作为模板合成可变区制备该类多肽（参见，例如，Larrick等，Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck,“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,”Monoclonal Antibodies:Production, Engineering and Clinical Application，Ritter等编著， 166页(Cambridge University Press， 1995)；和Ward等，“Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,”Monoclonal Antibodies: Principles and Applications，Birch等编著，137页(Wiley-Liss，Inc, 1995)。该抗体片段可进一步包含本文所述抗体的至少一个可变结构域。因此，例如，V区结构域可为单体并且是V_H或V_L结构域，其可以如下文所述的至少等于1 x 10^-7M或更低的亲和度独立与胰高血糖素受体结合。
该可变区结构域可为任何天然可变结构域或其基因工程形式。基因工程形式指使用重组DNA工程技术生产的可变区结构域。该基因工程形式包括例如通过向特异抗体的氨基酸序列插入、缺失或改变从特异抗体可变区产生的。具体实例包括包含只含一个CDR以及任选来自一个抗体的一个或多个框架氨基酸和来自另一抗体的可变区结构域剩余部分的基因工程可变区结构域。
可变区结构域可与至少一个其它抗体结构域或其片段在C端氨基酸共价连接。因此，举例而言，存在于可变区结构域的V_H结构域可与免疫球蛋白CH1结构域或其片段相连。相似地，V_L结构域可与C_K结构域或其片段相连。以这种方式，例如，该抗体可为Fab片段，其中抗原结合结构域包含它们的C端分别与CH1和C_K结构域共价连接的联合V_H和V_L结构域。可用其它氨基酸延长C_H1结构域，例如以提供铰链区或如Fab’片段中的部分铰链结构域或提供其它结构域，例如抗体CH2和CH3结构域。
抗体的衍生物和变异体
例如可通过随机诱变或通过定点诱变（例如寡聚核苷酸诱导的定点诱变）改变编码对应于氨基酸序列A1-A6的核苷酸序列L1-L6和H1-H6以产生与未突变多聚核苷酸相比包含一个或多个具体核苷酸替换、缺失或插入的经改变的多聚核苷酸。用于产生该类改变的技术实例描述于Walder等，1986，Gene 42:133；Bauer等，1985，Gene 37:73；Craik，BioTechniques, January 1985, 12-19; Smith等，1981, Genetic Engineering: Principles and Methods，Plenum Press；以及美国专利号4518584和4737462。这些和其它方法可用于产生例如与未衍生化抗体相比具有期望性质例如亲和性、亲和力或对胰高血糖素受体的特异性增强、体内或体外活性或稳定性增强或体内副作用降低的抗胰高血糖素受体抗体的衍生物。
本发明领域的其它抗胰高血糖素受体抗体衍生物包括抗胰高血糖素受体抗体或其片段与它蛋白或多肽的共价或聚集结合物，例如通过表达包含与抗胰高血糖素受体抗体多肽的N端或C端融合的异源多肽的重组融合蛋白。例如，该结合肽可为异源信号（或引导）多肽，例如酵母α因子前导肽或例如表位标签的肽。包含融合蛋白的抗体可包含被添加以辅助抗体的纯化或鉴定的肽（例如多聚组氨酸）。抗体也可与FLAG肽连接，如Hopp等，1988，Bio/Technology 6:1204和美国专利5011912所述。FLAG肽具有高抗原性并提供被特异单克隆抗体( mAb)可逆结合的表位，允许已表达重组蛋白的快速检测和方便纯化。可商业购买(Sigma，St. Louis，MO)用于制备其中FLAG肽与给定多肽融合的融合蛋白的试剂，在另一个实施方案中，包含一个或多个抗体的寡聚体可用作胰高血糖素受体拮抗剂或用更高级的寡聚体。寡聚体可以是共价连接的或非共价连接的二聚体、三聚体或更高的寡聚体形式。可使用包含两个或更多个抗原结合蛋白的寡具体，其中一个实例为同型二聚体。其它寡聚体包括异二聚体、同型三聚体、异三聚体、同型四聚体、杂四聚体等。
应当理解的是本发明抗体可具有至少一个氨基酸替换，只要该抗体保留了结合特异性。因此，抗体结构的修饰包含于本发明范畴。这些可包括不破坏抗体胰高血糖素受体结合能力的氨基酸替换，其可为保守或非保守的。保守氨基酸替换可包括非天然氨基酸残基，其通常经化学肽合成整合而不是生物系统合成。这些包括拟肽和其它反向或倒转形式的氨基酸部分。保守氨基酸替换也可涉及用非天然残基替换天然氨基酸残基这样对该位点氨基酸残基的极性或电荷作用很小或没有作用。非保守替换可涉及一类氨基酸或氨基酸类似物的一个成员与具有不同物理性质（例如，体积、极性、疏水性、电荷）的另一类氨基酸的成员交换。
而且，本领域技术人员可生成在各期望氨基酸残基上包含氨基酸替换的待测变异体。可使用本领域技术人员已知的活性测定法筛选该类变异体。该类变异体可用于收集关于适当变异体的信息。举例而言，如果发现某一氨基酸残基可引起活性破坏、非期望的降低或不当的活性，可避免具有该类变化的变异体。换言之，基于从这些常规试验收集的信息，本领域技术人员可轻松确定应避免进一步替换（单独或与其它突变组合）的氨基酸。
技术人员可使用已知技术确定如本文所列的多肽的适当变异体。在一些实施方案中，本领域技术人员可通过靶向对于活性不重要的区域鉴定经改变后不会破坏活性的分子适当区域。在一些实施方案中，可鉴定在相似多肽中保守的残基或分子部分。在一些实施方案中，甚至可保守替换对于生物活性或结构重要的区域而不破坏生物活性或不会不利作用于多肽结构。此外，本领域技术人员可考察结构．功能研究鉴定对活性或结构重要的相似多肽中的残基。鉴于这一对比，可预测对应于在相似蛋白中对活性或结构重要的氨基酸残基的蛋白质中氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可为这些经预测重要的氨基酸残基选择化学相似氨基酸替换。
本领域技术人员也可分析与相似多肽的结构相关的三维结构和氨基酸序列。鉴于该类信息，本领域技术人员可预测就三维结构而言抗体的氨基酸残基比对。在一些实施方案中，本领域技术人员可选择不对经预测在蛋白质表面的氨基酸残基进行显著改变，因为该类残基可能参与与其它分子的重要相互作用。许多科学出版物致力于二级结构的预测。参见Moult，Curr. Op. Biotech.，7:422-427 (1996)；Chou等，Biochemistry, 13:222-245 (1974); Chou等，Biochemistry, 113:211-222 (1974); Chou等，Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou等，Ann. Rev. Biochem., 47:251-276和Chou等，Biophys.J．，26:367-384 (1979)。此外，目前可使用计算机程序辅助预测二级结构。举例而言，序列同一性大于30%或相似性大于40%的两个多肽或蛋白质通常具有相似的结构拓扑学。近期蛋白结构数据库(PDB)的增长增强了二级结构的可预测性，包括多肽或蛋白结构中潜在的折叠数量。参见Holm等，Nucl. Acid. Res.，27:244-247 (1999)。已表明Brenner等，Curr．Op. Struct. Biol.，7:369-376 (1997)在给定多肽或蛋白质中存在有限数量的折叠并且一旦确定了临界数量的结构，结构预测将变得显著更加精确。
