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1、10申请公布号CN104059080A43申请公布日20140924CN104059080A21申请号201410112506122申请日20140324C07D493/0420060171申请人浙江省中医药研究院地址310007浙江省杭州市天目山路132号72发明人董宇李洪玉寿旦张扬俞忠明74专利代理机构杭州丰禾专利事务所有限公司33214代理人王从友54发明名称火木层孔菌桑黄中单体成分HYPHOLOMINEB的制备方法57摘要本发明涉及火木层孔菌桑黄中单体成分HYPHOLOMINEB的制备方法，步骤如下1桑黄药材粉碎，超声提取；2提取物经第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取；3分取2中下层溶液。
2、经第二石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取；取上层萃取液，得到萃取物干粉；4制备流动相，得到上相溶液与下相溶液；5）下相溶液溶解萃取物干粉，上相溶液泵入高速逆流色谱仪分离管，主机为正转，将下相溶液泵入，到平衡后，取滤液注入进样阀，每15MIN收集1个流分；合并其中6070MIN时间段内所收集流分，减压回收溶剂，得到单体化合物HYPHOLOMINEB的干粉。本发明提取分离采用的技术手段新、分离效率高、方法稳定可重复。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图4页10申请公布号CN104059080ACN104059080A1。
3、/1页21火木层孔菌桑黄中单体成分HYPHOLOMINEB的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤1桑黄药材粉碎，采用60体积百分比浓度的乙醇水溶液超声提取；2乙醇提取物经第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取，第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液中石油醚和乙酸乙酯的体积比为31，弃去；3分取2中下层溶液经第二石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取，第二石油醚和乙酸乙酯混合溶液中石油醚和乙酸乙酯的体积比为11；取上层萃取液，浓缩，干燥，得到萃取物干粉；4制备流动相，流动相采用石油醚乙酸乙酯甲醇水体系，精密计量体积，配制成体积比为11712的混合溶液，充分振摇后静置3H，上下两层完全分层澄清，分离上下层，得到上相溶液。
4、与下相溶液，分别超声脱气30MIN，备用；5）取萃取物干粉，精密称重，取下相溶液，体积相当于萃取物干粉质量数的10倍量，溶解萃取物干粉，用045M孔径的微孔滤膜滤过，滤液备用；取上相溶液，泵入高速逆流色谱仪分离管，待固定相充满整个分离管后，调节主机为正转，至800R/MIN转速，同时将下相溶液泵入，待流动相从柱口流出且固定相不流出，两相溶剂在分离管中达到动态平衡后，取滤液10ML，注入进样阀进样，流速25ML/MIN的条件下，395NM波长下检测，分离样品，总分析时间200MIN，每15MIN收集1个流分；合并其中6070MIN时间段内所收集流分，减压回收溶剂，得到单体化合物HYPHOLOMI。
5、NEB的干粉。2根据权利要求1所述的HYPHOLOMINEB化合物的制备方法，其特征在于步骤1）中取桑黄药材，粉碎成蚕豆大颗粒，加入相当于8倍药材质量的浓度为60的乙醇水溶液，浸泡15MIN，超声提取30MIN，滤过，该过程重复三次合并3次滤液，减压回收溶剂，得到干燥粉末，备用。3根据权利要求1所述的HYPHOLOMINEB化合物的制备方法，其特征在于步骤2）中取步骤1）的乙醇提取物，20乙醇水溶液充分溶解，转移至分液漏斗中，放冷；加入同体积的第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液，振摇萃取；静置分层；分取下层水液，弃去上层；下层水液采用同样的萃取过程，重复萃取1次；弃去上层，得石油醚乙酸乙酯混合溶液萃。
