《一种光生物细胞的培养方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种光生物细胞的培养方法.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104195045A43申请公布日20141210CN104195045A21申请号201410401933122申请日20140814C12N1/12200601C12R1/8920060171申请人新奥科技发展有限公司地址065001河北省廊坊市经济技术开发区华祥路新奥科技园南区B座522室72发明人王琳朱振旗许永陈传红74专利代理机构北京中博世达专利商标代理有限公司11274代理人申健54发明名称一种光生物细胞的培养方法57摘要本发明提供了一种光生物细胞的培养方法，属于细胞培养领域，以提高光生物细胞的产量。所述光生物细胞的培养方法包括利用第一营养液在介质上接种光生物细胞。
2、，直至所述介质上附着的光生物细胞不再增加；对所述介质上附着的光生物细胞进行给光培养，并向所述介质上附着的光生物细胞提供第二营养液，所述第二营养液沿细胞表层到底层的方向传递，得到光生物细胞的细胞聚集体；所述细胞聚集体包括直接附着在所述介质上的底层细胞和未直接附着在所述介质上的易脱离细胞。本发明可用于光生物细胞和/或其代谢物的生产中。51INTCL权利要求书2页说明书6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页10申请公布号CN104195045ACN104195045A1/2页21一种光生物细胞的培养方法，其特征在于，包括利用第一营养液在介质上接种光生物细胞，直至。
3、所述介质上附着的光生物细胞不再增加；对所述介质上附着的光生物细胞进行给光培养，并向所述介质上附着的光生物细胞提供第二营养液，所述第二营养液沿细胞表层到底层的方向传递，得到光生物细胞的细胞聚集体；所述细胞聚集体包括直接附着在所述介质上的底层细胞和未直接附着在所述介质上的易脱离细胞。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种包括将光生物细胞加入到所述第二营养液中，获得所述第一营养液；利用所述第一营养液对所述介质进行淋洗，使光生物细胞附着在所述介质上；重复上述步骤，直至所述介质上附着的光生物细胞不再增加。3根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种包括将光生物细胞加入到所述第二营养液中，获。
4、得所述第一营养液；将所述介质浸润在所述第一营养液中，使光生物细胞附着在所述介质上；重复上述步骤，直至所述介质上附着的光生物细胞不再增加。4根据权利要求13任一项所述的方法，其特征在于，光生物细胞附着在所述介质的两侧。5根据权利要求4所述的方法，其特征在于，分别向所述介质的两侧提供所述第二营养液，所述第二营养液从所述介质两侧分别沿细胞表层到底层的方向传递。6根据权利要求13任一项所述的方法，其特征在于，所述接种在所述介质上附着的光生物细胞不再增加后还包括对附着有光生物细胞的所述介质进行给光预培养，得到附着在所述介质上的细胞聚集体；待给光预培养结束后，收集所述细胞聚集体中未直接附着在介质上的易脱离。
5、细胞；利用所述第二营养液对所述介质进行淋洗或将所述介质浸润在所述第二营养液中，收集所述介质上残留的易脱离细胞，获得稳固附着有光生物细胞的所述介质。7根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将收集到的所述易脱离细胞再次加入到所述第二营养液中。8根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述介质选自柔性材料、亲水材料和柔性亲水材料中的一种。9根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述介质为表面具有粗糙度和/或绒毛和/或孔洞和/或通孔的所述柔性亲水材料。10根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光生物细胞选自球状藻、丝状藻、弧形藻、三角形藻、多角形藻、栅藻、小球藻、绿球藻、红球藻、丝状绿藻和丝状蓝藻中。