本领域技术人员可在需要该类替换时确定期望的氨基酸替换（保守或非保守）。在一些实施方案中，氨基酸替换可用于鉴定人胰高血糖素受体抗体的重要残基或者增加或降低本文所述人胰高血糖素受体抗体的亲和力。
根据一些实施方案，优选的氨基酸替换为以下：(1)降低蛋白质水解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力和/或(4)赋予或修饰该类多肽上的其它物理化学或功能性质。根据一些实施方案，可在天然存在序列中（在一些实施方案中，在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分）进行单个或多个氨基酸替换（在一些实施方案中为保守氨基酸替换）。在一些实施方案中，保守氨基酸替换通常不会本质上改变母体序列的结构特性（例如，替换氨基酸不应破解存在于母体序列中的螺旋或干扰特征化母体序列的其它类型二级结构）。本领域队可的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins，Structures and Molecular Principles (Creighton编著，W.H.Freeman and Company (1984); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J.Tooze 编著, Garland Publishing (1991)；以及Thornton等，Nature 354:105 (1991)，其以参考形式并于本文。
此外，本领域技术人员可认识到适当的结合剂包括这些抗体的部分，例如一个或多个重链CDR1、CDR2、CDR3，轻链CDR1、CDR2和CDR3，如本文所具体公开。至少一个重链CDR1、CDR2、CDR3、CDR1，CDR2和CDR3区具有至少一个氨基酸替换，只要该抗体保留了非替换CDR的结合特异性。该抗体的非CDR部分可为非蛋白分子，其中该结合剂交叉阻断本文公开的抗体与人GCGR的结合和/或抑制经该受体的胰高血糖素信号传导。该抗体的非CDR部分可为非蛋白质分子，其中该抗体在竞争结合测定法中显示出与至少抗体Al-A6之一所显示相似的与人GCGR的结合类型，和/或中和胰高血糖素的活性。抗体的非CDR部分可由氨基酸组成，其中该抗体为重组结合蛋白或合成肽，并且该重组结合蛋白交叉阻断本文公开的抗体与人GCGR的结合和/或中和体内或体外胰高血糖素活性。抗体的非CDR部分可由氨基酸组成，其中该抗体为重组抗体，并且该重组抗体在竞争结合测定法中显示出与至少抗体A1-A6之一所显示相似的与人GCGR肽的结合类型，和/或中和胰高血糖素信号传导。
核酸
一方面，本发明提供分离的核酸分子。该核酸分子包含例如编码全部或部分抗原结合蛋白的多聚核苷酸，例如本发明抗体的一条链或两条链，或其片段、衍生物、突变蛋白或变异体；足以用作杂交探针的多聚核苷酸；PCR引物或用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多聚核苷酸的测序引物；用于抑制多聚核苷酸表达的反义核酸以及其互补序列。该核酸可为任何长度。例如它们的长度可为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、3000、5000或更多个核苷酸，和/或包含一个或多个附加序列，例如调控序列，和/或是较大核酸例如载体的一部分。该核酸可为单链或双链并包含RNA和/或DNA核苷酸以及其人工变异体（例如，肽核酸）。
可从经GCGR抗原免疫的小鼠B细胞中分离编码抗体多肽（例如，重链或轻链、仅可变结构域或全长）的核酸。可通过常规方法例如聚合酶链式反应( PCR)分离该核酸。
编码重链和轻链可变区的核酸序列如上文所示。熟练的技术人员可理解由于遗传密码的简并性，本文公开的各多肽序列可由更多数量的其他核酸序列编码。本发明提供编码本发明抗原结合蛋白的各简并核苷酸序列。
可通过突变在核酸中引入变化，藉此导致其编码的多肽（例如，抗原结舍蛋白）氨基酸序列的变化。可使用本领域已知的任何技术引入突变。在一个实施方案中，使用例如定点诱变方案改变一个或多个具体氨基酸残基。在另一个实施方案中，使用例如随机诱变方案改变一个或多个随机选择的残基。无论其如何生成，可表达突变多肽并筛选期望性质。
可将突变引入核酸而不显著改变其编码多肽的生物学活性。例如，可进行引起非必需氨基酸残基处氨基酸替换的核苷酸替换。在一个实施方案中，突变本文为L-1至L-6和H-1至H-6提供的核苷酸序列或其片段、变异体或衍生物这样其编码包含本文所示L-1至L-6和H-1至H-6的氨基酸残基的一个或多个缺失或替换，成为两个或多个序列相异的残基。在另一个实施方案中，诱变作用在本文所示L-1至L-6和H-1至H-6的一个或多个氨基酸残基附近插入一个氨基酸成为两个或多个序列相异的残基。或者，可将一个或多个突变引入核酸以选择性改变其编码多肽的生物学活性（例如，与GCGR结合）。例如，该突变可在数量上或性质上改变生物学活性。量变的实例包括增加、降低或消除该活性。质变的实例包括改变抗原结合蛋白的抗原特异性。
在另一方面，本发明提供适于用做引物或检测本发明核酸序列的杂交探针的核酸分子。本发明的核酸分子可仅包含编码本发明全长多肽的核酸序列的一部分，例如，可用作探针或引物或编码本发明多肽活性部分的片段（例如，GCGR结合部分）的片段。
基于本发明核酸序列的探针可用于检测该核酸或相似核酸，例如编码本发明多肽的转录物。该探针可包含标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。该类探针可用于鉴定表达该多肽的细胞。
在另一方面本发明提供包含编码本发明多肽或其部分的核酸的载体。载体的实例包括但是不限于质粒、病毒载体、非游离基因哺乳动物载体和表达载体，例如重组表达载体。
本发明的重组表达载体可包含适于该核酸在宿主细胞中表达的形式的本发明核酸。该重组表达载体包括一个或多个调控序列，基于用于表达的宿主细胞进行筛选，其与该预表达的核酸序列可操作性相连。调控序列包括引导核苷酸序列在多个种类宿主细胞中组成型表达的（例如，SV40早期基因增强剂、劳斯氏肉瘤病毒启动子和细胞巨化病毒启动子），引导仅在某些宿主细胞中核苷酸序列的表达的（例如，组织特异调控序列，参见Voss等，1986，Trends Biochem. Sci．11:287，Maniatis等，1987，Science 236：1237，其完整内容以参考形式并于本文）以及引导核苷酸序列响应具体处理或条件的诱导型表达的（例如，哺乳动物细胞中的金属硫堇启动子和原核和真核系统二者中的四环霉素反应(tet-sesponsive)启动子和／或链霉素反应启动子（同前））。本领域技术人员应理解表达载体的设计取决于例如用于转化的宿主细胞的选择、所需蛋白表达水平等因素。本发明的表达载体可引入宿主细胞，藉此生产由本文所述核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。
