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1、10申请公布号CN104195190A43申请公布日20141210CN104195190A21申请号201410448698322申请日20140904C12P13/00200601C12R1/1920060171申请人山东大学地址250061山东省济南市历城区山大南路27号72发明人王倩刘文静祁庆生74专利代理机构济南圣达知识产权代理有限公司37221代理人李健康54发明名称一种利用重组大肠杆菌厌氧生产5氨基乙酰丙酸的方法57摘要本发明公开了一种利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5氨基乙酰丙酸的方法，是将重组大肠杆菌接种于AM1酵母粉无机盐培养基中，先在好氧条件下培养815H生长菌体，然后转厌氧。
2、发酵，发酵时间为7210H。本发明方法无需添加昂贵的琥珀酸前体即可通过厌氧发酵生产5氨基乙酰丙酸，且生产的5ALA不易被降解，简化了工艺，降低了成本。实验证实在厌氧发酵条件下本发明5ALA的产量最高达165G/L，5ALA/葡萄糖转化率为032G/G，提示具有很好的工业开发和应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书9页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页附图2页10申请公布号CN104195190ACN104195190A1/1页21一种利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于利用重组大肠杆菌厌氧生产5氨基乙酰丙酸的发酵条件为。
3、以体积百分比计为25的接种量将重组大肠杆菌接种于AM1酵母粉无机盐培养基中，先在好氧条件下培养815H生长菌体，然后转厌氧发酵，发酵时间为7210H；其中，温度均控制为371，PH均控制为6505，所述AM1酵母粉无机盐培养基配方是NH42HPO4，26306G/L；NH4H2PO4，08709G/L；KCL，01491G/L；3吗啉丙磺酸，209270G/L；酵母粉，2G/L；用NA2CO3调PH至70，余量为水；使用时添加015MMMGSO47H2O及体积比为1的微量元素溶液；其中微量元素1000母液配方是FECL36H2O，24003G/L；COCL26H2O，02998G/L；ZNCL。
4、2，02999G/L；NA2MOO42H2O，03000G/L；H3BO4，00748G/L，MNCL24H2O，04948G/L；CUCL22H2O，01500G/L；用120MMHCL溶解；其中，所述重组大肠杆菌是任何能表达5氨基乙酰丙酸合成酶和琥珀酰辅酶A合成酶并在厌氧条件下产生琥珀酸的菌株。2根据权利要求1所述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于所述重组大肠杆菌在好氧条件下培养12H，转速为25010RPM。3根据权利要求1或2所述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于所述重组大肠杆菌由如下方法制得构建含HEMA基因的表达载体PTRC99A。
5、HEMA，在此基础上再构建含SUCCD基因的表达载体PTRC99AHEMASUCCD，将所构建的重组载体PTRC99AHEMASUCCD共转化重组大肠杆菌中，获得能同时过量表达HEMA和SUCCD的重组大肠杆菌；其中，所述HEMA是来源于类球红杆菌的HEMA基因，所述SUCCD基因来源于大肠杆菌。4根据权利要求3所述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于所述重组大肠杆菌是大肠杆菌YL106HEMASUCCD，大肠杆菌W3110HEMASUCCD，或大肠杆菌W3110GABHEMASUCCD。5根据权利要求4所述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于所。
