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1、10申请公布号CN104195264A43申请公布日20141210CN104195264A21申请号201410398837622申请日20140813C12Q1/70200601C12Q1/68200601C12R1/9320060171申请人江苏硕世生物科技有限公司地址225300江苏省泰州市开发区寺巷富野村帅于村A栋（G19）第三层厂房与第三、第四层办研区72发明人李秀林苏波王河清杨静刘中华王国强张旭74专利代理机构北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司11139代理人孙皓晨马鑫54发明名称一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒及其应用57摘要本发明公开了一种快速检测柯萨。
2、奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括RTPCR反应液、酶混合液、柯萨奇病毒A6/A10反应液、阳性对照和阴性对照。本发明克服了现有技术中柯萨奇病毒A6型/A10型检测试剂盒大多存在特异性差、灵敏性较低等缺陷，提出了一种具有高通量、操作简便、重复性强、检测结果快速客观等优点的柯萨奇病毒A6型/A10型核酸检测试剂盒，在柯萨奇病毒A6型以及A10型的临床诊断、疾病监测等方面具有极大的应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表2页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表2页附图4页10申请公布号CN104195264。
3、ACN104195264A1/1页21一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒，包括以下各组分RTPCR反应液、酶混合液、柯萨奇病毒A6/A10反应液、阳性对照和阴性对照，其中所述的柯萨奇病毒A6/A10反应液包括以下2组组分组分1由一对检测柯萨奇病毒A6型的引物和一条检测柯萨奇病毒A6型的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQIDNO1和SEQIDNO2所示；探针的碱基序列为SEQIDNO3所示，所述探针的5端标记有荧光报告基团，3端标记有荧光淬灭基团；组分2由一对检测柯萨奇病毒A10型的引物和一条检测柯萨奇病毒A10型的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQI。
4、DNO4和SEQIDNO5所示；所述探针的碱基序列为SEQIDNO6所示，该探针的5端标记有荧光报告基团，3端标记有荧光淬灭基团。2根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，组分1和组分2中所述的荧光报告基团分别选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TEXASRED或LCRED640中的任一种，且组分1和组分2中的荧光报告基团不同；组分1和组分2中所述的荧光淬灭基团分别选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCY1或TAMRA中的任一种。3根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的检测柯萨奇病毒A6型的引物及探针的摩尔配比为SEQIDNO1SEQIDNO。
5、2SEQIDNO3为332。4根据权利要求1或3所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的检测柯萨奇病毒A10型的引物及探针的摩尔配比为SEQIDNO4SEQIDNO5SEQIDNO6为111。5根据权利要求1、3或4所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，组分1和组分2中的探针摩尔配比为SEQIDNO3SEQIDNO611。6根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的RTPCR反应液还包括10缓冲液、25MMMGCL2和10MMDNTPS。7根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的酶混合液包括TAQ酶和逆转录酶，其中，TAQ酶为热启动TAQ酶，逆转录酶为MMLV逆转录酶。8。
6、根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为灭活的柯萨奇病毒A6型以及A10型的病毒培养液；所述的阴性对照为去RNA酶水。9权利要求18任一项所述的核酸检测试剂盒在制备检测柯萨奇病毒A6型或柯萨奇病毒A10型的试剂中的应用。10权利要求18任一项所述的核酸检测试剂盒在制备同时检测柯萨奇病毒A6型及柯萨奇病毒A10型的试剂中的应用。权利要求书CN104195264A1/6页3一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒及其应用技术领域0001本发明涉及一种核酸检测试剂盒，具体涉及一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒，属于生物技术领域。背景技术000。