另一方面，本发明提供可引入本发明表达载体的宿主细胞。宿主细胞可为任何原核或真核细胞。原核宿主细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。更高级的真核细胞包括昆虫细胞、酵母细胞以及哺乳动物源的确立细胞系。适当哺乳动物宿主细胞系的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或它们的衍生物例如Veggie CHO和在无血清培养基中生长的相关细胞系(参见Rasmussen等，1998，Cytotechnology 28:31)或CHO株DXB-11，其缺失DHFR(参见Urlaub等，1980，Proc. Natl. Acad, Sci. USA 77:4216-20)。其它CHO细胞系包括CHO-K1(ATCC# CCL-61)、EM9 (ATCC# CRL-1861)，和 UV20(ATCC# CRL-1862)，其它宿主细胞包括猴肾细胞的COS-7系(ATCC# CRL-1651)(参见Gluzman等，1981，Cell 23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC# CCL-163)，AM-1/D细胞(描述于美国专利序列号6210924)、HeLa细胞、BHK (ATCC# CRL-10)细胞系、来源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC# CCL-70)(参见McMahan等，1991，EMBO J．10:2821)、人胚肾细胞例如293，293 EBNA或MSR 293、人上皮A431细胞、人C010205细胞、其它经转化灵长动物细胞系、正常二倍体细胞、来源于初生组织体外培养物的细胞株、初移植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。用于细菌、真菌、酵母和哺乳细胞宿主的适当克隆和表达载体描述于Pouwels等，Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier （1985）。
可通过传统转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。对于稳定的哺乳动物转染而言，取决于使用的表达载体和转染技术，已知只有一小部分细胞可将外源DNA鏊合入它们的基因组中。为了鉴定和筛选这些整合子，通常将编码筛选标记（例如抗生素抗性）的基因与所关注基因一起引入宿主细胞。优选的筛选标记包括可赋予药物（如G418、潮霉素和甲氨喋呤）抗性的那些。在其它方法中可通过药物筛选鉴别包含被引入核酸的稳定转染细胞（例如，整合了筛选基因的细胞可存活，而其它细胞则死亡）。
可在提高多肽表达的条件下培养已转化细胞，可通过常规蛋白纯化方法回收多肽。一种该纯化方法描述于下文实施例。预用于本文的多肽包括基本同源的重组哺乳动物抗胰高血糖素受体抗体多肽，其基本不含污染性内源材料。
抗体的活性
一方面，本发明提供能与人胰高血糖素受体特异性结合的鼠源抗体。该类抗体包括可减少或中和胰高血糖素信号传导的拮抗或中和抗体。在一个实施方案中，抗体，例如本发明的鼠抗体的IC₅₀值为100 nM或更低；在另一个实施方案中，IC₅₀值为80nM或更低；在另一个实施方案中，70nM或更低；在另一个实施方案中，60nM或更低；在另一个实施方案中，50nM或更低；在另一个实施方案中，40nM或更低；在另一个实施方案中，30nM或更低；在另一个实施方案中，25nM或更低。在另一个实施方案中，抗体例如本发明的鼠抗体可与人胰高血糖素受体特异性结合，而且其IC₅₀值与参比抗体基本相似。在另一个实施方案中，抗体具有由下述实施例所描述的测定法（戎相似测定法）检测的与参比抗体基本相似的Kb（或Kd）。在本文中，术语“基本相似”意为与参比抗体的IC₅₀或Kb（或Kd）可比或约100%、99%、98%、97%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%或50%。参比抗体包括，例如，具有重链和轻链组合L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5和L6H6的抗体。在一个实施方案中，参比抗体包括A-1、A-2、A-3、A-4、A-5及A-6。在另一个实施方案中，抗体例如本发明的鼠抗体可与人胰高血糖素受体特异性结合，并能降低动物模型的血糖。在一个实施方案中，与未处理动物相比血糖降低2%；在另一个实施方案中，与未处理动物相比血糖降低5%；在另一个实施方案中，与未处理动物相比血糖降低10%；在另一个实施方案中，与未处理动物相比血糖降低15%，在另一个实施方案中为20%，在另一个实施方案中为25%或更多。血糖降低量由剂量控制，对于动物或人类患者而言，治疗有效剂量是为将血糖降低至正常范围的剂量。
适应症
糖尿病尤其是2型糖尿病及其并发症已经成为全世界日益严重的问题。通常，该疾病由胰脏β细胞胰岛素生成受损引起。在2型糖尿病（此疾病最常见的形式）中，人们认为遗传和环境因素联合引起β细胞衰竭，使得在人体中引起胰岛素分泌和活性受损以及胰岛素抵抗。一般认为肥胖症是促使成人甚至儿童中2型糖尿病增加的病症。
人们还认为血脂异常，或者异常HDL（高密度脂蛋白）和LDL（低密度脂蛋白）均与2型糖尿病相关。2型糖尿病的特征为肌肉和其它器官不能响应正常循环浓度的胰岛素。随后胰脏β细胞分泌胰岛素增多，即高胰岛素血症的病症。最终β细胞无法再补偿，导致葡萄糖耐量降低、空腹葡萄糖浓度受损、慢性高血糖和组织损伤。此外，人们认为早发2型糖尿病与血脂异常，或者异常HDL（高密度脂蛋白）和LDL（低密度脂蛋白）有关。代谢综合症患者都表现血脂异常和高血糖症。
本发明提供抗体，尤其是可与胰高血糖素受体体内结合、降低动物模型血糖浓度的人类抗体。抗体还可改善葡萄糖耐量。在一个实施方案中，本发明提供具有体内效价的完全人类抗体。对ob/ob小鼠单次注射抗体的作用可在注射后数天内降低血糖，为高血糖、2型糖尿病以及相关病症提供了有效、持久的治疗。单次注射抗体也可改善在下文所述食蟹猴上进行的葡萄糖耐量试验( GTT)中血样的葡萄糖清除率（改善葡萄糖耐量）。本发明的抗原结合蛋白，尤其是人类抗体可用于降低血液或血浆葡萄糖，改善葡萄糖耐量降低，改善空腹葡萄糖水平以及改善血脂异常。这样，本发明的抗原结合蛋白，尤其是人类抗体可用于治疗高血糖症、2型糖尿病、代谢综合症和包括血脂异常的其它相关症状。此外，已显示降低血糖可在某些情况下用于预防和治疗具体的癌症例如结肠癌，如Richardson等，Nature ClinPract Oncol 2:48-53 (2005)； Giovannucci等， Gastroenterology 132:2208-2225 (2007)； Krone等，Integrative Cancer Ther 4:25-31 (2005)；Chang等，Diabetologia 46:595-607 (2003)； Jee等，Yonsei Med J 46:449-55 (2005)所述。
 