6、述重组大肠杆菌是大肠杆菌YL106HEMASUCCD，其基因型为MG1655PTSGPOXBPTAICLRSDHAARCALDHAADHEPCKAGLFZM/PTRC99AHEMASUCCD，由如下方法制得构建含HEMA基因的表达载体PTRC99AHEMA，在此基础上再构建含SUCCD基因的表达载体PTRC99AHEMASUCCD，将所构建的重组载体PTRC99AHEMASUCCD共转化重组大肠杆菌YL106中，获得能同时过量表达HEMA和SUCCD的重组大肠杆菌，即为大肠杆菌YL106HEMASUCCD；其中，所述HEMA是来源于类球红杆菌的HEMA基因，所述SUCCD基因来源于大肠杆菌；所。
7、述重组大肠杆菌YL106已于2013年4月17日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCCNOM2013149，其基因型为MG1655PTSGPOXBPTAICLRSDHAARCALDHAADHEPCKAGLFZM。权利要求书CN104195190A1/9页3一种利用重组大肠杆菌厌氧生产5氨基乙酰丙酸的方法技术领域0001本发明涉及微生物技术及发酵工程领域，具体来说，涉及一种利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5氨基乙酰丙酸的方法。背景技术00025氨基乙酰丙酸5AMINOLEVULINICACID，简称5ALA是一种广泛存在于细菌、真菌、动物和植物体内的非蛋白氨基酸，其分子式为C5O3N。
8、H9，分子量为13113，熔点为118。在水溶液中不稳定，易发生缩合反应。5ALA是吡啶的生物合成中的重要中间产物。因此常作为维生素B12、血红素和叶绿素的前体。医学上，它可以作为光动力学药物治疗各种癌症。农业上，5ALA由于对作物、动物和人无毒性，可用作植物生长调节剂、除草剂和杀虫剂。此外在工业上，5ALA是一种重要的有机合成中间体。0003自然界中许多生物可以合成5ALA，如光合细菌是一类能够大量合成5ALA并分泌到胞外的微生物。自然界生物体内合成5ALA的途径中，C4途径是利用琥珀酰COA和甘氨酸在5氨基乙酰丙酸合成酶5ALAS催化下一步生成5ALA；而C5途径则是谷氨酸经过谷氨酰TRN。
9、A合成酶GLURS,由GLTX基因编码、谷氨酰TRNA还原酶GLUTR，由HEMA基因编码和谷氨酸1半醛2，1氨基转移酶GSAAM，由HEML基因编码三步催化生成5ALA。在细胞内，5ALA可以进一步代谢形成亚铁血红素HEME。0004目前与生物合成相对应的5ALA的生物合成方式有利用C4途径生产5ALA和通过C5途径直接从葡萄糖合成5ALA两种。利用C4途径生产5ALA，即通过表达5ALA合成酶生物转化琥珀酸和甘氨酸生产5ALA。在这种研究中通过优化5氨基乙酰丙酸合成酶HEMA基因的表达和发酵条件，可以提高5ALA的产量。通过C5途径直接从葡萄糖合成5ALA，即通过C5途径合成5ALA则需要。
10、复杂的代谢工程优化，必须构建基因工程菌株。一旦基因工程菌株构建完成，其生物合成过程相对简单和廉价。检索发现利用光合细菌合成5ALA的研究也很多，但是光合细菌发酵中需采用光照，从而增加了成本，另外光合细菌生长缓慢，发酵时间长，不适合大规模工业发酵生产。并且，在好氧条件下，5ALA在发酵后期容易发生降解，进一步向下游代谢被转换成血红素有氧呼吸电子传递的组成部分，产量明显下降。同时，血红素合成途径的部分中间产物对细胞具有毒害作用，易导致菌体生长缓慢。0005厌氧条件下5ALA不易被转化降解，有利于5ALA的生产和使产量提高；同时，厌氧发酵减少了发酵工业中最大的能量消耗成本通气搅拌成本，培养过程简单、。
11、生产规模容易扩大，具有明显的优势。但检索发现有关利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5氨基乙酰丙酸的方法还未见报道。发明内容0006针对现有方法与技术的不足，本发明的目的是提供一种利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5氨基乙酰丙酸5ALA的方法。说明书CN104195190A2/9页40007本发明的技术方案是基于5ALA的C4生物合成途径，利用重组大肠杆菌在AM1酵母粉无机盐培养基条件下以廉价的葡萄糖和甘氨酸为底物厌氧发酵生产5氨基乙酰丙酸5ALA。其中，所述重组大肠杆菌是任何能表达5氨基乙酰丙酸合成酶ALAS和琥珀酰辅酶A合成酶SUCCD并在厌氧条件下产生琥珀酸的菌株。0008本发明所述利用重组大肠杆菌厌。