7、2柯萨奇病毒是DALLDORF和SICKLES在1948年首先于纽约柯萨奇分离出此病毒而得名。柯萨奇病毒属于肠道病毒属，单股RNA病毒，呈球形，无包膜。根据病毒致新生小白鼠病变的特点，可将柯萨奇病毒分为A、B两群共30个型。柯萨奇病毒可以引起脑膜炎和轻度麻痹、胸膜痛、肋间痛、呼吸性疾病、结膜炎以及手足口综合征。手足口病是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，是我国法定报告管理的丙类传染病。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状。少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。0003引起手足口病的。
8、病原体主要是肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型，但随着流行趋势的变化，有数据表明在2012年9月到2013年8月广东省爆发的手足口病中，柯萨奇病毒A6型已经替代了肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型成为了最常见的病原体。近年来我国的广东省、北京市、上海市、台湾省、福建省等地也有规模性爆发柯萨奇病毒A6型/A10型引起的手足口病。所以该疾病的早期诊断十分重要。0004目前国内的核酸诊断中应用最为广泛的是以荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术。检测探针为包括5端报告基团和3端淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被TA。
9、Q酶53外切核酸酶活性切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。在每次PCR循环中，都有新的报告基团被剪切，因此荧光信号强度的增加与扩增产物的数量成正比。对于荧光PCR检测病毒来说，引物的设计至关重要，其直接影响检测的特异性。如果引物的特异性不够，则可能导致假阳性的出现。0005双重荧光定量PCR技术则是在同一反应体系中加入两条不同荧光标记的探针。例如，针对靶基因1的探针标记FAM，针对靶基因2的探针标记VIC。PCR反应过程中，若待检样本包含靶基因1，则标记FAM的探针产生荧光信号；若待检样本包含靶基因2，则标记VIC的探针产生荧光信号。这样，同一管反应则可确定两个靶基因如图1所示。000。
10、6现有的柯萨奇病毒A6型/A10型检测试剂盒大多存在特异性差、灵敏性较低等缺陷，有待改进。本发明针对柯萨奇病毒A6型以及A10型病毒的靶序列分别设计了一对特异性引物序列以及TAQMAN探针，在很大程度上保证了用于检测病毒时的结果的特异性。发明内容0007本发明所要解决的技术问题是克服现有的柯萨奇病毒A6型/A10型检测试剂盒特异性差、灵敏性较低等缺陷，提供一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂说明书CN104195264A2/6页4盒，该试剂盒具有高通量、操作简便、重复性强、检测结果快速客观等优点，对柯萨奇病毒A6型/A10型的检测具有良好的应用前景。0008为达到上述目的，本发。
11、明采用了以下技术方案0009本发明的一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒，包括以下各组分RTPCR反应液、酶混合液、柯萨奇病毒A6/A10反应液、阳性对照和阴性对照，其中，所述的柯萨奇病毒A6型/A10型反应液包括以下2组组分0010组分1由一对检测柯萨奇病毒A6型的引物和一条检测柯萨奇病毒A6型的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQIDNO1和SEQIDNO2所示；探针的碱基序列为SEQIDNO3所示，该探针的5端标记有荧光报告基团，3端标记有荧光淬灭基团；0011组分2由一对检测柯萨奇病毒A10型的引物和一条检测柯萨奇病毒A10型的探针组成；其中，两条引物的碱基。
12、序列分别为SEQIDNO4和SEQIDNO5所示；探针的碱基序列为SEQIDNO6所示，该探针的5端标记有荧光报告基团，3端标记有荧光淬灭基团。0012在本发明中，优选的，组分1和组分2中所述的荧光报告基团分别选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TEXASRED或LCRED640等荧光报告基团中的任一种，且组分1和组分2中的荧光报告基团不同；组分1和组分2中所述的荧光淬灭基团分别选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCY1或TAMRA等荧光淬灭基团中的任一种。0013本发明对上述引物和探针的摩尔配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，它们之间不同的摩尔配比比例对于检测。