6、的一种或多种。11根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述得到光生物细胞的细胞聚集体之后还包括收集所述细胞聚集体中未直接附着在介质上的易脱离细胞；权利要求书CN104195045A2/2页3重复上述给光培养和收集过程。权利要求书CN104195045A1/6页4一种光生物细胞的培养方法技术领域0001本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种光生物细胞的培养方法。背景技术0002光生物细胞的大规模、高产养殖是制约其产业化发展的瓶颈，低成本、高效培养方式的开发是规模化生产的关键。目前，光生物细胞的培养方法为水体培养，具体为在跑道池或反应器中将光生物细胞和营养物、水进行混合，并向其提供适宜的光照，使。
7、其自然生长。但在实际应用中发现，采用水体培养方式对光生物细胞进行培养时，很容易受到光利用率的限制，使其不能满足目前光生物细胞培养技术的需求。0003为了更好地提高光生物细胞的光利用率，“附着培养”方法被应用于光生物细胞的培养，具体为将光生物细胞附着在介质的一侧进行生长，并向介质的另一侧提供营养液，以使营养液依次经由布水层、介质、再由细胞底层向表层提供营养液。但在利用上述方法培养光生物细胞的过程中，由于布水层和介质材料的性质、细胞层厚度等均会对营养液的传递造成影响，使得营养液在传递的过程中，光生物细胞无法获得与其实际生长条件相匹配的营养液所需量，致使光生物细胞的整体产量不高。发明内容0004本发。
8、明实施例提供了一种光生物细胞的培养方法，以提高光生物细胞的产量。0005为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案0006一种光生物细胞的培养方法，包括0007利用第一营养液在介质上接种光生物细胞，直至所述介质上附着的光生物细胞不再增加；0008对所述介质上附着的光生物细胞进行给光培养，并向所述介质上附着的光生物细胞提供第二营养液，所述第二营养液沿细胞表层到底层的方向传递，得到光生物细胞的细胞聚集体；0009所述细胞聚集体包括直接附着在所述介质上的底层细胞和未直接附着在所述介质上的易脱离细胞。0010可选地，所述接种包括0011将光生物细胞加入到所述第二营养液中，获得所述第一营养液；001。
9、2利用所述第一营养液对所述介质进行淋洗，使光生物细胞附着在所述介质上；0013重复上述步骤，直至所述介质上附着的光生物细胞不再增加。0014可选地，所述接种包括0015将光生物细胞加入到所述第二营养液中，获得所述第一营养液；0016将所述介质浸润在所述第一营养液中，使光生物细胞附着在所述介质上。0017重复上述步骤，直至所述介质上附着的光生物细胞不再增加。0018优选地，光生物细胞附着在所述介质的两侧。说明书CN104195045A2/6页50019进一步地，分别向所述介质的两侧提供所述第二营养液，所述第二营养液从所述介质两侧分别沿细胞表层到底层的方向传递。0020可选地，所述接种在所述介质上。