12、氧发酵生产5氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于利用重组大肠杆菌厌氧生产5氨基乙酰丙酸的发酵条件为以体积百分比计为25的接种量将重组大肠杆菌接种于AM1酵母粉无机盐培养基中，先在好氧条件下培养815H生长菌体，然后转厌氧发酵，发酵时间为7210H；其中，温度均控制为371，PH均控制为6505，所述AM1酵母粉无机盐培养基配方是NH42HPO4，26306G/L；NH4H2PO4，08709G/L；KCL，01491G/L；3吗啉丙磺酸MOPS，209270G/L；酵母粉，2G/L；用NA2CO3调PH至70，余量为水；使用时添加015MMMGSO47H2O及体积比为1的微量元素溶液；其中微量元素1。
13、000母液配方是FECL36H2O，24003G/L；COCL26H2O，02998G/L；ZNCL2，02999G/L；NA2MOO42H2O，03000G/L；H3BO4，00748G/L，MNCL24H2O，04948G/L；CUCL22H2O，01500G/L；用120MMHCL溶解；其中，所述重组大肠杆菌是任何能表达5氨基乙酰丙酸合成酶ALAS和琥珀酰辅酶A合成酶SUCCD并在厌氧条件下产生琥珀酸的菌株。0009上述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5氨基乙酰丙酸的方法中所述重组大肠杆菌在好氧条件下优选培养12H，转速为25010RPM。0010进一步的，上述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5。
14、氨基乙酰丙酸的方法具体步骤是00111用接种环从保藏的大肠杆菌重组菌株的甘油管中蘸取菌液后，在含有100G/ML氨苄青霉素的LB平板上划线，并将划线的LB平板置于37培养121H。00122将LB平板上的单克隆接种于含50MLLB培养基的300ML摇瓶中，并放置在转速为250RPM，温度为37的摇床中，培养121H，得到种子培养液。00133取2ML种子液接种于含100MLAM1酵母粉无机盐发酵培养基的300ML摇瓶中，并放置在转速为250RPM，温度为37的摇床中进行发酵，并用IPTG诱导。K2CO3调PH至65。发酵初始添加2G/L甘氨酸。00144将培养12H后的发酵液转入含130MLA。
15、M1酵母粉无机盐发酵培养基的厌氧瓶中密封厌氧发酵，条件37，210RPM，PH65。分别于12H，22H，28H各补加2G/L甘氨酸，72H结束发酵。每6H取一次样检测5ALA产量。0015上述5ALA检测方法是12000RPM离心发酵液2MIN，将上清转入新的离心管中。按一定比例进行稀释。取稀释液400L，分别加入200L的乙酸钠缓冲液和100L的乙酰丙酮，煮沸反应15MIN。冷却至室温，加入MODIEDEHRLICHSREAGENT试剂反应10MIN，然后利用1CM的比色皿在波长554NM下利用分光光度计检测。0016上述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5氨基乙酰丙酸的方法中所述重组大肠杆菌由。
16、如下方法制得构建含HEMA基因的表达载体PTRC99AHEMA，在此基础上再构建含SUCCD基因的表达载体PTRC99AHEMASUCCD，将所构建的重组载体PTRC99AHEMASUCCD共转化重组大肠杆菌中，获得能同时过量表达HEMA和SUCCD的重组大肠杆菌；其中，所述HEMA是来源于类球红杆菌的HEMA基因，所述SUCCD基因来源于大肠杆菌。说明书CN104195190A3/9页50017上述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5氨基乙酰丙酸的方法中所述重组大肠杆菌优选是大肠杆菌YL106HEMASUCCD，大肠杆菌W3110HEMASUCCD，或大肠杆菌W3110GABHEMASUCCD。0。
17、018其中上述重组大肠杆菌进一步优选是大肠杆菌YL106HEMASUCCD，其基因型为MG1655PTSGPOXBPTAICLRSDHAARCAADHELDHAPCKALDHATRCRBSGLF/PTRC99AHEMASUCCD，由如下方法制得构建含HEMA基因的表达载体PTRC99AHEMA，在此基础上再构建含SUCCD基因的表达载体PTRC99AHEMASUCCD，将所构建的重组载体PTRC99AHEMASUCCD共转化重组大肠杆菌YL106中，获得能同时过量表达HEMA和SUCCD的重组大肠杆菌，即为大肠杆菌YL106HEMASUCCD；其中，所述HEMA是来源于类球红杆菌的HEMA基因。
