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1、10申请公布号CN104195098A43申请公布日20141210CN104195098A21申请号201410486185122申请日20140922C12N5/04200601A61K36/8984200601A61K8/97200601A61P17/14200601A61P39/06200601A61Q19/08200601A61Q5/1220060171申请人古焕庆地址澳大利亚新南威尔士州悉尼市肯特大街350号2层72发明人古焕庆74专利代理机构广州市华学知识产权代理有限公司44245代理人郭炜绵54发明名称铁皮石斛干细胞及其分离培养方法57摘要本发明公开了铁皮石斛干细胞及其分离培养。
2、方法，该方法包括以下步骤培养含有静止中心的植物根部组织、静止中心干细胞的传代培养及放大培养，然后再根据需要制成干细胞干粉或提取液。本发明克服了铁皮石斛离体材料易褐化的问题，其干细胞系的细胞尚未分化，营养条件下细胞增量大，培养时间短，细胞活性强大。本发明具有技术工艺易操作、流程少、产出量大，所得铁皮石斛干细胞抗衰老、抗氧化、促头发生长及抗脱发活性强，可制成防治各种衰老及脱发的功能保健品、化妆品以及中药抗衰老、抗脱发等相关药品。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图4页10申请公布号CN104195098ACN10。
3、4195098A1/1页21铁皮石斛干细胞的分离培养方法，其特征在于包括以下步骤1培养含有静止中心的植物根部组织取铁皮石斛的根尖，切除根冠，从切口开始截取1MM长的根部组织作为外植体，放入诱导培养基中培养36周；2静止中心干细胞的传代培养及放大培养将静止中心干细胞移入液态培养基中，在暗室中251下传代培养35周，此为第一阶段；第二阶段是将干细胞放大培养12周，然后加入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯、N苯酰甘氨酸以及无菌磁化水的混合液，再继续培养12周；第一阶段与第二阶段所用的液态培养基相同，都是N6培养基；步骤1的诱导培养基和步骤2的液态培养基中都含有18MG/L的2,4D；3制备铁皮石斛干细胞制剂A、。
4、干细胞干粉将放大培养后得到的细胞系超滤，截留回收大分子团；往大分子团中注入乙醇溶液，超声粉碎后二次超滤；收集滤过液，再用无水乙醇冲洗超滤柱，回收全部无水乙醇与滤过液混合，真空浓缩、真空冷冻干燥、粉碎即得铁皮石斛干细胞干粉；B、干细胞提取液将放大培养后得到的细胞系过滤，截留回收粘胶状细胞系培养物，将其在30下预冻25小时，再放入液氮中速冻25小时，再于232下解冻1小时，重复该预冻、速冻、解冻的操作1次；将获得的细胞系黏液质粉碎，然后注入乙醇溶液真空浓缩，将浓缩物真空冷冻干燥、粉碎，溶于水后即得铁皮石斛干细胞提取液。2根据权利要求1所述的铁皮石斛干细胞的分离培养方法，其特征在于步骤1所述的诱导培。
5、养基为N6培养基、MS培养基、B5培养基、LS培养基或KM培养基。3根据权利要求1所述的铁皮石斛干细胞的分离培养方法，其特征在于步骤2中，第一阶段的培养在烧瓶中进行，第二阶段的放大培养使用3L以上的气升式生物反应器。4根据权利要求1所述的铁皮石斛干细胞的分离培养方法，其特征在于步骤3中，所述超滤使用中空纤维超滤柱。5根据权利要求1所述的铁皮石斛干细胞的分离培养方法，其特征在于步骤3中，所述的过滤是使用孔径为13M的过滤器。6根据权利要求1所述的铁皮石斛干细胞的分离培养方法，其特征在于步骤3中，所述的乙醇溶液其体积浓度是7080。7一种铁皮石斛干细胞，其特征在于是由权利要求16任一项所述的方法制。
6、得。8根据权利要求7所述的铁皮石斛干细胞，特征在于其制剂形式是提取液或干粉。权利要求书CN104195098A1/7页3铁皮石斛干细胞及其分离培养方法技术领域0001本发明属于药用植物干细胞领域，具体涉及铁皮石斛DENDROBIUMOFCINALEKIMURAETMIGO干细胞及其分离培养方法。背景技术0002植物干细胞又称为分生组织，是植物生长发育的源泉和信号调控中心。由于植物干细胞是未分化的细胞，因此具有很强的自我更新和持续分裂能力，是拥有永久生存能力的“不朽细胞”；此外，植物干细胞还可以通过自我凋亡防止遗传性损伤，避免将有缺陷的DNA遗传下去，从而保护植物不受恶劣环境的影响。0003研究。