10、附着的光生物细胞不再增加后还包括0021对附着有光生物细胞的所述介质进行给光预培养，得到附着在所述介质上的细胞聚集体；0022待给光预培养结束后，收集所述细胞聚集体中未直接附着在介质上的易脱离细胞；0023利用所述第二营养液对所述介质进行淋洗或将所述介质浸润在所述第二营养液中，收集所述介质上残留的易脱离细胞，获得稳固附着有光生物细胞的所述介质。0024进一步地，将收集到的所述易脱离细胞再次加入到所述第二营养液中。0025优选地，所述介质选自柔性材料、亲水材料和柔性亲水材料中的一种。0026进一步地，所述介质为表面具有粗糙度和/或绒毛和/或孔洞和/或通孔的所述柔性亲水材料。0027可选地，所述光。
11、生物细胞选自球状藻、丝状藻、弧形藻、三角形藻、多角形藻、栅藻、小球藻、绿球藻、红球藻、丝状绿藻和丝状蓝藻中的一种或多种。0028可选地，在所述得到光生物细胞的细胞聚集体之后还包括0029收集所述细胞聚集体中未直接附着在介质上的易脱离细胞；0030重复上述给光培养和收集过程。0031本发明提供了一种光生物细胞的培养方法，该方法将光生物细胞接种在介质上，使第二营养液沿细胞表层到底层的方向进行传递。与现有方法相比，本发明中所涉及的营养液供给方式能够使生长最旺盛的易脱离细胞得到充足的营养液，同时，使基本处于休眠状态的底层细胞也能获得所必需的营养液。通过对营养液进行合理分配，使光生物细胞的产量得到提高。。
12、具体实施方式0032下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。0033下面对本发明实施例提供的光生物细胞的培养方法进行详细描述。0034本发明实施例提供了一种光生物细胞的培养方法，包括利用第一营养液在介质上接种光生物细胞，直至所述介质上附着的光生物细胞不再增加；对所述介质上附着的光生物细胞进行给光培养，并向所述介质上附着的光生物细胞提供第二营养液，所述第二营养液沿细胞表层到底层的方向传递，得到光生物细胞的细。
13、胞聚集体。所述细胞聚集体包括直接附着在所述介质上的底层细胞和未直接附着在所述介质上的易脱离细胞。0035目前在对光生物细胞进行“附着培养”的过程中，布水层和介质材料的性质、细胞层厚度等均会对营养液向细胞表层方向的供给造成影响。若布水层持液量大、质地均匀，介质层亲水性、通透性好，则利于营养液向底层细胞的传输；而随着光生物细胞的生长，细胞层厚度持续增加，且部分光生物细胞间的空隙缩小，各层细胞间的通透性较低如某些光说明书CN104195045A3/6页6生物细胞排列紧实，某些光生物细胞在生长的同时向胞外分泌粘性物质等，这在很大程度上限制了营养液从细胞底层向表层的传输，致使向细胞表层供给营养物不足。0。
14、036对应于上述情况，在本发明实施例中，第二营养液沿细胞表层到底层的方向进行渗透，以使易脱离细胞在获得较多营养液的同时，底层细胞获得足够维持其生长的营养液，从而提供较高的光生物细胞的整体产量。可以理解的是，向所述附着有光生物细胞的所述介质提供第二营养液的具体方式可以有喷淋、滴灌、浸润、雾化等，本发明并不对向所述介质提供第二营养液的具体方式作具体限定。0037在本发明实施例中，介质为具有持液能力的介质如多孔材质或亲水材料，以确保营养液在沿细胞表层到底层的方向进行渗透的过程中被细胞充分的吸收。0038所述第一营养液为添加有光生物细胞的营养液。所述第二营养液为未添加有光生物细胞的营养液。在本实施例中。
15、，第二营养液包括水和/或营养物质和/或生长因子，营养物质包括碳源、氮源、微量元素、金属盐等，该营养物质中的碳源和氮源可以以气态如CO2、NO2等或液态指将碳源、氮源的物质溶于液体中形式对细胞进行供给，优选以液态形式供给。需要说明的是，所述培养过程中光照强度、营养物的组分及其各组分含量可以根据实际培养的光生物细胞的生长需求变化而进行调节。0039在本发明实施例中，细胞聚集体是在培养过程中所得的最终产物，该细胞聚集体包括底层细胞和易脱离细胞。其中，底层细胞即为直接附着在介质上的细胞，而易脱离细胞则是在培养过程中生长出的新细胞，由于光生物细胞逐层生长，所以易脱离细胞并未直接附着在介质上，而是附着在其。