18、，所述SUCCD基因来源于大肠杆菌；所述重组大肠杆菌YL106已于2013年4月17日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCCNOM2013149，其基因型为MG1655PTSGPOXBPTAICLRSDHAARCALDHAADHEPCKAGLFZM。0019本发明针对5ALA好氧生产时不稳定，极易被降解的限制，以及好氧发酵成本高的缺点，提供了一种厌氧发酵生产5氨基乙酰丙酸的方法。本发明方法是通过琥珀酰COA合酶及5ALA合成酶HEMA的作用，同时添加甘氨酸来生产5ALA。该方法无需添加昂贵的琥珀酸前体，生产的5ALA不易被降解；同时，采用廉价无机盐培养基，简化了发酵工艺，降低了。
19、生产成本。厌氧发酵条件下5ALA的产量最高达165G/L，5ALA/葡萄糖转化率为032G/G。转化率具有明显优势，提示具有很好的工业开发和应用前景。附图说明0020图1重组大肠杆菌发酵葡萄糖生产5ALA的途径。0021图2构建质粒表达载体图谱。0022图3重组大肠杆菌YL106HEMASUCCD厌氧发酵条件下胞外5ALA浓度，葡萄糖，菌体密度OD600，琥珀酸与发酵时间的关系曲线。具体实施方式0023一般性说明实施例所涉及的酶均购自TAKARA公司，质粒提取试剂盒购自天根公司，琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒购自申能博彩公司，操作完全按照相应说明书进行。质粒构建中基因测序由华大基因公司完成。5。
20、ALA标准样品及其他试剂均购自SIGMA公司。DH5感受态细胞购自全式金生物技术有限公司。0024LB液体培养基配方酵母粉5G/L，蛋白胨10G/L，NACL10G/L，PH70。0025LB氨苄培养基配方酵母粉5G/L，蛋白胨10G/L，NACL10G/L，氨苄青霉素100G/ML00265ALA检测方法是12000RPM离心发酵液1ML，将上清转入新的离心管中。按一定比例进行稀释。取稀释液400L，分别加入200L的乙酸钠缓冲液和100L的乙酰丙酮，煮沸反应15MIN。冷却至室温，加入MODIEDEHRLICHSREAGENT700L，试剂反应10MIN，然后利用1CM的比色皿在波长554。
21、NM下利用分光光度计检测。0027乙酸盐缓冲液组成为1升双蒸水57ML冰乙酸，82G无水醋酸钠。0028改良EHRLICHS试剂在50ML的量筒中加入30ML的冰乙酸，1G对二甲氨基苯说明书CN104195190A4/9页6甲酸，8ML70高氯酸，然后定容至50ML。0029AM1酵母粉无机盐培养基配方NH42HPO4，26306G/L；NH4H2PO4，08709G/L；KCL，01491G/L；3吗啉丙磺酸MOPS，209270G/L；酵母粉，2G/L；用NA2CO3调PH至70，余量为水；121灭菌20MIN。使用时添加015MMMGSO47H2O及1V/V微量元素溶液。0030微量元素。
22、溶液1000母液配方FECL36H2O，24003G/L；COCL26H2O，02998G/L；ZNCL2，02999G/L；NA2MOO42H2O，03000G/L；H3BO4，00748G/L，MNCL24H2O，04948G/L；CUCL22H2O，01500G/L；用120MMHCL溶解。121灭菌20MIN。003150的葡萄糖溶液W/V，单独灭菌。0032重组大肠杆菌ESCHERICHIACOLIYL106，属于革兰氏阴性菌。该菌呈杆状，大小为0406微米13微米，有普通菌毛和性菌毛，无芽孢，生长温度范围在1546之间，最适生长温度为37。该菌已由申请人于2013年4月17日保藏在。