具体实施:
1、免疫用抗原细胞稳定株的构建
接种CHO-DHFR^-至6孔板中，培养24h后转染，转染前更换培养液,按照Invitrogen公司推荐Lipofectamine 2000 的转染条件进行转染。48小时后，再换为含有10 nM MTX的完全培养基，每隔3天换液，待两周左右，出现稳定生长的克隆，消化分散细胞集落，待长至50%愈合度时，逐渐提高MTX的浓度进行加压筛选，直至MTX的浓度为10 uM。构建的稳定细胞株分别进行FACS检测，利用GCGR自制的抗体鉴定加压后的细胞群体，10 uM MTX筛选后的CHO-DHFR^-hGCGR细胞膜上hGCGR 有大量表达，最后经过亚克隆筛选、鉴定获得GCGR高表达细胞稳定株。
2、抗体的制备
将在弗氏佐剂中乳化的CHO-DHFR-hGCGR全细胞，以2x10^6个细胞/小鼠的剂量皮下注射BALB/c小鼠（6-8周龄）。2周后，使用不完全弗氏佐剂乳化免疫原，加强免疫小鼠，此后每周加强一次。通过剪尾的方式采血，离心分离血清，进行FACS检测血清效价。直至达到适合抗体滴度时，断颈处死小鼠，无菌状态下获取脾脏细胞。收集生长状态处于对数生长期的SP2/0细胞，2000rpm,3min 离心，沉淀用无血清培养至重悬，再次离心-重悬，计数。混合脾脏细胞和SP2/0细胞，保证SP2/0 ：脾脏细胞≥1:1，共“洗涤-离心”3次。弹散最后一次离心后的沉淀，逐滴加入1mL预温的PEG-1350（30s内滴完），上下吹吸1分钟，缓慢加入30mL预热的无血清培养基以终止PEG的融合作用，1500rpm，5min离心，弹散细胞沉淀，加入融合培养基，按每孔20000个脾细胞及5000个饲养层细胞铺于96 孔板中, 每孔100uL。融合后的杂交瘤细胞和饲养层细胞一起在96孔板中进行培养，并进行HAT（次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸苷）筛选，以除去非融合的细胞。10天后收取培养板中的杂交瘤细胞上清进行ELISA检测。
3、全细胞ELISA 筛选
将CHO-DHFR-hGCGR过表达hGCGR细胞和不表达hGCGR的CHO-DHFR-空白细胞分别接种至96孔板，长至90%愈合度。除去细胞培养上清，PBS洗两遍，加入100ul 100%甲醇4℃固定10min。再加入加入100 ul新鲜配制的0.6% H2O2- PBS，室温处理20min，PBS洗涤2遍。经过PBS-1%BSA封闭后，加入杂交瘤细胞上清4℃孵育90 min。多次洗涤后，每孔加入100ul 稀释的GxM-HRP-Fc二抗, 37℃孵育0.5h。洗涤5次后, 每孔加入100ul TMB显色底物，37℃反应15min，2M H₂SO₄终止，读取OD450值。阳性对照为免疫小鼠的血清；阴性对照为细胞培养基上清。选取分泌抗hGCGR抗体的杂交瘤株，进行克隆化以获得能稳定分泌针对hGCGR的细胞株。最后选取杂交瘤细胞分泌的抗体上清进行FACS验证。
4、阳性杂交瘤细胞上清流式分析鉴定（FACS）
用含10mM EDTA的PBS消化、收集10⁵个CHO-DHFR-hGCGR细胞，分别加入1.5ml EP管，离心后弃上清，阴性对照样本用流式上样缓冲液（PBS，2% FBS）重悬。阳性处理组细胞每管加200ul抗体上清，室温孵育；1500rpm离心，弃上清，用流式上样缓冲液洗一次，再离心，重悬，加入1:50稀释的FITC标记的羊抗鼠荧光二抗（BD，200ul/孔），室温避光孵育30 min；离心，弃上清，再用流式上样缓冲液洗一次，离心，最后用流式上样缓冲液重悬，上机检测。杂交瘤细胞上清和表达有GCGR的CHO-DHFR细胞有特异性结合，灰色峰和虚线峰为阴性对照，杂交瘤细胞上清对应的实线峰有明显右移（图1，2，3）。
5、抗体可变区基因的克隆以及抗体瞬时表达
收集分泌抗体的杂交瘤细胞，按照QIAGEN的mRNA抽提试剂盒操作规程，提取杂交瘤细胞的mRNA。然后将提取后的mRNA反转录成cDNA，逆转录引物为小鼠轻、重链恒定区的特异性引物，重链逆转录引物为(5’-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC -3’， SEQ ID NO: 61)，轻链逆转录引物为(5’- TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3’ ， SEQ ID NO: 62)和(5’- TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’ ， SEQ ID NO: 63)。将反转录的cDNA用0.1mM的TE稀释，通过超滤离心管纯化。取10ul的纯化后的cDNA作为模板，加入4 ul的5xtailing buffer，4 ul的dATP（1mM）和10U的末端转移酶（Promega）后混匀，37℃孵育5min后65℃ 5min；然后以加上PolyA尾的cDNA为模板，PCR扩增抗体的轻、重链可变区基因。上游引物均为OligodT，重链下游引物为（5’-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3’，SEQ ID NO: 64）和（5’-TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3’，SEQ ID NO: 65），轻链下游引物为（5’-ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3’，SEQ ID NO: 66）。PCR反应扩增，PCR产物连接到PMD 18-T载体后进行测序。
基于已测序得到的抗体的DNA序列设计PCR引物，从而将完整轻链、重链信号肽和可变域以及小鼠IgG1恒定区与表达载体pTM5相连。
6、抗原结合蛋白的重组表达
接种40ml对数生长期的悬浮HEK293表达细胞至T125转瓶中，取4ml新鲜培养液配置PEI-DNA转染复合物，按PEI:DNA（0.5ug/ml培养基）=3:1的比例混合PEI和DNA，室温放置15min后，全部加至细胞培养瓶中。24小时后，补加胰蛋白胨作为表达需要的氮源，再继续培养96小时以上，收集细胞上清直接进行功能性分析或用于抗原结合蛋白质的分离纯化。
7、HitHunter cAMP实验筛选功能性抗体
以每孔10000个接种表达hGCGR的CHO-DHFR-细胞至384孔细胞培养板，37℃培养过夜。第二天除去培养基上清后，加入10ul纯化后的抗体，37℃孵育15分钟，再加入5ul用无血清培养基稀释的Glucagon，37℃孵育30分钟。然后采用DiscoverX的HitHunter cAMP试剂盒检测生成的cAMP，即加入5ul cAMP抗体，20ul ED试剂、裂解缓冲液和发光底物的混合物，室温孵育1h，再加入20ul EA试剂室温继续孵育1h。最后在Molecular Devices的SpectraMax L酶标仪上读取相对荧光强度。同没有抑制剂存在的对照相比，A-1,A-2，A-3抗体上清明显抑制0.5nM胰高血糖素对GCGR受体的激活作用（图4）。
8、报告基因实验筛选功能性抗体
以每孔20000个接种共表达hGCGR-CRE-Luciferase的CHO-DHFR-细胞至96孔细胞培养板，37℃培养过夜。第二天除去培养基上清，用无血清培养基清洗细胞表面两次，吸去残液，加入50ul纯化后的抗体孵育30分钟，再加入50ul用无血清培养基稀释的Glucagon，37℃继续孵育4小时。刺激结束后，加入100ulPromega的Bright Glo化学发光底物裂解细胞，最后将细胞裂解物转移至白色96孔板，在Molecular Devices的SpectraMax L酶标仪上读取相对荧光强度。
 