6、取去杂后的水液，备用。4根据权利要求1所述的HYPHOLOMINEB化合物的制备方法，其特征在于步骤3）中取步骤2）的下层溶液，加入等体积的第二石油醚和乙酸乙酯混合溶液，振摇萃取；静置分层；分取上层，下层水液采用同样的萃取过程，重复萃取2次；合并3次的萃取液；50水浴蒸干，残渣冷藏备用。5根据权利要求1所述的HYPHOLOMINEB化合物的制备方法，其特征在于该方法还包括精制步骤取制备的干粉，加50乙腈水溶液充分溶解，体积相当于干粉质量数的10倍，备用；采用C18制备色谱柱，在流动相乙腈水体积比为11，流速3ML/MIN条件下，精密吸取上述制备的溶液，进样1ML，分离精制，395NM波长检测，。
7、总运行时间25MIN，收集225235MIN的洗脱液，减压干燥，得到淡黄色无定形粉末，即HYPHOLOMINEB精制品。权利要求书CN104059080A1/5页3火木层孔菌桑黄中单体成分HYPHOLOMINEB的制备方法技术领域0001本发明涉及一种属于药物领域，尤其涉及提取自火木层孔菌桑黄（PHELLINUSIGNIARIUS）中的一种单体成分HYPHOLOMINEB的制备方法。背景技术0002桑黄为担子菌门（BASIDIOMYCOTAS）、层菌纲HYMENOMYCETES）、非褶菌目（APHYLLOPHORALES）、锈革孔菌科（HYMENOCHAETACEAE）、针层孔菌属（PHELL。
8、INUSQUEL）大型药用真菌的子实体。桑黄始记于本草纲目，又名桑臣、桑耳、胡孙眼、桑黄姑，可用于治疗治血崩、血淋、脱肛泻血、带下、经闭、脾虚泄泻等。其来源主要包含火木层孔菌（PHELLINUSIGNIARIUSBERKETCURTTENG）、裂蹄木层孔菌（PHELLINUSLINTEUSLEXFRQUEL）和鲍氏层孔菌（PHELLINUSBAUMIIPILAT）三个种。目前国内外对桑黄研究较多集中于生物学特征、化学成分分析、药用机理以及菌种培育工艺等方面。0003桑黄因其临床确有疗效的抗肿瘤作用，近年来逐渐成为研究热点。早在1968年，日本学者IKEKAWA研究发现桑黄子实体提取物对小鼠S1。
9、80肉瘤的抑制率为967，第一次提出了桑黄具有肿瘤抑制作用。有关桑黄多糖免疫刺激和抗肿瘤活性研究报道较多，结果显示多糖能够促进抗体的产生，降低荷瘤小鼠毒副作用和增强体内协同作用，具有抑制S180肉瘤细胞和H22肝癌细胞小鼠移植瘤的生长作用。GELI等研究后认为桑黄蛋白多糖可降低人结肠癌细胞SW480中BCL2的表达，增加细胞色素C的释放和减少细胞周期蛋白B1来抑制SW480的生长，进而引发细胞凋亡作用。JONGJINLEE等研究发现桑黄菌丝体多糖对人肺腺癌细胞A549具有直接杀伤作用，而对正常细胞NIH3T3和L1210没有影响。JIDF等研究发现桑黄多糖可通过P27KIP1CYCLIND1/。
10、ECDK2途径抑制人结肠腺癌细胞HT29和人肝癌细胞HEPG2的细胞S期，从而抑制HT29和HEPG2的生长，引起细胞凋亡作用。0004桑黄的其他化学成分，如黄酮类、多酚类、三萜类等，相关生物活性研究报道集中于抗炎、抗氧化，抗病毒、降糖以及抗自由基等作用研究，其中INOSCAVINA、HYPHOLOMINEB等成为是桑黄中含量较高的多酚类成分，研究证实具有抗氧化、抗自由基作用。本发明采用溶剂提取，高速逆流色谱分离技术，自火木层孔菌桑黄（PHELLINUSIGNIARIUS中纯化制备得到一种单体成分，结合波谱解析，确定为多酚类物质HYPHOLOMINEB，是桑黄醇提物中主成分，生药中含量达078。
11、，并且峰位居中、与邻峰分离度良好。据报道该成分具有显著的抗氧化、抗炎活性，本发明确定了该成分的制备方法，应用该方法，能够批量制备桑黄单体成分，为桑黄药效学研究及药材质量控制提供物质基础。经检索，为见与本发明类似的关于HYPHOLOMINEB单体成分制备方法的公开，除了采用植化分离手段，得到微量成分用于化学结构研究的研究报道。如文献1“INKYOUNGLEE,MYUNGSUKHAN,MYEONGSEOKLEE,YOUNGSOOKKIM,BONGSIKYUN,STYRYLPYRONESFROMTHEMEDICINALFUNGUSPHELLINUSBAUMIIANDTHEIRANTIOXIDANTP。