23、“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCCNOM2013149。该菌的相关专利申请号为2013102039459，申请日为20130528。该菌株构建的出发菌株是大肠杆菌K12系列MG1655，其基因组序列号为NC_0009132。0033重组大肠杆菌W3110来源于美国典型菌种保藏中心，保藏号ATCC27325。0034实施例1、5氨基乙酰丙酸合成酶HEMA基因的表达载体的构建0035根据NCBI公布的类球红杆菌基因组序列，利用引物HEMAF5GCTCTAGAAGGAGAACAGCTATGGACTACAATCTGGCACTC3和HEMAR5CCCAAGCTTCGAAAGAAGTAGCA。
24、CAGGGC3，以含有HEMA基因的质粒PUI1014为模板进行PCR，克隆HEMA基因。将克隆的HEMA片段分别利用核酸内切酶XBAL和PSTI消化处理，同时将质粒载体PTRC99A也分别利用核酸内切酶XBAI和PSTI消化处理。将消化处理的HEMA片段和PTRC99A质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。0036连接体系为0037HEMA片段6L0038PTRC99A载体2L003910BUFFER1L00404连接酶LL004125连接1H后，将10L的连接液转化大肠杆菌YL106感受态细胞。0042转化过程为将10L的连接液加入感受态细胞中，混匀。冰浴30MIN，4。
25、2热击90S，冰浴2MIN，加入900L的LB培养基，37，180RPM，孵化LH，涂布氨苄青霉素抗性平板，培养16H，挑取转化子，提取质粒验证。然后进步测序验证HEMA基因的正确。从而获得重组质粒PTRC99AHEMA。0043实施例2、琥珀酰辅酶A合成酶SUCCD基因表达载体的构建0044根据NCBI公布的大肠杆菌基因组序列，利用引物HINDIIISUCCDF5CCCAAGCTTAGAAGGAGAACAGCTATGAACTTACATGAATATCAGGCA3和HINDIIISUCCDR5CCCAAGCTTTTATTTCAGAACAGTTTTCAGTGC3，以大肠杆菌MG1655基因组为模板。
26、，PCR扩增SUCCD基因。将克隆的SUCCD片段利用核酸内切酶HINDIII消化处理，同时将质粒载体PTRC99AHEMA也核酸内切酶HINDIII消化处理。将消化处理的SUCCD片段和PTRC99AHEMA质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。说明书CN104195190A5/9页70045连接体系为10L0046SUCCD片段6L0047PTRC99AHEMA载体2L004810BUFFER1L0049T4连接酶05L005025连接1H后，将10L的连接液转化大肠杆菌YL106感受态细胞。0051转化过程为将10L的连接液加入100L的YL106感受态细胞中，混匀。。
27、冰浴30MIN，42热击90S，冰浴2MIN，加入900L的LB培养基，37，180RPM，孵化LH，涂布氨苄抗性平板，培养12H，挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证SUCCD基因的正确。从而获得过量表达HEMA和SUCCD的重组质粒PTRC99AHEMASUCCD。0052实施例3、利用工程菌W3110HEMASUCCD厌氧发酵生产ALA0053步骤1将所构建的重组载体PTRC99AHEMASUCCD以常规方法转化重组大肠杆菌W3110来源于美国典型菌种保藏中心，保藏号ATCC27325，获得能同时过量表达HEMA和SUCCD的重组大肠杆菌，命名为大肠杆菌W3110HEMASUCC。
28、D。0054步骤2用接种环从保藏的W3110HEMASUCCD的甘油管中蘸取菌液后，在含有100G/ML氨苄青霉素的LB平板上划线，并将划线的LB平板置于37培养12H。0055步骤3将LB平板上的单克隆接种于含50MLLB培养基的300ML摇瓶中，并放置在转速为250RPM，温度为37的摇床中，培养12H，得到种子培养液。0056步骤4取2ML种子液接种于含100MLAM1酵母粉无机盐发发酵培养基的300ML摇瓶中，并放置在转速为250RPM，温度为37的摇床中进行发酵，并用IPTG诱导。K2CO3调PH65。发酵初始添加2G/L甘氨酸。初始葡萄糖浓度为20G/L。0057步骤5将发酵培养1。