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  杭州鸿运华宁生物医药工程有限公司
 
<120>  抗胰高血糖素受体的抗体及其用途
 
<130>  2013
 
<160>  66   
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  1434
<212>  DNA
<213>  人
 
<400>  1
atgcccccct gccagccaca gcgacccctg ctgctgttgc tgctgctgct ggcctgccag       60
 
ccacaggtcc cctccgctca ggtgatggac ttcctgtttg agaagtggaa gctctacggt      120
 
gaccagtgtc accacaacct gagcctgctg ccccctccca cggagctggt gtgcaacaga      180
 
accttcgaca agtattcctg ctggccggac acccccgcca ataccacggc caacatctcc      240
 
tgcccctggt acctgccttg gcaccacaaa gtgcaacacc gcttcgtgtt caagagatgc      300
 
gggcccgacg gtcagtgggt gcgtggaccc cgggggcagc cttggcgtga tgcctcccag      360
 
tgccagatgg atggcgagga gattgaggtc cagaaggagg tggccaagat gtacagcagc      420
 
ttccaggtga tgtacacagt gggctacagc ctgtccctgg gggccctgct cctcgccttg      480
 
gccatcctgg ggggcctcag caagctgcac tgcacccgca atgccatcca cgcgaatctg      540
 
tttgcgtcct tcgtgctgaa agccagctcc gtgctggtca ttgatgggct gctcaggacc      600
 
cgctacagcc agaaaattgg cgacgacctc agtgtcagca cctggctcag tgatggagcg      660
 
gtggctggct gccgtgtggc cgcggtgttc atgcaatatg gcatcgtggc caactactgc      720
 
tggctgctgg tggagggcct gtacctgcac aacctgctgg gcctggccac cctccccgag      780
 
aggagcttct tcagcctcta cctgggcatc ggctggggtg cccccatgct gttcgtcgtc      840
 
ccctgggcag tggtcaagtg tctgttcgag aacgtccagt gctggaccag caatgacaac      900
 
atgggcttct ggtggatcct gcggttcccc gtcttcctgg ccatcctgat caacttcttc      960
 
atcttcgtcc gcatcgttca gctgctcgtg gccaagctgc gggcacggca gatgcaccac     1020
 
acagactaca agttccggct ggccaagtcc acgctgaccc tcatccctct gctgggcgtc     1080
 
cacgaagtgg tctttgcctt cgtgacggac gagcacgccc agggcaccct gcgctccgcc     1140
 
aagctcttct tcgacctctt cctcagctcc ttccagggcc tgctggtggc tgtcctctac     1200
 
tgcttcctca acaaggaggt gcagtcggag ctgcggcggc gttggcaccg ctggcgcctg     1260
 
ggcaaagtgc tatgggagga gcggaacacc agcaaccaca gggcctcatc ttcgcccggc     1320
 
cacggccctc ccagcaagga gctgcagttt gggaggggtg gtggcagcca ggattcatct     1380
 
gcggagaccc ccttggctgg tggcctccct agattggctg agagcccctt ctga           1434
 
 
<210>  2
<211>  477
<212>  PRT
<213>  人
 
<400>  2
 
Met Pro Pro Cys Gln Pro Gln Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1               5                   10                  15     
 
 
Leu Ala Cys Gln Pro Gln Val Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe Leu
            20                  25                  30         
 
 
Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Gly Asp Gln Cys His His Asn Leu Ser
        35                  40                  45             
 
 
Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys
    50                  55                  60                 
 
 
Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Ala Asn Thr Thr Ala Asn Ile Ser
65                  70                  75                  80 
 
 
Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp His His Lys Val Gln His Arg Phe Val
                85                  90                  95     
 
 
Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gln Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly
            100                 105                 110        
 
 
Gln Pro Trp Arg Asp Ala Ser Gln Cys Gln Met Asp Gly Glu Glu Ile
        115                 120                 125            
 
 
Glu Val Gln Lys Glu Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Phe Gln Val Met
    130                 135                 140                
 
 
Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu
145                 150                 155                 160
 
 
Ala Ile Leu Gly Gly Leu Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Ala Ile
                165                 170                 175    
 
 
His Ala Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Ser Ser Val Leu
            180                 185                 190        
 
 
Val Ile Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Ile Gly Asp
        195                 200                 205            
 
 
Asp Leu Ser Val Ser Thr Trp Leu Ser Asp Gly Ala Val Ala Gly Cys
    210                 215                 220                
 
 
Arg Val Ala Ala Val Phe Met Gln Tyr Gly Ile Val Ala Asn Tyr Cys
225                 230                 235                 240
 
 
Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly Leu Ala
                245                 250                 255    
 
 
Thr Leu Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly Trp
            260                 265                 270        
 
 
Gly Ala Pro Met Leu Phe Val Val Pro Trp Ala Val Val Lys Cys Leu
        275                 280                 285            
 
 
Phe Glu Asn Val Gln Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp
    290                 295                 300                
 
 
Trp Ile Leu Arg Phe Pro Val Phe Leu Ala Ile Leu Ile Asn Phe Phe
305                 310                 315                 320
 
 
Ile Phe Val Arg Ile Val Gln Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala Arg
                325                 330                 335    
 
