一种用于五种鳜亚科鱼类分子的试剂盒及鉴定方法.pdf

本发明提供了一种用于五种鳜亚科鱼类分子的试剂盒及鉴定方法，试剂盒包括三对SSR引物和标准图谱，一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类的分子的鉴定方法，其步骤：1）DNA提取：采集待测鳜鱼样品的鳍条或者肌肉组织，提取基因组DNA并测定其纯度和浓度；2）DNA片段扩增：采用聚合酶链式反应扩增待测样品基因组DNA；3）PCR产物的电泳及银染色鉴定：对PCR产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，常规银染法染色后，拍照记录电泳结果；4）与标准图谱进行对比。本发明可显著提高鳜亚科重要经济、稀有种类间鉴定的效率和准确性，有助于鳜亚科鱼类遗传资源的保护和鳜鱼养殖业的持续健康发展。

1.  一种用于五种鳜亚科鱼类分子的试剂盒，它包括三对SSR引物和标准图谱，其中用于聚合酶链式反应的三对引物序列分别为：
    引物1正向序列：5’TACATGCACACCAGTACGG3’,
引物1反向序列：5’ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’;
引物2正向序列：5’ TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’,
引物2反向序列：5’ ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’;
    引物3正向序列：5’ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’,
引物3反向序列：5’GCATGGATGCCAGCGTGA3’;
用于鉴别五种鳜亚科鱼类的标准图谱为：
       一种引物1扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱；一种引物2扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱；一种引物3扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱。

2.  权利要求1所述的一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类的分子的鉴定方法，其步骤是：
    1）DNA提取：采集待测鳜鱼样品的鳍条或者肌肉组织，提取基因组DNA并测定其纯度和浓度；测得DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值为1.82-1.97；
    2）DNA片段扩增：采用聚合酶链式反应扩增待测样品基因组DNA，扩增引物序列为：
    引物1正向序列：5’TACATGCACACCAGTACGG3’,
    引物1反向序列：5’ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’;
    引物2正向序列：5’ TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’,
    引物2反向序列：5’ ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’;
    引物3正向序列：5’ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’,
    引物3反向序列：5’GCATGGATGCCAGCGTGA3’;
本步骤中测得DNA的浓度范围为585.5-3210.4 ng/μl;
PCR反应程序为：94℃预变性4min，然后按以下条件进行35个循环：94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环结束后72℃延伸10min结束，4℃中保存；
    3）PCR产物的电泳及银染色鉴定：对PCR产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，常规银染法染色后，拍照记录电泳结果；采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶；
4）与标准图谱进行对比：使用引物1，样品在靠近标准Marker的300bp位置扩增出1条DNA条带，则鉴定为中国少鳞鳜；使用引物1，在靠近标准Marker的180bp位置扩增出1条特异性条带，鉴定为斑鳜；使用引物2，样品在靠近标准Marker的200bp位置扩增出1条或2条DNA条带，鉴定为波纹鳜；使用引物3，样品在靠近标准Marker的120bp位置扩增出1条DNA条带，鉴定为翘嘴鳜；使用引物3，样品在靠近标准Marker的120bp位置扩增出1条DNA条带，鉴定为大眼鳜。

3.  根据权利要求2所述的一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类的分子的鉴定方法，其特征在于：所述的步骤（3）中PCR反应体系为：

根据权利要求2所述的一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类的分子的鉴定方法，其特征在于：所述的步骤（4）中使用引物1和引物2，待测样品为五种鳜亚科鱼类：翘嘴鳜、大眼鳜、斑鳜、中国少鳞鳜及波纹鳜中的任意一种。

4.  根据权利要求2所述的一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类的分子的鉴定方法，其特征在于：所述的步骤（4）中使用引物3时，待测样品为翘嘴鳜或大眼鳜任意一种。