29、2H后的发酵液转入含130MLAM1酵母粉无机盐发酵培养基的厌氧瓶中，37，210RPM，厌氧发酵。分别于12H，22H，28H各补加2G/L甘氨酸，72H结束发酵。每6H取一次样检测ALA产量。0058发酵结果显示，该重组大肠杆菌经过72H厌氧发酵，ALA产量达到84MG/L。0059实施例4、产琥珀酸重组菌株W3110GAB的构建00601PLFB基因的敲除0061菌种大肠杆菌W31100062所述LB培养基为蛋白胨10G/L，酵母粉5G/L，NACL10G/L，氨苄青霉素,100MG/L，氯霉素50MG/L。0063所述氨苄霉素抗性平板为含有100MG/L的氨苄青霉素，15的琼脂粉的LB。
30、固体培养基。0064所述氯霉素抗性平板为含有50MG/L的氯霉素，15的琼脂粉的LB固体培养基。0065所述SOC培养基为蛋白胨2G/L，酵母粉05G/L，NACL00585G/L，KCL00186G/L，MGCL20203G，MGSO40246G/L，葡萄糖20MMOL/L。0066A同源重组片断的克隆0067利用RED重组系统对目的基因进行敲除。0068根据GENBANK公布的PLFB基因序列设计引物0069PFLB_F5说明书CN104195190A6/9页80070TCGGCAACATTATCGGTGGTGGTTTGTTGGTTGGGTTGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTT30。
31、071PFLB_R50072ATAGATTGAGTGAAGGTACGAGTAATAACGTCCTGCTGCTATGGGAATTAGCCATGGTC30073以PKD4通过PCR聚合酶链式反应体外扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片断。PCR反应条件97预变性5MIN，94变性30S，58退火30S，72延伸2MIN，30个循环后72延伸10MIN，4保存。通过DPNI内切酶消化后，回收纯化浓缩同源重组片断。0074B电转化感受态细胞的制备0075挑取带有PKD46质粒的大肠杆菌W3110，转入LB培养基中，同时加入02的阿拉伯糖，培养OD600至05；0076冰浴15MIN，离心菌体，然后利用10。
32、的甘油洗涤三次；0077加入10的甘油，浓缩至50倍，分装感受态。0078C电转化，筛选重组子0079吸取1MG的同源重组片断，加入100L的感受态细胞中，混匀。调节电穿孔仪，25KV，电击；0080加入900L的SOC培养基，37，150RPM，培养1H；0081涂布氯霉素抗性平板，调取重组子利用引物0082PFLBF5ACTGATAACCTGATTCCGGTTACGA30083PFLBR5ATGGGAATTAGCCATGGTCCATATG30084进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实PFLB基因已被卡那霉素抗性基因替换。0085FRT位点专一重组0086将PCP20转入氯霉素抗性克。
33、隆，30培养8H，后提高至42过夜培养12H，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环蘸取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和氯霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在氯霉素抗性平板上不生长的已被FLP重组酶删除。利用检测引物PFLBF和PFLBR进一步鉴定。0087获得工程菌株W3110PFLB。00882PTSG基因的敲除0089菌种大肠杆菌W3110PFLB0090所述LB培养基为蛋白胨10G/L，酵母粉5G/L，NACL10G/L，氨苄青霉素,100MG/L，氯霉素50MG/L。0091所述氨苄霉素抗性平板为含有100MG/L的氨苄青霉素，15的琼脂。
34、粉的LB固体培养基。0092所述氯霉素抗性平板为含有50MG/L的氯霉素，15的琼脂粉的LB固体培养基。0093所述SOC培养基为蛋白胨2G/L，酵母粉05G/L，NACL00585G/L，KCL00186G/L，MGCL20203G，MGSO40246G/L，葡萄糖20MMOL/L。0094A同源重组片断的克隆0095利用RED重组系统对目的基因进行敲除。0096根据GENBANK公布的PTSG基因序列设计引物0097PKDPTSGF说明书CN104195190A7/9页900985ACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTGTGTAGGCTGGAGCTG。
35、CTTC30099PKDPTSGR01005AGCCATCTGGCTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC30101以PKD3通过PCR聚合酶链式反应体外扩增获得带有氯霉素抗性的重组片断。PCR反应条件97预变性5MIN，94变性30S，58退火30S，72延伸90S，30个循环后72延伸10MIN，4保存。通过DPNI内切酶消化后，回收纯化浓缩同源重组片断。0102B电转化感受态细胞的制备0103挑取带有PKD46质粒的大肠杆菌W3110PFLB，转入LB培养基中，同时加入02的阿拉伯糖，培养OD600至05；0104冰浴15MIN，离。
36、心菌体，然后利用10的甘油洗涤三次；0105加入10的甘油，浓缩至50倍，分装感受态。0106C电转化，筛选重组子0107吸取1MG的同源重组片断，加入100L的感受态细胞中，混匀。调节电穿孔仪，25KV，电击；0108加入900L的SOC培养基，37，150RPM，培养1H；0109涂布氯霉素抗性平板，调取重组子利用0110PTSGTESTF5CCTGTACACGGCGAGGCTCT30111PTSGTESTR5AATAACACCTGTAAAAAAGGCAGCC30112进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实PTSG基因已被氯霉素抗性基因替换。0113FRT位点专一重组0114将PCP。
37、20转入氯霉素抗性克隆，30培养8H，后提高至42过夜12H，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环蘸取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和氯霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在氯霉素抗性平板上不生长的已被FLP重组酶删除。利用检测引物PTSGTESTF和PTSGTESTR进一步鉴定。0115获得工程菌株W3110PFLBPTSG。01163LDHA基因的敲除0117菌株W3110PFLBPTSG0118所使用的LB培养基为1蛋白胨，1NACL，05酵母粉。0119所使用的氨苄霉素抗性平板为含有100MG/L氨苄霉素和15琼脂粉的LB固体培养基。012。
38、0所使用的卡那霉素抗性平板为含有50MG/L卡那霉素和15琼脂粉的LB固体培养基。0121A同源重组片段的克隆0122利用RED同源重组系统对目的基因进行敲除。根据GENBANK公布的LDHA基因序列在距其上下游约250BP处设计引物0123LDHAF5CAGCGTCAACGGCACAAGAAT30124LDHAR5GCTGATTTCTGGCGGATTTTT3说明书CN104195190A8/9页100125以MG1655LDHAKAN为模板，通过PCR聚合酶链式反应扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片段。PCR反应体系如下012610缓冲液5L；10MMOL/LDNTP混合液4L；20MOL/L。
39、的LDHAF引物1L；20MOL/L的LDHAR引物1L；TAQDNA聚合酶05L；模板DNA1L，加水补至50L；0127PCR反应条件95预变性5MIN，94变性30S，56退火30S，72延伸1MIN，30个循环后72终延伸10MIN，4保存。回收纯化浓缩同源重组片断备用。0128B电转化感受态细胞的制备01291挑取带有PKD46质粒的大肠杆菌W3110PFLBPTSG，接种到LB培养基中，同时加入1ML10阿拉伯糖，培养OD600至06；01302冰浴10MIN，收集菌体后利用10的甘油洗涤三五次；01313用100L的10甘油重悬即得到电转化感受态细胞，置于冰上备用。0132C电转。