16、他细胞上，因此与直接附着在介质上的底层细胞相比，易脱离细胞较为容易收集。0040本发明实施例提供了一种光生物细胞的培养方法，该方法将光生物细胞接种在介质上，使第二营养液沿细胞表层到底层的方向进行传递。与现有方法相比，本发明实施例所涉及的营养液供给方式能够使生长最旺盛的易脱离细胞得到充足的营养液，同时，使基本处于休眠状态的底层细胞也能获得所必需的营养液。通过对营养液进行合理分配，使光生物细胞的产量得到提高。0041在本发明的另一实施例中，所述接种包括将光生物细胞加入到所述第二营养液中，获得所述第一营养液；利用所述第一营养液对所述介质进行淋洗，使光生物细胞附着在所述介质上；重复上述步骤，直至所述介。
17、质上附着的光生物细胞不再增加。0042现有技术中，光生物细胞的接种多通过涂抹、抽滤等方式，依靠机械力作用使其堆积于介质表面，微观上并未和介质紧密结合，细胞间仍存在空隙。而本发明实施例所采用的接种方法并不需要向光生物细胞及介质施加机械力，而是利用细胞自身特性形状、结构，分泌物，表面带电性等使其自发地、较牢固地附着在介质上如丝状细胞和带有鞭毛的细胞易于嵌入或钩挂在介质的孔隙或多毛结构中；分泌粘性物质的细胞易于通过包裹于细胞外部的粘性物质与介质结合，表面带有电荷的细胞易于通过静电引力吸附于介质表面，这样，含有光生物细胞的营养液在介质表面不断流动时，即对附着在介质上的细胞不断冲淋，使得附着不够稳固的细。
18、胞脱离介质，而附着稳固的细胞为了抵御冲淋时细胞脱离介质的趋势，会与介质结合得更加紧密、牢固。0043本实施例的优选实施方案为向第二营养液中逐次加入光生物细胞，对介质进行多次淋洗，以使光生物细胞附着在所述介质上。具体为首先将光生物细胞均分为若干份，说明书CN104195045A4/6页7向第二营养液中加入其中一份，然后对介质进行循环淋洗，直至第二营养液中加入的光生物细胞近乎接种完全，再向第二营养液中加入一份光生物细胞，重复上述步骤直至淋洗后所述介质上附着的光生物细胞不再增加。采用这种方式接种能够更好地判断光生物细胞在介质上接种完全的临界状态，还可有效地节省光生物细胞的用量。0044在本发明的另一。
19、实施例中，将光生物细胞加入到所述第二营养液中，获得所述第一营养液；将所述介质浸润在所述第一营养液中，使光生物细胞附着在所述介质上；重复上述步骤，直至所述介质上附着的光生物细胞不再增加。0045在该实施例中，使光生物细胞利用细胞自身特性形状、结构，分泌物，表面带电性等以自发的方式附着于介质上，以避免介质上的光生物细胞因营养液的流动而脱落。0046本实施例的优选实施方案为向第二营养液中逐次加入光生物细胞，以对介质进行多次浸润，以使光生物细胞附着在所述介质上。具体为首先将光生物细胞均分为若干份，向第二营养液中加入其中一份，然后将介质浸润在所述加入光生物细胞的第二营养液中，直至第二营养液中加入的光生物。
20、细胞近乎接种完全，再向第二营养液中加入一份光生物细胞，重复上述步骤，直至浸润后所述介质上的光生物细胞不再增加。采用这种方式接种能够更好地判断光生物细胞在介质上接种完全的临界状态。0047需要说明的是，本发明实施例所采用的接种方法并不限于上述情况，本领域技术人员可以根据生产实际需要选择最合适的接种方法；此外，判断所述介质上附着的光生物细胞不再增加的方法可以是观察附着有光生物细胞的介质表面颜色或者是检测第二营养液中的光生物细胞含量，当附着有光生物细胞的介质表面颜色与光生物细胞颜色相同，或第二营养液中的光生物细胞含量不再减少则表明所述介质上附着的光生物细胞不再增加。0048在本发明的又一实施例中，在。