 
Gln Met His His Thr Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Lys Ser Thr Leu
            340                 345                 350        
 
 
Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val Val Phe Ala Phe Val
        355                 360                 365            
 
 
Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu Arg Ser Ala Lys Leu Phe Phe
    370                 375                 380                
 
 
Asp Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gln Gly Leu Leu Val Ala Val Leu Tyr
385                 390                 395                 400
 
 
Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ser Glu Leu Arg Arg Arg Trp His
                405                 410                 415    
 
 
Arg Trp Arg Leu Gly Lys Val Leu Trp Glu Glu Arg Asn Thr Ser Asn
            420                 425                 430        
 
 
His Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly His Gly Pro Pro Ser Lys Glu Leu
        435                 440                 445            
 
 
Gln Phe Gly Arg Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Ser Ala Glu Thr Pro
    450                 455                 460                
 
 
Leu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Leu Ala Glu Ser Pro Phe
465                 470                 475        
 
 
<210>  3
<211>  485
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  3
 
Met Pro Leu Thr Gln Leu His Cys Pro His Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1               5                   10                  15     
 
 
Val Leu Ser Cys Leu Pro Glu Ala Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe
            20                  25                  30         
 
 
Leu Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Asp Gln Cys His His Asn Leu
        35                  40                  45             
 
 
Ser Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp
    50                  55                  60                 
 
 
Lys Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Pro Asn Thr Thr Ala Asn Ile
65                  70                  75                  80 
 
 
Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Tyr His Lys Val Gln His Arg Leu
                85                  90                  95     
 
 
Val Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gln Trp Val Arg Gly Pro Arg
            100                 105                 110        
 
 
Gly Gln Pro Trp Arg Asn Ala Ser Gln Cys Gln Leu Asp Asp Glu Glu
        115                 120                 125             
 
 
Ile Glu Val Gln Lys Gly Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Gln Gln Val
    130                 135                 140                
 
 
Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala
145                 150                 155                 160
 
 
Leu Val Ile Leu Leu Gly Leu Arg Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr
                165                 170                 175    
 
 
Ile His Gly Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Gly Ser Val
            180                 185                 190        
 
 
Leu Val Ile Asp Trp Leu Leu Lys Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Ile Gly
        195                 200                 205            
 
 
Asp Asp Leu Ser Val Ser Val Trp Leu Ser Asp Gly Ala Met Ala Gly
    210                 215                 220                
 
 
Cys Arg Val Ala Thr Val Ile Met Gln Tyr Gly Ile Ile Ala Asn Tyr
225                 230                 235                 240
 
 
Cys Trp Leu Leu Val Glu Gly Val Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Ser Leu
                245                 250                 255    
 
 
Ala Thr Phe Ser Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly
            260                 265                 270        
 
 
Trp Gly Ala Pro Leu Leu Phe Val Ile Pro Trp Val Val Val Lys Cys
        275                 280                 285            
 
 
Leu Phe Glu Asn Val Gln Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe
    290                 295                 300                
 
 
Trp Trp Ile Leu Arg Ile Pro Val Phe Leu Ala Leu Leu Ile Asn Phe
305                 310                 315                 320
 
 
Phe Ile Phe Val His Ile Ile His Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala
                325                 330                 335    
 
 
His Gln Met His Tyr Ala Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Arg Ser Thr
            340                 345                 350        
 
 
Leu Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val Val Phe Ala Phe
        355                 360                 365            
 
 
Val Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu Arg Ser Thr Lys Leu Phe
    370                 375                 380                
 
 
Phe Asp Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gln Gly Leu Leu Val Ala Val Leu
385                 390                 395                 400
 
 
Tyr Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ala Glu Leu Met Arg Arg Trp
                405                 410                 415    
 
 
Arg Gln Trp Gln Glu Gly Lys Ala Leu Gln Glu Glu Arg Leu Ala Ser
            420                 425                 430        
 
 
Ser His Gly Ser His Met Ala Pro Ala Gly Pro Cys His Gly Asp Pro
        435                 440                 445            
 
 
Cys Glu Lys Leu Gln Leu Met Ser Ala Gly Ser Ser Ser Gly Thr Gly
    450                 455                 460                 
 
 
Cys Val Pro Ser Met Glu Thr Ser Leu Ala Ser Ser Leu Pro Arg Leu
465                 470                 475                 480
 
 
Ala Asp Ser Pro Thr
                485
 
 
<210>  4
<211>  1000
<212>  DNA
<213>  小鼠
 
<400>  4
atgcccctca cccagctcca ctgtccccac ctgctgctgc tgctgttggt gctgtcatgt       60
 
ctgccagagg caccctctgc ccaggtaatg gactttttgt ttgagaagtg gaagctctat      120
 
agtgaccaat gtcaccacaa cctaagcctg ctgcccccac ctactgagct ggtctgtaac      180
 
agaaccttcg acaactactc ctgctggcct gacacccctc ccaacaccac tgccaacatt      240
 
tcctgcccct ggtacctacc ttggtgccac aaagtgcagc accgcctagt gttcaagagg      300
 
tgtgggcccg atgggcagtg ggttcgaggg ccacgggggc agccgtggcg caacgcctcc      360
 
caatgtcagt tggatgatga agagatcgag gtccagaagg gggtggccaa gatgtatagc      420
 
agccagcagg tgatgtacac cgtgggctac agtctgtccc tgggggcctt gctccttgcg      480
 
ctggtcatcc tgctgggcct caggaagctg cactgcaccc gaaactacat ccatgggaac      540
 
ctgtttgcgt cctttgtgct caaggctggc tctgtgttgg tcatcgattg gctgctgaag      600
 
acacggtaca gccagaagat tggcgatgac ctcagtgtga gcgtctggct cagtgacggg      660
 
gcgatggccg gctgcagagt ggccacagtg atcatgcagt acggcatcat acccaactat      720
 
tgctggttgc tggtagaggg cgtgtacctg tacagcctgc tgagccttgc caccttctct      780
 
gagaggagct tcttttccct ctacctgggc attggctggg gtgcgcccct gctgtttgtc      840
 
atcccctggg tggtggtcaa gtgtctgttt gagaatgttc agtgctggac cagcaatgac      900
 
aacatgggat tctggtggat cctgcgtatt cctgtcttcc tggccttact gatcaatttt      960
 
ttcatctttg tccacatcat tcaacttctt gtggccaagc                           1000
 
 
<210>  5
<211>  12
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  5
 
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val
1               5                   10         
 
 
<210>  6
<211>  10
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  6
 
Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr
1               5                   10 
 
 
<210>  7
<211>  4
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  7
 
Ala Asn Leu Tyr
1              
 
 
<210>  8
<211>  111
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  8
 
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15     
 
 
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30         
 
 
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                  40                  45             
 