40、化，筛选重组子01331取1MG纯化好的重组片段，加入到100L电转化感受态细胞中，混匀并冰置2MIN后，25KV电击。01342迅速加入900LLB培养基，37，150RPM回复培养1H。01353将菌体涂布于卡那霉素抗性平板上，挑去重组子划线后，利用检测引物0136LDHATESTF5TGCAATACGTGTCCCGAG30137LDHATESTR5CAGTTTGCCTTCACCGCT30138进行PCR检测。0139D抗性筛选标记的去除0140将质粒PCP20转入重组子，30220RPM培养6H，然后转入到42220RPM培养过夜12H。用接种环蘸取菌液在无抗性平板上划线，将长出的单克隆。
41、转接到无抗性平板和卡那霉素抗性平板上，能够在无抗性平板上生长而不能在卡那霉素抗性平板上生长的即为抗性已去除的重组子，然后利用LDHATESTF和LDHATESTR进一步PCR检测确定是否去除成功。0141E去除抗性成功的重组大肠杆菌菌株命名为产琥珀酸重组大肠杆菌W3110GAB基因型W3110PFLBPTSGLDHA。0142实施例4、利用工程菌W3110GABHEMASUCCD厌氧发酵生产ALA0143步骤1将所构建的重组载体PTRC99AHEMASUCCD以常规方法转化产琥珀酸重组大肠杆菌W3110GAB基因型为W3110PFLBPTSGLDHA，获得能同时过量表达HEMA和SUCCD的重。
42、组大肠杆菌，命名为大肠杆菌W3110GABHEMASUCCD。0144步骤2用接种环从保藏的W3110GABHEMASUCCD的甘油管中蘸取菌液后，在含有100G/ML氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上划线，并将划线的LB平板置于37过夜培养12H。0145步骤3将LB平板上的单克隆接种于含50MLLB培养基的300ML摇瓶中，并放置在转速为250RPM，温度为37的摇床中，过夜培养12H，得到种子培养液。0146步骤4取2ML种子液接种于含100MLAM1酵母粉无机盐发发酵培养基的300ML摇瓶中，并放置在转速为250RPM，温度为37的摇床中进行发酵，并用IPTG诱导。K2CO3调PH65。。
43、发酵初始添加2G/L甘氨酸。初始葡萄糖浓度为20G/L。说明书CN104195190A109/9页110147步骤5将培养12H后的发酵液转入含130MLAM1酵母粉无机盐发酵培养基的厌氧瓶中，37，210RPM，厌氧发酵。分别于12H，22H，28H各补加2G/L甘氨酸，72H结束发酵。每6H取一次样检测ALA产量。0148发酵结果所示，该重组大肠杆菌经过72H厌氧发酵，ALA产量达到240MG/L。0149实施例5、重组大肠杆菌工程菌YL106HEMASUCCD厌氧发酵生产5ALA0150步骤1将所构建的重组质粒PTRC99AHEMASUCCD以常规方法转化产琥珀酸重组大肠杆菌YL106中。
44、，得到同时过量表达HEMA和SUCCD的重组大肠杆菌YL106HEMASUCCD。上述产琥珀酸重组大肠杆菌YL106已于2013年4月17日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCCNOM2013149，其基因型为MG1655PTSGPOXBPTAICLRSDHAARCALDHAADHEPCKAGLFZM。0151步骤2用接种环从保藏的YL106HEMASUCCD的甘油管中蘸取菌液后，在含有100G/ML氨苄青霉素的LB平板上划线，并将划线的LB平板置于37过夜培养12H。0152步骤3将LB平板上的单克隆接种于含50MLLB培养基的300ML摇瓶中，并放置在转速为250RPM，温。
45、度为37的摇床中，过夜培养12H，得到种子培养液。0153步骤4取2ML种子液接种于含100MLAM1酵母粉无机盐发发酵培养基的300ML摇瓶中，并放置在转速为250RPM，温度为37的摇床中进行发酵，并用IPTG诱导。K2CO3调PH65。发酵初始添加2G/L甘氨酸。初始葡萄糖浓度为20G/L。0154步骤5将培养12H后的发酵液转入含130MLAM1酵母粉无机盐发酵培养基的厌氧瓶中，37，210RPM，厌氧发酵。分别于12H，22H，28H各补加2G/L甘氨酸，72H结束发酵。每6H取一次样检测5ALA产量。0155发酵结果如图3所示，该重组大肠杆菌经过72H厌氧发酵，5ALA产量达到165G/L，5ALA/葡萄糖转化率为032G/G。说明书CN104195190A111/2页12图1图2说明书附图CN104195190A122/2页13图3说明书附图CN104195190A13。