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1、10申请公布号CN104080925A43申请公布日20141001CN104080925A21申请号201280061797522申请日20121211P20113202320111215ESC12Q1/6820060171申请人拉蒙和卡哈尔大学医院生物医学研究基金会地址西班牙马德里72发明人伊莱亚阿瓜多弗赖莱米伦厄杜恩拉莫斯穆尼奥斯安格尔曼努埃尔坎德拉托哈费尔南多利亚诺加西亚马里亚劳拉加西亚贝尔梅霍74专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人郑斌彭鲲鹏54发明名称用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法57摘要本发明涉及作为急性肾损伤之标志物的MIRNAMIR26B、MIR。
2、29A、MIR454、MIR146A、MIR27A、MIR93和MIR10A，并且涉及使用所述标志物对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法和试剂盒。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014061386PCT国际申请的申请数据PCT/ES2012/0708582012121187PCT国际申请的公布数据WO2013/087961ES2013062051INTCL权利要求书1页说明书7页附图7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图7页10申请公布号CN104080925ACN104080925A1/1页21用于获得可用于对急性肾损伤进行诊断和/或。
3、预后之数据的方法，其包括在从对象分离的样品中测定选自以下的至少一种微RNA的表达水平MIR26B、MIR29A、MIR454、MIR146A、MIR27A、MIR93和MIR10A。2用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法，其包括根据权利要求1所述的方法以及将所述表达水平与对照值进行比较，其中所述表达水平的改变指示急性肾损伤。3根据前述权利要求中任一项所述的用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法，其中待分析的样品选自血液、血清或尿。4根据权利要求2至3中任一项所述的用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法，其中与对照值相比所述MIR26B、MIR29A、MIR454、MIR146A、MIR。
4、27A、MIR93和/或MIR10A之血清表达水平的降低指示急性肾损伤。5根据前述权利要求中任一项所述的用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法，其中所述微RNA的表达通过定量PCR测定。6根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微RNA的表达水平通过RNA微阵列测定。7根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述方法包括共同测定MIR26B、MIR29A、MIR454、MIR146A、MIR27A、MIR93和MIR10A的表达水平。8根据权利要求7所述的方法，其中所述微RNA中至少一种的表达水平的降低指示急性肾损伤。9选自以下的至少一种微RNA用于对急性肾损伤进行诊断和预后的用途。
5、MIR26B、MIR29A、MIR454、MIR146A、MIR27A、MIR93和MIR10A。10MIR26B、MIR29A、MIR454、MIR146A、MIR27A、MIR93和MIR10A共同用于对急性肾损伤进行诊断和预后的用途。11用于根据权利要求1至8所述的方法对急性肾损伤进行诊断和/或预后的试剂盒，其包含用于测定选自以下的至少一种微RNA之表达水平所需的探针和引物MIR26B、MIR29A、MIR454、MIR146A、MIR27A、MIR93和MIR10A。12根据权利要求11所述的试剂盒用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的用途。权利要求书CN104080925A1/7页3用。
6、于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法技术领域0001本发明包括在生物医学的一般领域中并且特别地涉及用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法。背景技术0002MIRNA是小的、内源性编码的RNA22至25个核苷酸，其能够识别信使RNA并且由于与其靶MRNA部分或完全互补而在RNA诱导性沉默复合物RISC中负性调节蛋白质表达。大多数MIRNA是由RNAPOLII从单个基因转录或者从多顺反子转录物一次转录它们中的几个。它们作为较长的前MIRPREMIR产生，所述前MIR在细胞核中被核糖核酸酶III加工，通过核输出蛋白5EXPORTINA5和RANGTP依赖性机制移出至细胞质，并且在细胞质中通过另一。