 
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Val Glu Glu Phe
    50                  55                  60                 
 
 
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Asp Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80 
 
 
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95      
 
 
Ala Asn Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110    
 
 
<210>  9
<211>  333
<212>  DNA
<213>  小鼠
 
<400>  9
cagatacagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc       60
 
tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaaacaggct      120
 
ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacca acactggaga gccaacatat      180
 
gttgaagagt tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgacag cactgcctat      240
 
ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aaacctttac      300
 
tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tca                                   333
 
 
<210>  10
<211>  12
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  10
 
Gln Asn Ile Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
1               5                   10         
 
 
<210>  11
<211>  10
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  11
 
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
1               5                   10 
 
 
<210>  12
<211>  9
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  12
 
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr
1               5                  
 
 
<210>  13
<211>  112
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  13
 
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Leu His Ser
            20                  25                  30         
 
 
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45             
 
 
Pro Lys Leu Leu Ile Phe Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60                 
 
 
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80 
 
 
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95     
 
 
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110        
 
 
<210>  14
<211>  336
<212>  DNA
<213>  小鼠
 
<400>  14
gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc       60
 
atctcttgca gatctagtca gaacatttta catagtaatg ggaacaccta tttagaatgg      120
 
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct tcaaagtttc caaccgattt      180
 
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc      240
 
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg      300
 
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa                                336
 
 
<210>  15
<211>  10
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  15
 
Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Glu Pro Thr Tyr
1               5                   10 
 
 
<210>  16
<211>  14
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  16
 
Thr Arg Glu Tyr Tyr Ile Ser Asn Tyr Gly Ala Met Asp Tyr
1               5                   10                  
 
 
<210>  17
<211>  121
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  17
 
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15     
 
 
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30         
 
 
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                  40                  45             
 
 
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
    50                  55                  60                 
 
 
Lys Gly Arg Cys Ala Phe Phe Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80 
 
 
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95     
 
 
Thr Arg Glu Tyr Tyr Ile Ser Asn Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110        
 
 
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                 120    
 
 
<210>  18
<211>  363
<212>  DNA
<213>  小鼠
 
<400>  18
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc       60
 
tcctgcaagg cttctggata taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct      120
 
ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg attaacacct acaatggaga gccaacatat      180
 
gctgatgact tcaagggacg gtgtgccttt tttttggaaa cctctgccag cactgcctat      240
 
ctgcaactca acaacctcaa aaatgaggac acggctacct atttctgtac aagagaatat      300
 
tacattagta attacggggc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc      360
 
tca                                                                    363
 
 
<210>  19
<211>  12
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  19
 
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
1               5                   10         
 
 
<210>  20
<211>  10
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  20
 
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
1               5                   10 
 
 
<210>  21
<211>  9
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  21
 
Gln Gln Gly Ile Leu Phe Pro Leu Thr
1               5                  
 
 
<210>  22
<211>  107
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  22
 
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30         
 
 
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45             
 
 
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60                 
 
 
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ala Asn Leu Asp Gln
65                  70                  75                  80 
 
 
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Leu Phe Pro Leu
                85                  90                  95     
 
 
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105        
 
 
<210>  23
<211>  321
<212>  DNA
<213>  小鼠
 
<400>  23
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctttgggaga cagagtcacc       60
 
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca      120
 
gatggaactg ttaaactcct gatctattac acatcaagat tacactcagg agtcccatca      180
 
aggttcagtg gcagtgggtc tggagcagat tattctctca ccattgccaa cctggatcaa      240
 
gaagatattg ccacttactt ttgccagcag ggtattctgt ttccgctcac gttcggtgct      300
 
gggaccaagc tggagctgaa a                                                321
 
 
<210>  24
<211>  12
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  24
 
Gly Phe Pro Phe Ser Asp Tyr Gly Leu Ala Trp Phe
1               5                   10         
 
 
<210>  25
<211>  10
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  25
 
Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Thr Tyr Tyr
1               5                   10 
 
 
<210>  26
<211>  9
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  26
 
Ala Arg Asp Arg Gly Leu Phe Asp Tyr
1               5                  
 
 
<210>  27
<211>  116
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  27
 
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30         
 
 
Gly Leu Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
        35                  40                  45             
 
 
Ala Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
    50                  55                  60                 
 
 
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80 
 
 
Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95     
 
 
Ala Arg Asp Arg Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
            100                 105                 110        
 
 
Thr Val Ser Ser
        115    
 
 
<210>  28
<211>  348
<212>  DNA
<213>  小鼠
 
<400>  28
gaggtgaaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc       60
 
tcctgtgcag cctctggatt ccctttcagt gactacggat tggcgtggtt tcgacaggct      120
 
ccagggaagg ggcctgaatg ggtagcgttc attagtaatt tggcatatag tacctactat      180
 
gcagacactg tgacgggccg attcaccatc tctagagaga atgccaagaa caccctgttc      240
 
ctggaaatga gcagtctgag gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagggatagg      300
 
gggctgtttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca                   348
 
 
<210>  29
<211>  12
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  29
 
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
1               5                   10         
 
 
<210>  30
<211>  10
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  30
 
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10 
 
 
<210>  31
<211>  114
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  31
 
Asp Val Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30         
 
 
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45             
 
 
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60                 
 
 
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80 
 
 
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95     
 
 
Thr His Val Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110        
 
 
Lys Arg
       
 
 
<210>  32
<211>  342
<212>  DNA
<213>  小鼠
 
<400>  32
gatgttgtga tgacccaaat tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc       60
 
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg      120
 
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt      180
 
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc      240
 
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttcct      300
 
ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gg                         342
 
 
<210>  33
<211>  12
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  33
 
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val
1               5                   10         
 
 
<210>  34
<211>  10
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  34
 
Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
1               5                   10 
 
 
<210>  35
<211>  15
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  35
 
Ala Ser Gly Gly Phe Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asn Phe Asp Val
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  36
<211>  121
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  36
 
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30         
 
 
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45             
 
 
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60                  
 
 
Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80 
 
 
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95     
 
 
Ser Gly Gly Phe Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asn Phe Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110        
 
 
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120    
 
 
<210>  37
<211>  363
<212>  DNA
<213>  小鼠
 
<400>  37
gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc       60
 
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgaca tgtcttgggt gcgccagact      120
 
ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc ataagtagtg gtggtagtac gtactatcca      180
 
gacagtgtga agggccgatt catcatttcc agagataatg tcaggaatat cctgtacctg      240
 
caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag tggagggttt      300
 
tactacggta gtacctacaa cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc      360
 
tca                                                                    363
 
 
<210>  38
<211>  12
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  38
 
Gln Asp Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln
1               5                   10         
 