一种用于五种鳜亚科鱼类分子的试剂盒及鉴定方法
技术领域
本发明属于水产养殖鱼种及水产动物天然种质资源鉴定技术领域，具体涉及一种用于五种鳜亚科鱼类分子的试剂盒，同时还涉及一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类分子的鉴定方法。
背景技术
鳜亚科隶属鲈形目，自然仅分布于东亚（俄罗斯、日本、韩国、中国和越南（红河））。鳜亚科中，翘嘴鳜(Siniperca chuatsi Basilewsky)、大眼鳜(Siniperca kneri Garman)和斑鳜(S iniperca scherzeri Steindachner)为我国主要养殖名贵鱼类,它们生活习性基本相同，外形特征相似。以上三种经济鳜鱼在育种过程中，育苗阶段无法根据形态学鉴别，尤其翘嘴鳜与大眼鳜即使在鱼种和成鱼阶段，形态学手段亦不易鉴别。中国少鳞鳜(Coreoperca whiteheadi Boulenger)和波纹鳜(Siniperca undulate Fang&Chong)为鳜亚科中珍稀种类，肉质细嫩、味道鲜美，苗种阶段均不易鉴别。
微卫星是由2-6个核苷酸组成的具有高度变异性的简单重复DNA序列。它分布于真核生物的整个基因组中，具有等位基因数目多、重复性好、呈共显性遗传等特点，被广泛应用于物种鉴定和基因定位等方面的研究。目前除翘嘴鳜与斑鳜外，尚缺乏采用微卫星分子鉴定法进行五种鳜亚科鱼类鉴定的相关报道。
发明内容
本发明目的是在于提供了一种用于五种鳜亚科鱼类分子的试剂盒，可显著提高鳜亚科重要经济、稀有种类间鉴定的效率和准确性，有助于鳜亚科鱼类遗传资源的保护和鳜鱼养殖业的持续健康发展。运用本试剂盒，可弥补形态学鉴定的不足，解决了水产养殖中三种常见养殖鳜类（翘嘴鳜、大眼鳜和斑鳜）苗种鉴定的难题，解决了鳜亚科珍稀种类（中国少鳞鳜和波纹鳜）种属鉴别的问题，从而促进鳜亚科遗传资源的合理保护和养殖业的健康发展。
本发明的另一个目的是在于提供了一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类分子的鉴定方法，方法易行，操作简便，鉴定效率高、准确性好。该方法运用微卫星分子标记鉴别鳜亚科主要养殖种类（翘嘴鳜、大眼鳜和斑鳜）及珍稀种类（中国少鳞鳜和波纹鳜），以利于鳜亚科养殖群体的合理管理以及野生资源的保护。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种用于五种鳜亚科鱼类分子的试剂盒，它包括三对SSR引物和标准图谱，其中用于聚合酶链式反应的三对引物序列分别为：
引物1正向序列：5’TACATGCACACCAGTACGG3’,
引物1反向序列：5’ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’;
引物2正向序列：5’TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’,
引物2反向序列：5’ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’;
引物3正向序列：5’ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’,
引物3反向序列：5’GCATGGATGCCAGCGTGA3’;
用于鉴别五种鳜亚科鱼类的标准图谱为：
一种引物1扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱示意图（图1）；一种引物2扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱示意图（图2）；一种引物3扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱示意图（图3）。
一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类的分子的鉴定方法，其步骤是：
1）DNA提取：采集待测鳜鱼样品的鳍条或者肌肉组织，提取基因组DNA并测定其纯度和浓度；本步骤中测得DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值为1.82-1.97。
2）DNA片段扩增：采用聚合酶链式反应（PCR）扩增待测样品基因组DNA，扩增引物序列为：
引物1正向序列：5’TACATGCACACCAGTACGG3’,
引物1反向序列：5’ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’;
引物2正向序列：5’TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’,
引物2反向序列：5’ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’;
引物3正向序列：5’ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’,
引物3反向序列：5’GCATGGATGCCAGCGTGA3’;
本步骤中测得DNA的浓度范围为585.5-3210.4ng/μl。
本步骤中PCR反应程序为：94℃预变性4min，然后按以下条件进行35个循环：94℃30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环结束后72℃延伸10min结束，4℃中保存。
3）PCR产物的电泳及银染色鉴定：对PCR产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，常规银染法染色后，拍照记录电泳结果；
本步骤中PCR反应体系为：