7、核糖核酸酶III最终加工成其成熟形式。0003它们的功能在很多种过程包括胚胎发育、应激反应或生理过程的严格调节中是必不可少的，从而维持身体的稳态。0004最近已经证实，MIRNA是针对任何类型之刺激包括缺乏营养素或缺氧作出迅速且精确之细胞应答的关键调节子IVANM，HARRISAL，MARTELLIF，KULSHRESHTHARHYPOXIARESPONSEANDMICRORNASNOLONGERTWOSEPARATEWORLDSJCELLMOLMED；125A142631，2008。0005专利申请WO2011012074描述了作为肝癌之血浆标志物的一系列MIRNA其中包括MIR29A，以及。
8、基于对所述MIRNA之至少一种的检测来对肝癌进行诊断和评价的方法。0006专利申请WO2009036236涉及作为肝癌之血浆标志物的一系列MIRNA其中包括MIR146A，以及基于对所述微RNA之至少一种的检测来对不同肿瘤病理状况进行诊断和/或评价的方法。0007AKKINA，S等，“MICRORNASINRENALFUNCTIONANDDISEASE”，TRANSLATIONALRESEARCH，2011年4月，第157卷，第4期，236240页和LI，JY等，“REVIEWTHEROLEOFMICRORNASINRENALDISEASE”，NEPHROLOGYCARLTON，2010年9月。
9、，第15卷，第6期，599608页，描述了MIRNA参与肾的生理和病理。0008JUAN，D等，“IDENTICATIONOFAMICRORNAPANELFORCLEARCELLKIDNEYCANCER”，UROLOGY，2010年4月，第75卷，第4期，83541页，描述了作为肾癌标志物的一系列MIRNA。0009作为综合征的急性肾衰竭ARF的特征是几天或几周内肾小球滤过液急剧降低，在临床上表现为无法排泄含氮废物以及无法调节体液和电解质稳态。0010ARF是发达国家的肾脏疾病中最严重问题的之一，因为它伴有约50的高死亡率。作为多器官衰竭的结果，所有ARF事件的约30在住进了ICU的患者中发生。
10、。在最后这种情况下，死亡率提高到80。0011ARF的发生也是心脏介入后最常见的并发症之一，所述心脏介入在西班牙每年总计30,000例并且超过1在该医院进行。实际上，所有经历介入的患者都发生某种程度的说明书CN104080925A2/7页4ARF。患者的长期进展取决于这种手术后ARF的严重性，在心脏介入后需要透析的那些案例中导致接近60的死亡率CANDELATOHAA，ELIASMARTINE，ABRAIRAV等PREDICTINGACUTERENALFAILUREAFTERCARDIACSURGERYEXTERNALVALIDATIONOFTWONEWCLINICALSCORESCLINJA。
11、MSOCNEPHROL；3126012652008。心脏手术和肾移植二者是在人中研究ATN的两种“准”实验情形，因为缺血性刺激的时刻和持续时间是已知的并且还可被监控。所有这些发病率死亡率统计数字在过去的几十年间没有显著变化，且直到目前为止，没有有效的治疗来预防和/或降低所有这些情形中的ATN。这很大程度上是由于除了目前使用的血清中肌酸酐和尿素的测定，缺乏更精确的肾损伤标志物。这些常规的标志物不直接反映细胞损伤，也不反映其中发生所述损伤的肾组织小管或内皮区室，它们仅仅是指示由损伤导致的肾功能削弱的参数VAIDYAVS，WAIKARSS，FERGUSONMA，等，URINARYBIOMARKERS。
12、FORSENSITIVEANDSPECICDETECTIONOFACUTERENALINJURYINHUMANSCLINTRANSLSCI；13200208，2008。实际上，像这种具有亚临床肾损伤的患者未被鉴定是可能的，因为在血清肌酸酐和尿素水平中没有明显的改变。因此，近年来，进行了多种研究以鉴定并验证ARF的新标志物例如NGAL、IL18、KIM、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白CCISTATINAC、VEGF或CXCL10，所述标志物在没有显著附加病理状况的儿童人群中而非在成年人群中似乎是良好标志物VAIDYAVS，WAIKARSS，FERGUSONMA，等，URINARYBIOMARKERSFOR。
