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1、10申请公布号CN104193811A43申请公布日20141210CN104193811A21申请号201410405712122申请日20140818C07K14/415200601C12N15/29200601C12Q1/6820060171申请人中国烟草总公司郑州烟草研究院地址450001河南省郑州市高新技术产业开发区枫杨街2号72发明人曹培健王燃许亚龙李泽锋卢鹏杨军李锋魏春阳罗朝鹏金立锋林福呈74专利代理机构郑州优盾知识产权代理有限公司41125代理人郑园张真真54发明名称烟草热休克蛋白基因及其应用57摘要本发明公开了一种烟草热休克蛋白基因，其碱基序列如SEQIDNO1所示。本发明利。
2、用烟草各个发育时期的44个组织样品，通过实时荧光定量PCR实验比较HSC701基因与烟草常用的8个内参基因的表达稳定性，发现其表达稳定性优于所有8个常用内参基因。可见，将HSC701基因应用于烟草实时荧光定量PCR实验中，能够提高相对定量结果的准确性，为烟草实时荧光定量PCR实验提供了一个新的工具。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表6页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表6页附图5页10申请公布号CN104193811ACN104193811A1/1页21一种烟草热休克蛋白基因，其碱基序列如SEQIDNO1所示。2如权利要求1所述的烟。
3、草热休克蛋白基因，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。3烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分析的应用。4如权利要求3所述的烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分析的应用，其特征在于所述烟草实时荧光定量PCR的特异性引物对为SEQIDNO3和SEQIDNO4。权利要求书CN104193811A1/5页3烟草热休克蛋白基因及其应用技术领域0001本发明涉及烟草实时荧光定量PCR实验中内参基因的选择，特别是涉及烟草热休克蛋白基因HSC701作为新的内参基因在实时荧光定量PCR中的应用。背景技术0002实时荧光定量PCR是基因表达研究的一种重要研究手段，具有定量。
4、准确、灵敏度高、重复性好等特点。为了消除模板质量/数量、PCR反应效率、实验材料差异等因素对定量结果的影响，实时荧光定量PCR通常使用内参基因进行校正和标准化，其结果的准确性很大程度上取决于内参基因的选择。0003烟草实时荧光定量PCR研究中通常使用持家基因作为内参基因，因为持家基因参与植物的基本生化代谢过程，是植物维持生命活动所必需的，其在所有的细胞和生理状态下都较稳定地表达。但已有研究结果表明，持家基因在不同组织器官和发育时期样品中的稳定性不同，其表达并不是恒定不变的。因此持家基因作为内参基因存在缺陷，需要寻找新的内参基因。发明内容0004本发明的目的在于寻找表达稳定性显著优于传统内参基因。
5、的基因，进而为烟草实时荧光定量PCR实验提供新的内参基因。0005本发明的技术方案是一种烟草热休克蛋白基因，其碱基序列如SEQIDNO1所示。0006一种烟草热休克蛋白基因，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0007烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分析的应用。0008所述的烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分析的应用，所述烟草实时荧光定量PCR的特异性引物对为SEQIDNO3和SEQIDNO4。0009本发明中烟草热休克蛋白基因是一个新发现的烟草实时荧光定量PCR内参基因，通过与烟草中常用的8个内参基因的表达稳定性比较，烟草热休克蛋白基因表达稳定性。
6、优于所有8个常用内参基因。鉴于该基因的应用价值及其利用潜力的应用前景，有必要通过专利加以保护。0010本发明提供的烟草新内参基因编码烟草热休克蛋白，来源于烟草NICOTIANATABACUM，命名HSC701。0011本发明的烟草热休克蛋白基因HSC701可以是CDNA序列，也可以是基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。0012本发明的有益效果是利用烟草各个发育时期的44个组织样品每个样品3个重复，通过实时荧光定量PCR实验比较HSC701基因与烟草常用的8个内参基因的表达稳定性，发现其表达稳定性优于所有8个常用内参基因。可见，将HSC701基因应。
7、用于烟草实时荧光定量PCR实验中，能够提高相对定量结果的准确性，为烟草实时荧光定量PCR实验提供说明书CN104193811A2/5页4了一个新的工具。附图说明0013图1为烟草热休克蛋白基因的实时荧光定量PCR溶解曲线；0014图2为常用内参基因ACTIN的实时荧光定量PCR溶解曲线；0015图3为常用内参基因PP2A的实时荧光定量PCR溶解曲线；0016图4为常用内参基因L25的实时荧光定量PCR溶解曲线；0017图5为常用内参基因NTUBC2的实时荧光定量PCR溶解曲线；0018图6为常用内参基因EF1的实时荧光定量PCR溶解曲线；0019图7为常用内参基因TUBULIN的实时荧光定量P。