13、结果的特异性和灵敏性具有显著的差异，本发明通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果0014在本发明中，优选的，检测柯萨奇病毒A6型的引物及探针的配比为SEQIDNO1SEQIDNO2SEQIDNO3为332；0015在本发明中，优选的，检测柯萨奇病毒A10型的引物及探针的配比为SEQIDNO4SEQIDNO5SEQIDNO6为111。0016在本发明中，优选的，组分1和组分2中的探针摩尔比配比为SEQIDNO3SEQIDNO611。0017柯萨奇病毒A6型/A10型引物探针核苷酸序列见表10018表1柯萨奇病毒A6型/A10型引物探针0019名称序列53A6型F。
14、PTAAGCCGGATAGCAGGAAATCSEQIDNO1A6型RPTGTAGGGTAACCATCATAAAACSEQIDNO2A6型PX1CAGGTGTCTGTCCCGTTCATGTCGCCAY1SEQIDNO3A10型FPTCAATCTTTGTTAAACTCACSEQIDNO4说明书CN104195264A3/6页5A10型RPTTAGGGCATAATCCGTATGCTSEQIDNO5A10型PX2AGTCCCTTTCATGTCCCCGGCCAGTY2SEQIDNO60020注X1和X2为荧光报告基团，Y1和Y2为荧光淬灭基团。0021在本发明中，优选的，所述的酶混合液包括TAQ酶和逆转。
15、录酶，逆转录酶为MMLV逆转录酶，TAQ酶为热启动TAQ酶；0022在本发明中，优选的，所述的RTPCR反应液包括10缓冲液、25MMMGCL2和10MMDNTPS；0023在本发明中，优选的，所述的阳性对照为灭活的柯萨奇病毒A6型以及A10型的病毒培养液；所述的阴性对照为去RNA酶水。0024进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的核酸检测试剂盒在制备检测柯萨奇病毒A6型或柯萨奇病毒A10型的试剂中的应用。0025以上任一项所述的核酸检测试剂盒在制备同时检测柯萨奇病毒A6型及柯萨奇病毒A10型的试剂中的应用。0026本发明的试剂盒采用双重荧光定量PCR技术，分别设计针对柯萨奇病毒A6型和A1。
16、0型的特异性引物和探针，实现了在同一反应体系中同时检测柯萨奇病毒A6型和A10型的目的。引物和探针的设计采用PRIMER50专用软件设计，将设计的引物和探针在NCBI的GENEBANK进行比对，检测引物和探针的特异性。引物和探针在专业合成公司合成，采用紫外分光光度计测定光密度值A260NM/A280NM在1820之间为合格。0027本发明提供的一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒具有如下技术效果00281本发明试剂盒操作简便且能有效防止污染，PCR荧光检测时间从标本处理开始仅为23小时，而且在同一反应体系中实现同时检测柯萨奇病毒A6型、A10型。PCR荧光检测是全封闭操作，加。
17、入样本抽提产物之后可以不再打开管盖，减少了污染产生的机会。00292能够同时检测出柯萨奇病毒A6型和A10型，解决了现有产品只能在一管中检测一种病毒的问题。本发明还具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观等优点，在临床诊断、疾病预防监测领域具有极大的应用前景。附图说明0030图1是双重荧光定量PCR技术原理图；0031图2是本发明试剂盒检测样本3的曲线图；0032图3是本发明试剂盒检测柯萨奇病毒A6型的灵敏度试验结果图；0033图4是本发明试剂盒检测柯萨奇病毒A10型的灵敏度试验结果图；0034图5是本发明试剂盒检测柯萨奇病毒A6型的特异性试验结果图；0035图6是本发明试剂盒检测。
18、柯萨奇病毒A10型的特异性试验结果图。具体实施方式0036下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员说明书CN104195264A4/6页6应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。0037实施例与试验例中所用试剂均为市售。0038实施例1一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒的制备0039所述试剂盒包括RTPCR反应液、酶混合液、柯萨奇病毒A6/A10反应液、阳性对照和阴性对照；00。
19、40其中，RTPCR反应液包括10缓冲液、25MMMGCL2和10MMDNTPS；0041其中，柯萨奇病毒A6型/A10型反应液包括以下组分0042组分1由一对检测柯萨奇病毒A6型的引物和一条检测柯萨奇病毒A6型的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQIDNO1和SEQIDNO2所示；探针的碱基序列为SEQIDNO3所示，该探针的5端标记有荧光报告基团FAM，3端标记有荧光淬灭基团BHQ1；检测柯萨奇病毒A6型的引物SEQIDNO1为600NM，SEQIDNO2为600NM，探针SEQIDNO3为400NM；0043组分2由一对检测柯萨奇病毒A10型的引物和一条检测柯萨奇病毒A10型的。