13、SENSITIVEANDSPECICDETECTIONOFACUTERENALINJURYINHUMANSCLINTRANSLSCI13200208，2008。0012以上所述的每一件事证明需要鉴定并验证用于肾损伤进展的新的、更精确的生物标志，其指示其中发生发生损伤的组织区室以及损伤和/或恢复的程度，其测定也是快速、简单的并且无需在患者身上进行活检。发明内容0013因此，在本发明的第一方面涉及用于获得可用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后之数据的方法，其可包括在从对象分离的样品中测定选自以下的至少一种微RNA的表达水平MIR26B、MIR29A、MIR454、MIR146A、MIR27A、MIR。
14、93、MIR10A。0014在本发明中，急性肾损伤被理解为在几小时或几天内由肾功能急剧降低导致的任何损伤，理解为肾小球滤过液的降低或血清氮化产物的积累，或者理解为不能调节稳态。0015在第二方面，本发明涉及用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的方法下文中本发明的方法，其包括在从对象分离的样品中测定选自以下的至少一种微RNA的表达水平MIR26B、MIR29A、MIR454、MIR146A、MIR27A、MIR93、MIR10A，并且包括将所述表达水平与对照值比较，其中所述表达水平的改变指示急性肾损伤。0016在本发明的一个更具体的实施方案中，待分析的样品选自血液、血清或尿。0017在本发明的一个。
15、更具体的实施方案中，血清中MIR26B、MIR29A、MIR454、MIR146A、MIR27A、MIR93和/或MIR10A的表达水平相对于对照值降低指示急性肾损伤。0018在本发明的一个优选实施方案中，微RNA的表达通过定量PCR测定。0019在本发明的另一个优选实施方案中，微RNA的表达水平通过RNA微阵列测定。0020在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的方法包括共同测定MIR26B、MIR29A、MIR454、MIR146A、MIR27A、MIR93和MIR10A的表达水平。在另一个更优选实说明书CN104080925A3/7页5施方案中，微RNA之至少一种的表达水平降低指示急性肾。
16、损伤。0021在第三方面，本发明涉及选自以下的至少一种微RNA用于对急性肾损伤进行诊断和预后的用途MIR26B、MIR29A、MIR454、MIR146A、MIR27A、MIR93和MIR10A。0022在第四方面，本发明涉及MIR26B、MIR29A、MIR454、MIR146A、MIR27A、MIR93和MIR10A共同用于对急性肾损伤进行诊断和预后的用途。0023在第五方面，本发明涉及用于根据本发明的方法对急性肾损伤进行诊断和/或预后的试剂盒下文中本发明的试剂盒，其包括用于测定选自以下的至少一种微RNA之表达水平所需的探针和引物MIR26B、MIR29A、MIR454、MIR146A、M。
17、IR27A、MIR93和MIR10A。0024在第六方面，本发明涉及本发明的试剂盒用于对急性肾损伤进行诊断和/或预后的用途。附图说明0025图1示出与健康个体健康的两个混合池中的MIRNA表达相比，具有缺血性病因PI和毒性病因PT的ARF患者中从诊断的时间DO至诊断后7天的血清MIR26B表达。A扩增循环的数据，其中在所有样品中都检测到相对于用作该技术之内对照的合成微RNA的MIRNA表达交叉阈值，CT，B在ARF患者中的MIRNA表达相对于健康个体的倍数，通过指数数学公式使健康个体的MIRNA表达等于1。0026图2示出与健康个体健康的两个混合池中的MIRNA表达相比，具有缺血性病因PI和毒。
18、性病因PT的ARF患者中从诊断的时间DO至诊断后7天的血清MIR29A表达。A扩增循环的数据，其中在所有样品中都检测到相对于用作该技术之内对照的合成微RNA的MIRNA表达交叉阈值，CT，B在ARF患者中的MIRNA表达相对于健康个体的倍数，通过指数数学公式使健康个体的MIRNA表达等于1。0027图3示出与健康个体健康的两个混合池中的MIRNA表达相比，具有缺血性病因PI和毒性病因PT的ARF患者中从诊断的时间DO至诊断后7天的血清MIR454表达。A扩增循环的数据，其中在所有样品中都检测到相对于用作该技术之内对照的合成微RNA的MIRNA表达交叉阈值，CT，B在ARF患者中的MIRNA表达。
19、相对于健康个体的倍数，通过指数数学公式使健康个体的MIRNA表达等于1。0028图4示出与健康个体健康的两个混合池中的MIRNA表达相比，具有缺血性病因PI和毒性病因PT的ARF患者中从诊断的时间DO至诊断后7天的血清MIR146表达。A扩增循环的数据，其中在所有样品中都检测到相对于用作该技术之内对照的合成微RNA的MIRNA表达交叉阈值，CT，B在ARF患者中的MIRNA表达相对于健康个体的倍数，通过指数数学公式使健康个体的MIRNA表达等于1。0029图5示出与健康个体健康的两个混合池中的MIRNA表达相比，具有缺血性病因PI和毒性病因PT的ARF患者中从诊断的时间DO至诊断后7天的血清M。