8、CR溶解曲线；0020图8为常用内参基因TUBULIN的实时荧光定量PCR溶解曲线；0021图9为常用内参基因18SRRNA的实时荧光定量PCR溶解曲线。具体实施方式0022一种烟草热休克蛋白基因，其碱基序列如SEQIDNO1所示。0023所述的烟草热休克蛋白基因，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0024烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分析的应用，针对所述烟草热休克蛋白基因设计PCR引物，在烟草中开展基于实时荧光定量PCR实验的定量表达分析。0025所述的烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分析的应用，所述烟草实时荧光定量PCR的特异性引物对为SE。
9、QIDNO3和SEQIDNO4。0026烟草中常用的内参基因为8个持家基因，包括ACTIN、PP2A、L25、NTUBC2、EF1、TUBULIN、TUBULIN和18SRRNA。基于芯片数据和实时荧光定量PCR实验，比较所述烟草热休克蛋白基因与烟草常用的8个内参基因的表达稳定性，发现其表达稳定性优于所有8个常用内参基因。将烟草热休克蛋白基因应用于烟草实时荧光定量PCR实验中，能够提高定量结果的准确性。00271、基于芯片数据的表达稳定性分析0028使用EBIARRAYEXPRESS数据库中的100张AFFYMETRIX芯片数据数据编号EMTAB176，比较烟草热休克蛋白基因HSC701与8个。
10、常用烟草内参基因的表达稳定性，结果见表1，其中变异系数越小表明该基因表达稳定性越高。表1结果表明，烟草热休克蛋白基因表达稳定性优于所有8个常用烟草内参基因。0029表1烟草热休克蛋白基因和常用内参基因芯片数据分析结果0030说明书CN104193811A3/5页500312、基于实时荧光定量PCR实验的表达稳定性分析003221引物设计0033根据烟草热休克蛋白基因的序列设计PCR引物，所得引物通过BLAST比对确保引物特异性良好。通过对设计的引物进行筛选，确定实验用引物。8个常用内参基因的引物使用文献中已经报道的引物。具体信息见表2。0034表2引物序列信息表00350036说明书CN104。
11、193811A4/5页6003722烟草样品与RNA提取0038烟草组织样品取自红花大金元完整生长周期内，覆盖种期胚根“露白”、猫耳期、团棵期、旺长期、现蕾期、盛花期、下部叶成熟期和中部叶成熟期，包括种子、根、茎、叶、须根、花蕾、花萼、花冠、花药、花丝、柱头、花柱、子房、雄蕊和果皮等组织器官，共计44个样品，每个样品3个重复。总RNA提取使用TRIPURE试剂。003923实时荧光定量PCR实验0040总RNA反转录为CDNA采用TAKARA公司反转录试剂盒后，使用BIORADCFX96仪器进行QRTPCR实验。20L反应体系1LCDNA；10LQIAGENSYBRGREEN；5LRNASEF。
12、REEH2O；上下游引物各2L。PCR反应条件95预变性5MIN；95变性10S，60退火30S，循环40次；溶解曲线绘制。烟草热休克蛋白基因和8个常用内参基因的实时荧光定量PCR溶解曲线图19表明，其引物扩增特异性良好。004124数据分析0042使用BIORADCFXMANAGER软件分析PCR实验结果，获得每个基因的CT值，绘制溶解曲线。CT值导入QBASE软件，QBASE软件通过计算GENORMMGENESTABILITYMEASURE比较内参基因在不同样品中的表达稳定性，GENORMM值越低，基因表达稳定越好。0043表3实时荧光定量PCR实验表达稳定性分析结果0044基因GENOR。
13、MVHSC7010478L250493EF10523NTUBC20671TUBULIN0818说明书CN104193811A5/5页718SRRNA09150045TUBULIN1010ACTIN1113PP2A12510046GENORM分析结果表明表3，烟草热休克蛋白基因表达稳定性优于所有8个常用烟草内参基因，将其应用于烟草实时荧光定量PCR实验中，能够提高定量结果的准确性。说明书CN104193811A1/6页80001序列表CN104193811A2/6页900020003序列表CN104193811A3/6页100004序列表CN104193811A104/6页110005序列表CN104193811A115/6页120006序列表CN104193811A126/6页13序列表CN104193811A131/5页14图1图2说明书附图CN104193811A142/5页15图3图4说明书附图CN104193811A153/5页16图5图6说明书附图CN104193811A164/5页17图7图8说明书附图CN104193811A175/5页18图9说明书附图CN104193811A18。