20、探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQIDNO4和SEQIDNO5所示；探针的碱基序列为SEQIDNO6所示，该探针的5端标记有荧光报告基团VIC，3端标记有荧光淬灭基团BHQ2；检测柯萨奇病毒A10型的引物SEQIDNO4为400NM，SEQIDNO5为400NM，探针SEQIDNO6为400NM。用去RNA酶水配制。0044其中，酶混合液包括TAQ酶和逆转录酶，其中，TAQ酶为热启动TAQ酶，逆转录酶为MMLV逆转录酶。0045其中，阳性对照为灭活的病毒培养液；阴性对照为去RNA酶水。0046实施例2本发明试剂盒在检测柯萨奇病毒A6型/A10型中的应用00471、提取样本RNA00。
21、4811取200UL临床样品，加入400ULBINDINGBUFFERSUPPLEMENTEDWITHPOLYA，充分混匀后转入高纯化过滤管，8000RMP离心15S，弃去收集管中的废液。004912加入500ULINHIBITORREMOVALBUFFER至过滤管，8000RMP离心1MIN，弃去收集管中的废液。005013加入450ULWASHINGBUFFER至过滤管，8000RMP离心1MIN，弃去收集管中的废液。005114重复步骤13，然后高速离心10S，此步骤务必将废液去除干净005215加入50ULELUTIONBUFFER至过滤管中，室温静置2MIN，8000RMP离心1MI。
22、N，离心所得溶液即为纯化的RNA。00532、在每个PCR反应管放入组分如表2中所示的柯萨奇病毒A6型/A10型检测试剂实施例1制备和RNA样本0054表20055反应液组分加量UL/1人份RTPCR反应液75说明书CN104195264A5/6页7酶混合液5柯萨奇病毒A6/A10反应液4去RNA酶水阴性参考品35RNA样本5总体积2500563、在荧光定量PCR扩增仪中扩增，按照下列程序进行PCR扩增005700584、扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染柯萨奇病毒A6型/A10型。0059结果判定在FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT350，判断为柯萨奇病毒A6型阳性；无典型“S”型扩。
23、增或CT350，判断为柯萨奇病毒A6型阴性。在VIC通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT350，判断为柯萨奇病毒A10型阳性；无典型“S”型扩增或CT350，判断为柯萨奇病毒A10型阴性。00605个临床样本具体检测结果见表4。其中样本3的扩增曲线如图2所示。0061表400620063试验例1本发明试剂盒的灵敏性试验0064阳性参考品为灭活的柯萨奇病毒A6型以及A10型病毒培养液。分别将柯萨奇病毒A6型和A10型病毒培养液的核酸提取液2108COPIES/ML进行10倍的梯度稀释至2107COPIES/ML、2106COPIES/ML、2105COPIES/ML、2104COPIES/ML、2。
24、103COPIES/ML、2102COPIES/ML六个浓度进行灵敏度试验。0065阴性参考品为去RNA酶水，用电子天平称取1G的DEPC，补纯化水至1000ML混匀，说明书CN104195264A6/6页8然后在灭菌锅中121，20MIN高温灭菌，做好标记，室温保存。0066采用本发明试剂盒实施例1制备按照实施例2相同的方法进行检测。0067检测结果表明本发明试剂盒具有良好的灵敏性，并且CT值随浓度减少呈梯度改变，结果见图3、图4。0068试验结果表明，本发明试剂盒对于柯萨奇病毒A6型/A10型的诊断具有高度的灵敏性。0069试验例2本发明试剂盒的特异性试验0070用本发明柯萨奇病毒A6型/。
25、A10型检测试剂盒实施例1制备检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、肠道腺病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒和风疹病毒等。0071检测结果表明FAM通道仅对柯萨奇病毒A6型进行扩增，VIC通道仅对柯萨奇病毒A10型进行扩增。0072试验结果表明本发明检测试剂盒能特异性扩增柯萨奇病毒A6型/A10型，而不与其它病毒核酸发生交叉反应，结果见图5、图6。说明书CN104195264A1/2页900010002序列表CN104195264A2/2页10序列表CN104195264A101/4页11图1图2说明书附图CN104195264A112/4页12图3说明书附图CN104195264A123/4页13图4图5说明书附图CN104195264A134/4页14图6说明书附图CN104195264A14。