12、ROPERTIES,BIOORGANICMEDICINALCHEMISTRYLETTERS20201054595461”；文献二“SHUNYANMO,SUJUANWANG,GUANGXIONGZHOU,说明书CN104059080A2/5页4ETALPHELLIGRIDINSCFCYTOTOXICPYRANO4,3C2BENZOPYRAN1,6DIONEANDFURO3,2CPYRAN4ONEDERIVATIVESFROMTHEFUNGUSPHELLINUSIGNIARIUSJNATPROD67（2004）823828”；文献三“YEONSILLEE,ILJUNKANG,MOOHOWON,JA。
13、EYONGLEE,JINKYUKIMANDSOONSUNGLIMINHIBITIONOFPROTEINTYROSINEPHOSPHATASE1BYHISPIDINDERIVATIVESISOLATEDFROMTHEFRUITINGBODYOFPHELLINUSLINTEUS,NATURALPRODUCTCOMMUNICATIONS5201019271930”。上述文献中均提到了化合物HYPHOLOMINEB并明确指出其结构式，文献1、2、3均采用溶剂提取柱分离技术，得到系列化合物，经光谱、质谱及核磁分析，鉴定所得化合物。文献3证实该化合物具有铁螯合活性，因而发挥抗氧化作用。但所有文献均以植化分。
14、离技术得到微量化合物，采用成分结构鉴定技术进行化合物结构解析，其目的是为了证明被研究植物中含有该化合物，而非批量纯化制备该化合物，因而不涉及该化合物的纯化制备过程。发明内容0005为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种火木层孔菌桑黄中单体成分HYPHOLOMINEB的制备方法，该方法具有分离效率高、方法稳定可重复和技术应用前景良好的特点。0006为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案火木层孔菌桑黄中单体成分HYPHOLOMINEB的制备方法，该方法包括以下的步骤1桑黄药材粉碎，采用60体积百分比浓度的乙醇水溶液超声提取；2乙醇提取物经第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取，第一石油醚。
15、和乙酸乙酯混合溶液中石油醚和乙酸乙酯的体积比为31，弃去；3分取2中下层溶液经第二石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取，第二石油醚和乙酸乙酯混合溶液中石油醚和乙酸乙酯的体积比为11；取上层萃取液，浓缩，干燥，得到萃取物干粉；4制备流动相，流动相采用石油醚乙酸乙酯甲醇水体系，精密计量体积，配制成体积比为11712的混合溶液，充分振摇后静置3H，上下两层完全分层澄清，分离上下层，得到上相溶液与下相溶液，分别超声脱气30MIN，备用；5）取萃取物干粉，精密称重，取下相溶液，体积相当于萃取物干粉质量数的10倍量，溶解萃取物干粉，用045M孔径的微孔滤膜滤过，滤液备用；取上相溶液，泵入高速逆流色谱仪分离管，待固。
16、定相充满整个分离管后，调节主机为正转，至800R/MIN转速，同时将下相溶液泵入，待流动相从柱口流出且固定相不流出，两相溶剂在分离管中达到动态平衡后，取滤液10ML，注入进样阀进样，流速25ML/MIN的条件下，395NM波长下检测，分离样品，总分析时间200MIN，每15MIN收集1个流分；合并其中6070MIN时间段内所收集流分，减压回收溶剂，得到单体化合物HYPHOLOMINEB的干粉。0007作为优选，所述的步骤1）中取桑黄药材，粉碎成蚕豆大颗粒，加入相当于8倍药材质量的浓度为60的乙醇水溶液，浸泡15MIN，超声提取30MIN，滤过，该过程重复三次合并3次滤液，减压回收溶剂，得到干燥。