 
<210>  39
<211>  10
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  39
 
Arg Ala Asn Arg Leu Ile His Gly Val Pro
1               5                   10 
 
 
<210>  40
<211>  9
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  40
 
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe Thr
1               5                  
 
 
<210>  41
<211>  107
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  41
 
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Ser Gly Tyr
            20                  25                  30         
 
 
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
        35                  40                  45             
 
 
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Ile His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60                 
 
 
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65                  70                  75                  80 
 
 
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe
                85                  90                  95     
 
 
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105        
 
 
<210>  42
<211>  321
<212>  DNA
<213>  小鼠
 
<400>  42
gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact       60
 
atcacttgca aggcgagtca ggacattagt ggctatttaa gctggttcca gcagaaacca      120
 
ggcaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tgatacatgg ggtcccatca      180
 
aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat      240
 
gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccattcac gttcggctcg      300
 
gggacaaagt tggaaataaa a                                                321
 
 
<210>  43
<211>  12
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  43
 
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val
1               5                   10         
 
 
<210>  44
<211>  10
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  44
 
Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr
1               5                   10 
 
 
<210>  45
<211>  15
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  45
 
Ala Ser Gly Gly Phe Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asn Phe Asp Val
1               5                   10                  15 
 
 
<210>  46
<211>  122
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  46
 
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
            20                  25                  30         
 
 
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45             
 
 
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
    50                  55                  60                  
 
 
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80 
 
 
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95     
 
 
Ala Ser Gly Gly Phe Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asn Phe Asp Val Trp
            100                 105                 110        
 
 
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120        
 
 
<210>  47
<211>  363
<212>  DNA
<213>  小鼠
 
<400>  47
gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc       60
 
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgaca tgtcttgggt gcgccagact      120
 
ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc ataagtagtg gtggtagtac gtactatcca      180
 
gacagtgtga agggccgatt catcatttcc agagataatg tcaggaatat cctgtacctg      240
 
caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag tggagggttt      300
 
tactacggta gtacctacaa cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc      360
 
tca                                                                    363
 
 
<210>  48
<211>  12
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  48
 
Gln Gly Thr Ser Ile Asn Leu Asn Trp Phe Gln Gln
1               5                   10         
 
 
<210>  49
<211>  10
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  49
 
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro
1               5                   10 
 
 
<210>  50
<211>  6
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  50
 
Leu Gln His Ser Tyr Leu
1               5      
 
 
<210>  51
<211>  94
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  51
 
Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Asp Ile Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn
            20                  25                  30         
 
 
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45             
 
 
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60                 
 
 
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Asp
65                  70                  75                  80 
 
 
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Ser Tyr Leu
                85                  90                 
 
 
<210>  52
<211>  282
<212>  DNA
<213>  小鼠
 
<400>  52
gatgtccaga tgattcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctttgggaga catagtcacc       60
 
atgacttgcc aggcaagtca gggcactagc attaatttaa actggtttca gcaaaaacca      120
 
gggaaagctc ctaagctcct gatctatggt gcaagcaact tggaagatgg ggtcccatca      180
 
aggttcagtg gcagtagata tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctggaggat      240
 
gaagatatgg caacttattt ctgtctacag catagttatc tc                         282
 
 
<210>  53
<211>  12
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  53
 
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser Gly Met His Trp Val
1               5                   10         
 
 
<210>  54
<211>  10
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  54
 
Ile Ser Ser Asp Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr
1               5                   10 
 
 
<210>  55
<211>  13
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  55
 
Ala Arg Pro Tyr Tyr Phe Gly Ser Thr Ser Phe Asp Tyr
1               5                   10             
 
 
<210>  56
<211>  120
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  56
 
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser
            20                  25                  30         
 
 
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45             
 
 
Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
    50                  55                  60                 
 
 
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80 
 
 
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95     
 
 
Ala Arg Pro Tyr Tyr Phe Gly Ser Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110        
 
 
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
 
<210>  57
<211>  360
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  57
 
Gly Ala Thr Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr
            20                  25                  30         
 
 
Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly
        35                  40                  45             
 
 
Thr Cys Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr
    50                  55                  60                 
 
 
Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr
65                  70                  75                  80 
 
 
Cys Ala Cys Thr Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr
                85                  90                  95     
 
 
Gly Gly Ala Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Thr Cys
            100                 105                 110        
 
 
Gly Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Ala
        115                 120                 125            
 
 
Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys
    130                 135                 140                
 
 
Gly Cys Ala Thr Ala Cys Ala Thr Thr Ala Gly Thr Ala Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
 
 
Ala Cys Ala Gly Thr Ala Gly Thr Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Ala
                165                 170                 175    
 
 
Cys Thr Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly
            180                 185                 190        
 
 
Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala
        195                 200                 205            
 
 
Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Ala Ala Thr Cys Cys
    210                 215                 220                
 
 
Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys
225                 230                 235                 240
 
 
Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala Gly Thr Cys
                245                 250                 255    
 
 
Thr Gly Ala Gly Gly Thr Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys
            260                 265                 270        
 
 
Gly Gly Cys Cys Ala Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr
        275                 280                 285            
 
 
Gly Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr
    290                 295                 300                
 
 
Thr Cys Gly Gly Thr Ala Gly Thr Ala Cys Thr Thr Cys Cys Thr Thr
305                 310                 315                 320
 
 
Thr Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala
                325                 330                 335    
 
 
Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Ala Gly
            340                 345                 350        
 
 
Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala
        355                 360
 
 
<210>  58
<211>  12
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  58
 
Gln Asp Ile Asn Gly Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln
1               5                   10         
 
 
<210>  59
<211>  107
<212>  PRT
<213>  小鼠
 
<400>  59
 
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Gly Tyr
            20                  25                  30         
 
 
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
        35                  40                  45             
 
 
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Ile Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60                 
 
 
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Ser Leu Glu Tyr
65                  70                  75                  80 
 
 
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe
                85                  90                  95     
 
 
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105        
 
 
<210>  60
<211>  321
<212>  DNA
<213>  小鼠
 
<400>  60
gacatccaga tgacccaatc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact       60
 
atcacttgca aggcgagtca ggacattaat ggctatttaa gctggttcca gcagaaacca      120
 
gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tgatagatgg ggtcccatca      180
 
aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcggcag cctggaatat      240
 
gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccattcac gttcggctcg      300
 
gggacaaagt tggaaataaa a                                                321
 
 
<210>  61
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  61
tttggrggga agatgaagac                                                   20
 
 
<210>  62
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  62
ttaacactct cccctgttga a                                                 21
 
 
<210>  63
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  63
ttaacactca ttcctgttga a                                                 21
 
 
<210>  64
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  64
tggacaggga tccagagttc c                                                 21
 
 
<210>  65
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  65
tggacagggc tccatagttc c                                                 21
 
 
<210>  66
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  66
actcgtcctt ggtcaacgtg                                                   20