21、所述接种过程中，在所述介质上附着的光生物细胞不再增加后还包括对附着有光生物细胞的所述介质进行给光预培养，得到附着在所述介质上的细胞聚集体；待给光预培养结束后，收集所述细胞聚集体中未直接附着在介质上的易脱离细胞；利用所述第二营养液对所述介质进行淋洗或将所述介质浸润在所述第二营养液中，收集所述介质上残留的所述易脱离细胞，获得稳固附着有光生物细胞的所述介质。0049在该实施例中，经过上述接种过程，在所述介质上附着有光生物细胞，这些光生物细胞利用自身特性较为牢固地附着在介质上。对这些光生物细胞进行17天的给光预培养，使其生长为细胞聚集体，该细胞聚集体包括直接附着在介质上的底层细胞和未直接附着在介质上的。
22、易脱离细胞。这里，优选采用刮取的方式收集所述易脱离细胞。采用刮取的方式不但可收集细胞聚集体上的易脱离细胞，还可以调节介质表面的细胞聚集体的平整度，从而获得均匀良好的细胞生长面。0050进一步地，通常还会利用所述第二营养液对所述介质进行淋洗或将介质浸润在第二营养液中，以收集所述介质上残留的易脱离细胞，利于在后续培养中准确衡量细胞产量。同时，介质上的未脱离细胞为了抵御冲淋时细胞脱离介质的趋势，会利用自身特征与介质结合得更加紧密、牢固，从而可提高光生物细胞对后续培养的稳固性。在上述实施例的另一优选实施例中，将收集到的所述易脱离细胞再次加入到第二营养液中。在该实施例中，可将上述刮取和淋洗方式收集到的细。
23、胞再次加入到第二营养液中配制成第一营养液，以对新的介质进行接种，这样可较好地使易脱离细胞得到循环利用，节约光生物细胞及营养液的用量。说明书CN104195045A5/6页80051在本发明的又一实施例中，光生物细胞附着在所述介质的两侧。将光生物细胞单侧附着培养时，第二营养液在由细胞表层传递至细胞底层后，多余的第二营养液可能会渗透至介质另一侧，特别对于底层细胞而言，这样势必会造成第二营养液的流失。所以，在本发明的优选实施例中，将光生物细胞接种在介质两侧，即使第二营养液发生渗透，也会被另一侧的光生物细胞吸收，使两侧的底层细胞间含蓄更多的第二营养液，从而使底层细胞的状态更好、与介质结合的更为紧密牢固。
24、。0052进一步地，分别向所述介质的两侧提供所述第二营养液，所述第二营养液从所述介质两侧分别沿细胞表层到底层的方向传递。在将光生物细胞双侧附着培养的过程中，需要同时向介质的两侧提供营养液，使营养液从介质两侧沿细胞表层向底层进行传递，以使介质两侧的光生物细胞都获得充足的营养液。这样能够使介质两侧的易脱离细胞充分生长，并使介质两侧的底层细胞都可以获得满足需要的营养液。将光生物细胞双侧附着培养能够大幅度提高光生物细胞和/或其代谢物的产量，可使底层细胞获得更多的营养液，以使其能够与介质更好地结合，更有利于后续的培养过程。0053在本发明的又一实施例中，所述介质为柔性材料，柔性材料具有良好的柔韧性，能够。
25、适应任意培养器，以扩大本实施例所提供的培养方法的适用范围。0054在本发明的又一实施例中，所述介质优选为亲水材料。选用亲水材料可使光生物细胞更快、更好地对介质进行附着，从而提高效率，减少后续培养中可能出现的损失。0055进一步地，所述介质优选柔性亲水材料。柔性亲水材料兼具柔性和亲水的特点，既能够适应各种不同的培养器，扩大本发明实施例的适用范围，又能够使光生物细胞更快、更好地与介质相结合，从而提高效率，减少后续培养中可能出现的损失。0056更进一步地，所述介质为表面具有粗糙度和/或绒毛和/或孔洞和/或通孔的所述柔性亲水材料。由于“附着培养”需通过拓展附着面积来提高光生物细胞和/或其代谢物产量。同。
26、时，为了让光生物细胞能够利用形状、结构等自身特性附着于介质上，需为其提供相对粗糙的表面结构，而孔洞或通孔可以显著地扩大介质的可附着面积，高粗糙度或具有绒毛的表面则更有利于光生物细胞对介质进行附着，这样就能够使本发明实施例的效率以及单位时间的产量得到进一步提高。需要说明的是，本发明实施例中的介质可以为棉布、棉绒布，但并不限于上述材质，本领域技术人员可以根据上述内容以及实际情况自行选择。0057在本发明实施例中，光生物细胞选自球状藻、丝状藻、弧形藻、三角形藻、多角形藻、栅藻、小球藻、绿球藻、红球藻、丝状绿藻和丝状蓝藻等光生物细胞中的一种或多种。0058本发明能够适用于很多在传统培养方法中无法接种的。