17、粉末，备用。0008作为优选，所述的步骤2）中取步骤1）的乙醇提取物，20乙醇水溶液充分溶解，转移至分液漏斗中，放冷；加入同体积的第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液，振摇萃取；静置分说明书CN104059080A3/5页5层；分取下层水液，弃去上层；下层水液采用同样的萃取过程，重复萃取1次；弃去上层，得石油醚乙酸乙酯混合溶液萃取去杂后的水液，备用。0009作为优选，所述的步骤3）中取步骤2）的下层溶液，加入等体积的第二石油醚和乙酸乙酯混合溶液，振摇萃取；静置分层；分取上层，下层水液采用同样的萃取过程，重复萃取2次；合并3次的萃取液；50水浴蒸干，残渣冷藏备用。0010作为优选，该方法还包括精制步骤取。
18、制备的干粉，加50乙腈水溶液充分溶解，体积相当于干粉质量数的10倍，备用；采用C18制备色谱柱，在流动相乙腈水体积比为11，流速3ML/MIN条件下，精密吸取上述制备的溶液，进样1ML，分离精制，395NM波长检测，总运行时间25MIN，收集225235MIN的洗脱液，减压干燥，得到淡黄色无定形粉末，即HYPHOLOMINEB精制品。0011上述的方法制备的HYPHOLOMINEB化合物用于用于作为桑黄药材的质量评价与质量控制的指标成分，或者用于制备抗炎、抗氧化等药物的主成分。0012本发明由于采用了上述的技术方案，提供了桑黄中的一种单体成分HYPHOLOMINEB及其制备方法和应用，具体来说。
19、，本发明的方法可以实现桑黄中单体成分HYPHOLOMINEB化合物的批量制备，该化合物为HISPIDIN的衍生物，具有显著的抗氧化、抗炎的功效，被广泛用于保健品、化妆品中。同时，本发明的化合物为桑黄醇提取物中主成分，在桑黄醇提取物特征图谱中峰位居中，吸收最高（395NM条件下），与邻峰分离度好，能够作为指标成分，进行桑黄药材的质量评价与质量控制，为桑黄的实验研究及研发提供物质基础。0013本发明的有益效果是1、提取分离采用的技术手段新高速逆流色谱技术是目前中药与天然药物化学研究领域较为先进的分离技术，与传统的柱分离方法以及溶剂萃取方法相比，分离效率及分离效果均有明显的优势。本方法在溶剂粗提的基。
20、础上，采用高速逆流色谱技术，在技术手段上具有先进性。00142、分离效率高本方法采用乙醇提取，溶剂萃取的方式得到桑黄乙醇提取石油醚乙酸乙酯（11，V/V）混合溶剂萃取物，进一步采用高速逆流色谱技术，半制备液相纯化，分离得到纯度95以上的单体成分，基本达到含量测定标准物质的纯度要求。本方法省略了反复液液萃取以及柱分离过程，简化分离流程，节约了大量的溶剂处理时间。在不到一天的分离流程内，能够达到毫克级单体成分的制备能力。00153、方法稳定可重复本方法在液液萃取的基础上，采用高速逆流色谱及半制备液相色谱仪，完成单体成分纯化精制的关键环节，与传统反复液液萃取、柱分离制备方法相比，方法稳定，可重复性好。
21、。00164、技术应用前景良好药物及保健品的研发是研究重点领域，本发明建立的单体制备方法，能够为批量生产单体物质提供技术与方法，为后续的药效学研究，药材质量控制标准研究及药物研发提供基础。具有良好的应用前景。附图说明说明书CN104059080A4/5页60017图1为实施例1制备的HYPHOLOMINEB的结构式。0018图2为实施例1制备的HYPHOLOMINEB的液质分析图。0019图3为实施例1制备的HYPHOLOMINEB的高速逆流色谱图。0020图4为实施例1制备的HYPHOLOMINEB的半制备液相色谱图。0021图5为实施例1制备的HYPHOLOMINEB的单体HPLC纯度检测。
22、图。0022图6为桑黄醇提取物HPLC特征图谱。0023图7为不同来源、产地桑黄药材的HPLC指纹图谱。具体实施方式0024实施例1HYPHOLOMINEB化合物的制备纯化方法，该方法包括以下的步骤1取桑黄药材，粉碎成蚕豆大颗粒，精密称取1000G，加入8000ML质量浓度为60的乙醇水溶液，浸泡15MIN，超声提取30MIN，滤过；滤渣再加8000ML质量浓度为60的乙醇水溶液，超声提取30MIN，滤过；滤渣再次加8000ML质量浓度为60的乙醇水溶液，超声提取30MIN，滤过；合并3次滤液，减压浓缩，得到醇提取物粉末508G。00252取步骤1）中醇提取物10G，加500ML20乙醇溶液充。