20、IR27A表达。A扩增循环的数据，所述循环扩增中在所有样品中都检测到相对于用作该技术之内对照的合成微RNA的MIRNA表达交叉阈值，CT，B在ARF患者中的MIRNA表达相对于健康个体的倍数，通过指数数学公式使健康个体的MIRNA表达等于1。0030图6示出与健康个体健康的两个混合池中的MIRNA表达相比，具有缺血性病说明书CN104080925A4/7页6因PI和毒性病因PT的ARF患者中从诊断的时间DO至诊断后7天的血清MIR93表达。A扩增循环的数据，其中在所有样品中都检测到相对于用作该技术之内对照的合成微RNA的MIRNA表达交叉阈值，CT，B在ARF患者中的MIRNA表达相对于健康个。
21、体的倍数，通过指数数学公式使健康个体的MIRNA表达等于1。0031图7示出与健康个体健康的两个混合池中的MIRNA表达相比，具有缺血性病因PI和毒性病因PT的ARF患者中从诊断的时间DO至诊断后7天的血清MIR10A表达。A扩增循环的数据，其中在所有样品中都检测到相对于用作该技术之内对照的合成微RNA的MIRNA表达交叉阈值，CT，B在ARF患者中的MIRNA表达相对于健康个体的倍数，通过指数数学公式使健康个体的MIRNA表达等于1。0032发明详述0033首先使用从具有不同病因之急性肾衰竭患者获得的RNA进行大规模微RNA研究的实验。用于这一方法的样品由以下组成0034在通过常规临床诊断参。
22、数例如血清肌酸酐指示最大肾损伤时来0035自具有缺血性病因之急性肾衰竭患者的两个样品。0036肾衰竭后7或10天，通过血清肌酸酐再次评估器官功能恢复时，来自这些相同患者的两个样品。0037来自患有由肾毒性物质引起之肾衰竭的患者的两个样品，一个为在最大损伤时，而另一个在当肾功能恢复时。0038在最大器官损伤时从具有由脓毒症引起之肾衰竭的患者获取的样品。0039用作对照的由5个健康人组成的两个组。0040通过使用APPLIEDBIOSYSTEMS的TAQMANLOWDENSITYARRAYTLDA平台的定量PCR进行大规模血清微RNA研究的实验。通过分析所获得的数据，选择感兴趣的微RNA用于研究。。
23、0041随后确认在之前实验中获得的经选择微RNA的表达数据。为达到这一目的，使用了来自除了以上提到的那些患者之外的样品，并且他们由以下组成0042四个具有缺血性病因的急性肾衰竭患者，称为PI1、PI2、PI3、PI4。使用在肾衰竭之诊断后0天诊断的时间、1天、3天、5天和7天来自每位患者的样品。0043三个具有由肾毒性物质引起之急性肾衰竭的患者，称为PTI、PT2、PT3。使用在肾衰竭之诊断后0天诊断的时间、1天、3天、5天和7天来自每位患者的样品。0044两个对照组，各由10个健康人组成。0045为确认数据，使用单独的探针对LNA技术EXIQON之每种微RNA进行定量PCR。0046如在图1。
24、至4中所示，血清MIRNA表达在ARF患者中相对于健康对照降低。0047图5示出MIR27A表达在ARF患者中相对于健康对照降低。重要的是注意到7天内的MIR27A表达在患者中更易变化并且它们中的一些具有恢复健康个体之表达值的趋势。0048MIR93表达图6在ARF患者中相对于健康对照降低，并且还应当注意到，在第7天，在一些患者中这一微RNA显示出恢复到接近对照值的趋势。0049MIR10A表达图7在一些ARF患者中相对于健康对照降低，这一趋势未在缺血性患者中观察到，并且的确重要的是注意到在一些患者中在第7天MIRNA表达水平恢复。说明书CN104080925A5/7页70050此外，对不同患。
25、者中的MIRNA表达，通过ROC曲线分析计算曲线下面积值。0051表1示出这些微RNA具有ARF诊断价值无论ARF的病因为何，具有比血清肌酸酐目前用作标志物大得多的特异性和灵敏度。00520053表1在第0天ICU中ARF患者之微RNA的ROC曲线分析。0054表2的数据证明这些微RNA比肌酸酐更加敏感和特异，表明尽管肌酸酐值正常，肾损害持续，使得这些微RNA对于那些随时间成为长期慢性肾损伤患者的进展具有高的预后价值。0055说明书CN104080925A6/7页80056表2在第7天ICU中ARF患者之微RNA的ROC曲线分析。0057表3的数据示出这些微RNA中的改变指示心脏手术后发生缺血。
26、性ARF的倾向。00580059说明书CN104080925A7/7页90060表3心脏手术后患者之微RNA的ROC曲线分析。0061表4的数据示出这些微RNA中的改变是心脏手术后发生ARF的早期指示物。00620063表4心脏手术后即刻对患者之微RNA进行ROC曲线分析。说明书CN104080925A1/7页10图1说明书附图CN104080925A102/7页11图2说明书附图CN104080925A113/7页12图3说明书附图CN104080925A124/7页13图4说明书附图CN104080925A135/7页14图5说明书附图CN104080925A146/7页15图6说明书附图CN104080925A157/7页16图7说明书附图CN104080925A16。