27、光生物细胞，如球状藻。这是由于该细胞表面较为光滑，在接种过程中并不能与介质形成良好的附着力。而采用本发明实施例所提供的接种方法，利用球状藻的分泌物能够使该球状藻自发地附着在介质上，然后在对球状藻细胞进行给光预培养后，通过刮取和淋洗等方式收集在介质上附着不够稳固的球状藻细胞，而原本在介质上附着较为稳固的球状藻细胞为了抵御刮取和冲淋时脱离介质的趋势，会与介质结合的更加紧密、稳固。可以理解的是，本发明实施例所涉及的光生物细胞的范围较为广泛，本领域技术人员还可根据实际需要将该方法应用在其它类型的藻细胞中。需要说明的是，光生物细胞的培养中，最终需求的产物除光生物细胞本身以外，还可以包括其代谢物，如多糖、。
28、抗氧化剂、油脂、不饱和脂肪酸等物质。0059在本发明的又一实施例中，在所述得到光生物细胞的细胞聚集体之后还包括收说明书CN104195045A6/6页9集所述细胞聚集体中未直接附着在介质上的易脱离细胞；重复上述给光培养和收集过程。由于收集过程多采用刮取方式，介质上仍然会残留一定量的底层细胞，该介质可以等同于接种完毕的介质，这样就可以再次对其进行给光培养，以得到附着在介质上的细胞聚集体，从而形成循环过程。该循环过程能够更好地利用介质上残留的底层细胞，并且在减少工序的同时获得更高的产量。0060为了更好地说明本发明提供的光生物细胞的培养方法，下面以具体实施例进行详细说明。0061实施例10062以。
29、球藻为待养殖光生物细胞，以棉绒布为介质，进行单面附着培养。0063将棉绒布包裹在直径为10CM的球形支架表面形成球形体，将其浸没在含有约3G/L球藻细胞的BG11营养液中，将该营养液中通入二氧化碳与空气的混合气体，使该营养液PH值维持在7左右，使球形体在营养液中无规则运动，待球形体表面布满球藻后将球形体由该营养液中取出，放入BG11营养液中漂洗2次；再将球形体置于营养液中，球形体一半浸入营养液中，另一半暴露于营养液外，将含有体积分数为2的二氧化碳的混合气体通入营养液中，维持营养液PH在7左右，球形体在混合气体的作用下无规则转动，使附着于其上的球藻细胞间歇浸入、离开营养液，于北方春季室外环境中连。
30、续培养10日；收集球形体表面的球藻细胞后，继续培养10日；重复培养收集步骤三次，平均产量约5克每平方米介质每日。0064实施例20065以栅藻为待养殖光生物细胞，以棉布为介质，进行双面附着培养。0066使含有约1G/L栅藻细胞的BG11营养液沿边长为1米的正方形棉布的一条边从两侧缓缓流下，经棉布的两个侧面流至营养液收集池，流回至收集池的含有栅藻细胞的该营养液经由潜水泵输送至棉布使其沿棉布两个侧面缓缓流下，形成循环，待该营养液中的栅藻细胞基本消耗完毕时，再向该营养液中加入栅藻细胞，至该营养液中栅藻细胞的浓度上升至约1G/L，重复上述过程至第5次时，该营养液中的栅藻细胞含量不再降低，此时栅藻细胞均。
31、匀附着于棉布的两个侧面；将收集池中含有栅藻细胞的营养液排净，加入不含栅藻细胞的营养液，经由潜水泵使营养液按照上述过程流经接种完毕的棉布，冲洗30MIN后将收集池中含有少量细胞的营养液排净，并加入营养液，经由潜水泵使营养液按照上述过程流经上述淋洗过的棉布，将含有体积分数为2的二氧化碳的混合气体通入营养液中，维持营养液PH在7左右，于北方秋季室外环境中连续培养7日；收集棉布表面的栅藻细胞后，继续培养7日；重复上述培养收集过程三次，平均产量约10克每平方米介质每日。0067显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围。说明书CN104195045A。