23、分溶解，转移至分液漏斗中；加入500ML实现配好的石油醚乙酸乙酯（31，V/V）混合溶液，振摇萃取；静置分层；分取下层水液，上层弃去；下层水液再加500ML同种混合溶剂萃取；弃去上层，得石油醚乙酸乙酯（31，V/V）混合溶液除杂后的溶液。00263）取步骤2）的下层溶液液，体积约540ML，加入540ML石油醚乙酸乙酯（31，V/V）混合溶液，振摇萃取；静置分层；分取上层溶液，下层重复采用同样的萃取过程，重复萃取2次；合并3次萃取的上层溶液；50水浴蒸干。10G醇提取按此操作共得到约166G残渣，冷藏备用；4）精密量取石油醚200ML、乙酸乙酯340ML、甲醇200ML和纯水400ML，配制体。
24、积比11712的混合溶液，充分振摇后静置3H，上下两层完全分层澄清，分离上下层，得到上相溶液与下相溶液，分别超声脱气30MIN，备用；5）取步骤3）的残渣20MG，取步骤4）的下相溶液10ML，溶解残渣，溶液用045M孔径的微孔滤膜滤过，滤液备用；6）取步骤4）的上相溶液，泵入高速逆流色谱仪分离管，待固定相充满整个分离管后，调节主机为正转，至最大转速（800R/MIN），同时将步骤3）的下相溶液泵入，待流动相从柱口流出且固定相不流出，两相溶剂在分离管中达到动态平衡后，取步骤5）的滤液10ML，注入进样阀，流速25ML/MIN的条件下，395NM波长下检测，分离样品，总分析时间200MIN，每1。
25、5MIN收集1个流分；合并其中6070MIN内所收集的流分，约25ML，减压回收溶剂，同次操作最后合并共得到干粉295MG，备用；7）取步骤6）的干粉295MG，加295ML50的乙腈水溶液完全溶解，045M滤膜过滤，备用；8）利用制备型高效液相色谱仪，采用C18制备色谱柱（10MM250MM，5M，设置流动相乙腈（A相）水（B相）体积比为11，流速3ML/MIN条件下，取步骤7）的溶液，进样2ML，395NM波长检测，分离样品，总运行时间25MIN，收集125235MIN的洗脱液，减压干燥，说明书CN104059080A5/5页7步骤6）的溶液经15次进样，得到淡黄色无定形粉末，即HYPHO。
26、LOMINEB，约15MG。HPLC纯度检测含量为95。0027桑黄药材质量评价应用1）取采用本发明制备的单体成分HYPHOLOMINEB，加甲醇配制成质量浓度为01MG/ML的溶液，备用；2）取全国各主产区桑黄药材样品粗粉，精密称定，加质量浓度为60的乙醇溶液，浸泡15MIN，超声提取30MIN，提取液以045M微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液，备用；3）利用分析型高效液相色谱仪，采用C18柱（46MM250MM,5M），柱温30，以甲醇（A相）、02磷酸水溶液（B相）为流动相。梯度洗脱程序020MIN，A相3040；2030MIN，A相3040；3045MIN，A相45；4560MIN，A。
27、相4555，流速1ML/MIN，395NM波长下检测，分别吸取步骤1）的HYPHOLOMINEB溶液10L，步骤2）的桑黄药材供试品溶液各10L，进样分析，得到不同样品的HPLC特征图谱（见发明附图7）。各样品色谱图中，在与HYPHOLOMINEB相同保留时间位置，为药材中所含HYPHOLOMINEB的色谱峰，根据该峰面积，计算不同药材中HYPHOLOMINEB的含量，结果见表1，可以直观地比较不同样品中HYPHOLOMINEB的含量，从而评价不同药材的质量。0028表1不同来源及产地桑黄药材中HYPHOLOMINEB的含量编号来源产地含量（）1PHELLINUSIGNIARIUSLEXFRQ。
28、UL浙江淳安0782PHELLINUSLINTEUSBERKETCURTTENG云南玉溪0143PHELLINUSIGNIARIUSLEXFRQUL吉林延边0214PHELLINUSLINTEUSBERKETCURTTENG云南昆明0035PHELLINUSLINTEUSBERKETCURTTENG云南丽江0026PHELLINUSLINTEUSBERKETCURTTENG云南邵通0067PHELLINUSIGNIARIUSLEXFRQUL吉林白山026说明书CN104059080A1/4页8图1图2说明书附图CN104059080A2/4页9图3图4说明书附图CN104059080A3/4页10图5图6说明书附图CN104059080A104/4页11图7说明书附图CN104059080A11。