本步骤中采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶。
4）与标准图谱进行对比：使用引物1，如样品在靠近标准Marker的300bp位置扩增出1条DNA条带，则鉴定为少鳞鳜；使用引物1，在靠近标准Marker的180bp位置扩增出1条特异性条带，则鉴定为斑鳜；使用引物2，如样品在靠近标准Marker的200bp位置扩增出1条或2条DNA条带，则鉴定为波纹鳜；使用引物3，如样品在靠近标准Marker的120bp位置扩增出1条DNA条带，则鉴定为翘嘴鳜；使用引物3，如样品在靠近标准Marker的120bp位置扩增出1条DNA条带，则鉴定为大眼鳜。
所述4）步骤中使用引物1和引物2时，待测样品为五种鳜亚科鱼类：翘嘴鳜、大眼鳜、斑鳜、中国少鳞鳜及波纹鳜中的任意一种。
所述4）步骤中使用引物3时，待测样品为翘嘴鳜或大眼鳜任意一种。
本发明的优点在于：
鳜亚科隶属鲈形目，自然分布于东亚（俄罗斯、日本、韩国、中国和越南（红河））。鳜 亚科中，翘嘴鳜(Siniperca chuatsi Basilewsky)、大眼鳜(Siniperca kneri Garman)和斑鳜(Sini perca scherzeri Steindachner)为我国主要养殖名贵水产种类,它们生活习性基本相同，外形特征相似。以上三种经济鳜鱼在育种过程中，育苗阶段无法根据形态学鉴别，尤其翘嘴鳜与大眼鳜即使在鱼种和成鱼阶段，形态学手段亦不易鉴别。中国少鳞鳜(Coreoperca whitehead i Boulenger)和波纹鳜(Siniperca undulate Fang&Chong)为鳜亚科中的珍稀种类，肉质细嫩、味道鲜美，苗种阶段均不易鉴别。
微卫星是由2-6个核苷酸组成的具有高度变异性的简单重复DNA序列。它分布于真核生物整个基因组中，具有等位基因数目多、重复性好、呈共显性遗传等特点，被广泛应用于物种鉴定和基因定位等方面的研究。目前除翘嘴鳜与斑鳜外，尚缺乏采用微卫星分子鉴定法进行五种鳜亚科鱼类鉴定的相关报道。
本发明采用微卫星标记技术对五种鳜亚科鱼类进行鉴别，其反应稳定，重复性好，具有广泛的适用性；与传统的形态学鉴定相比，具有检测时间少，检测准确性高等特点。本发明可以弥补形态学鉴定的不足，解决水产养殖中三种常见养殖鳜类（翘嘴鳜、大眼鳜和斑鳜）苗种鉴定难题，解决鳜亚科珍稀种类（中国少鳞鳜和波纹鳜）种属鉴别问题，从而促进鳜亚科遗传资源的合理保护和养殖业的健康发展。因此，本发明有较高的产业化前景，实际操作性强，简便、准确，价格适中。
附图说明
图1为一种引物1扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱示意图。
斑鳜、少鳞鳜分别与另外三种鳜鱼（翘嘴鳜，大眼鳜和波纹鳜）扩增出不同大小的DNA条带，斑鳜样品在靠近标准Marker的180bp位置扩增出1条特异性条带，少鳞鳜样品在靠近标准Marker的300bp位置扩增出1条DNA条带，翘嘴鳜，大眼鳜和波纹鳜样品各在靠近标准Marker的140bp位置扩增出1条特异性条带，根据扩增样品的位置不同即可分辨出斑鳜和少鳞鳜。
图2为一种引物2扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱示意图。
波纹鳜与另外两种鳜鱼（翘嘴鳜，大眼鳜）扩增出不同大小的DNA条带，波纹鳜样品在靠近标准Marker的200bp位置扩增出1条或2条特异性条带，翘嘴鳜和大眼鳜样品各在靠近标准Marker的140bp位置扩增出1条或2条特异性条带，根据扩增样品的位置不同即可分辨出波纹鳜。
图3为一种引物3扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱示意图。
翘嘴鳜与大眼鳜扩增出不同大小的DNA条带，翘嘴鳜样品在靠近标准Marker的120bp位置扩增出1条特异性条带，大眼鳜样品在靠近标准Marker的140bp位置扩增出1条特异性条带，根据扩增样品的位置不同即可分辨出翘嘴鳜和大眼鳜。
具体实施方式
实施例1：
一种用于五种鳜亚科鱼类分子的试剂盒，它包括三对SSR引物和标准图谱，其中用于聚合酶链式反应的三对引物序列分别为：
引物1正向序列：5’TACATGCACACCAGTACGG3’,
引物1反向序列：5’ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’;
引物2正向序列：5’TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’,
引物2反向序列：5’ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’;
引物3正向序列：5’ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’,
引物3反向序列：5’GCATGGATGCCAGCGTGA3’;
用于鉴别五种鳜亚科鱼类的标准图谱为：
一种引物1扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱示意图（图1），图中所描述的斑鳜、中国少鳞鳜分别与另外三种鳜鱼（翘嘴鳜，大眼鳜和波纹鳜）扩增出不同大小的DNA条带。斑鳜样品在靠近标准Marker的180bp位置扩增出1条特异性条带，中国少鳞鳜样品在靠近标准Marker的300bp位置扩增出1条DNA条带，翘嘴鳜、大眼鳜和波纹鳜样品各在靠近标准Marker的140bp位置扩增出1条特异性条带，根据扩增样品的位置不同即可分辨出斑鳜和中国少鳞鳜。
一种引物2扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱示意图（图2），图中所描述的波纹鳜与另外两种鳜鱼（翘嘴鳜，大眼鳜）扩增出不同大小的DNA条带。波纹鳜样品在靠近标准Marker的200bp位置扩增出1条或2条特异性条带，翘嘴鳜和大眼鳜样品各在靠近标准Mark er的140bp位置扩增出1条或2条特异性条带，根据扩增样品的位置不同即可分辨出波纹鳜。
一种引物3扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱示意图（图3），图中所描述的翘嘴鳜与大眼鳜扩增出不同大小的DNA条带。翘嘴鳜样品在靠近标准Marker的120bp位置扩增出1条特异性条带，大眼鳜样品在靠近标准Marker的140bp位置扩增出1条特异性条带，根据扩增样品的位置不同即可分辨出翘嘴鳜和大眼鳜。
一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类分子的鉴定方法，其步骤是：
1.DNA的提取：
从每尾鱼剪取鳍条组织提取基因组DNA，并用紫外分光光度计检测DNA浓度，浓度为1.5%的琼脂糖凝胶检测DNA纯度。
2.扩增DNA片段：
即聚合酶链式反应，用于PCR反应的三对引物DNA序列为：
1）引物1正向序列：5’TACATGCACACCAGTACGG3’,
引物1反向序列：5’ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’;
引物2正向序列：5’TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’,
引物2反向序列：5’ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’;
引物3正向序列：5’ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’,
引物3反向序列：5’GCATGGATGCCAGCGTGA3’;
2）PCR反应体系如下：


混匀离心
3）PCR反应程序为：94℃预变性4min，然后按以下条件进行35个循环：94℃30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环结束后72℃延伸10min结束，4℃中保存。
3.PCR产物的电泳及银染色鉴定：
1）PCR产物用8.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。
2）电泳图谱显示，使用引物1，如样品在靠近标准Marker的300bp位置扩增出1条DNA条带，则鉴定为少鳞鳜；使用引物1，在靠近标准Marker的180bp位置扩增出1条特异性条带，则鉴定为斑鳜；使用引物2，如样品在靠近标准Marker的200bp位置扩增出1条或2条DNA条带，则鉴定为波纹鳜；使用引物3，如样品（翘嘴鳜或大眼鳜）在靠近标准Marker的120bp位置扩增出1条DNA条带，则鉴定为翘嘴鳜；使用引物3，如样品在靠近标准Marker的120bp位置扩增出1条DNA条带，则鉴定为大眼鳜。相关结果请见图1、2和3的详细论述。