7、表明，植物干细胞是人体干细胞的激活剂；植物干细胞具有强大的抗氧化和抗衰老活性，能显著提高人体免疫力和抗癌能力，为人类健康、抗衰老长寿的研究开辟了一条新途径，在药品、功能性食品及保健品、化妆品等领域具有里程碑意义。0004如来自青蒿形成层的干细胞及其培养物不仅对脂多糖LPS诱导细胞释放NO有抑制作用，而且能抑制环氧合酶2COX2的表达，具有抗炎活性；来自紫杉形成层或原形成层的细胞系，其溶解产物、提取物及培养物可以诱导癌细胞死亡，并抑制肿瘤血管的生成，具有抗癌活性；来自番茄形成层的干细胞及其培养物能抑制与老化相关的酶的生成，抑制效率高于视黄酸。0005由植物细胞培养活性物质的生产与从植物直接提取的。
8、方法相比具有多种优点，前者不受外部环境的影响，可持续性地生产，因此被认为是可解决生态系统破坏的较佳方法。0006但是，尽管也有对植物细胞培养的大量投入与努力，然而产业化成功的案例仍极少。这是因为，在植物细胞培养中，细胞增殖与生产性的变异是主要问题。尤其是植物细胞培养过程中，只有能保证在长期培养期间能够维持稳定的、较快的细胞增殖与高的代谢产物生产能力才可产业化。发明内容0007本发明的首要目的在于提供铁皮石斛干细胞的分离培养方法，该方法是从铁皮石斛根尖静止中心的细胞系开始培养，获得了稳定遗传的植物干细胞，在该过程中无细胞变异发生；该方法的特征之一是不需要去分化步骤。0008本发明的另一目的在于提。
9、供由上述方法制得的铁皮石斛干细胞，它可以制成提取液或干粉；上述的铁皮石斛干细胞及其制剂即提取液或干粉具有抗衰老、抗氧化及防脱发等功效。0009本发明的目的通过下述技术方案实现0010在本文中，植物干细胞PLANTSTEMCELL是指未经历脱分化过程而在遗传上更加稳定的先天性的未分化细胞。静止中心是指包括定位在根顶端分生组织中央的5001000个不活跃细胞的球状或盘状单细胞群，该细胞群的细胞长期处于细胞周期的G1期并以大约1520天的间隔分裂；这些细胞常常以不活跃状态存在，然而受到切割或者辐射时会发说明书CN104195098A2/7页4生分裂。静止中心是遗传稳定的细胞所处的根顶端分生组织中的位。
10、置。静止中心会分化成作为根部基本分生组织的原形成层、基本分生组织和原表皮层。0011铁皮石斛干细胞的分离培养方法，包括以下步骤00121培养含有静止中心的植物根部组织0013取铁皮石斛的根尖，切除根冠，从切口开始截取1MM长的根部组织作为外植体，放入诱导培养基中培养36周；培养结束时，由于静止中心干细胞与其他根部组织细胞会体现出形态上的明显差异详见以下的描述，因此容易将静止中心的干细胞分离；0014所述的诱导培养基中含有18MG/L的2,4D2,4二氯苯氧乙酸，优选含有2MG/L的2,4D；0015所述的诱导培养基优选N6培养基、MS培养基、B5培养基、LS培养基或KM培养基；0016在组织培。
11、养期间，观察了来自静止中心以外的根部组织的细胞与来自静止中心的干细胞之间形态学差异。来自静止中心以外的根部组织的细胞系为非同质的并且显示已局部分化，而来自静止中心的干细胞系为同质的并且显示未局部分化。视觉观察时，来自静止中心以外的根部组织的细胞系为黄色，而来自静止中心的干细胞系为白色并被粘液物质围绕。即，来自静止中心的干细胞系显示为“未分化的白色组织”。粘液物质可能是粘蛋白原。粘蛋白原是根冠周围的细胞和根部的表皮细胞分泌的复合多糖，包括糖、有机酸、维生素、酶和氨基酸。因此，基于形态学差异，仅仅来自静止中心的干细胞系可被选择。0017此外，来自植物静止中心的细胞系还有如下特征在悬浮培养过程中其以。
12、单个细胞存在；其细胞核比那些来自静止中心以外的细胞系的细胞核大。00182静止中心干细胞的传代培养及放大培养0019将静止中心干细胞移入液态培养基中，在暗室中251下传代培养35周，此为第一阶段；第二阶段是将干细胞放大培养12周，然后加入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯、N苯酰甘氨酸以及无菌磁化水的混合液，再继续培养12周；0020第一阶段与第二阶段所用的液态培养基相同，都是优选N6培养基，更优选地加入2,4D，2,4D优选浓度18MG/L；0021第一阶段的培养可以在诸如烧瓶一类的小容器中进行，第二阶段的放大培养优选使用3L以上的气升式生物反应器；00223制备铁皮石斛干细胞制剂0023A、干细胞干粉0。
13、024将放大培养后得到的细胞系超滤，截留回收大分子团；往大分子团中注入乙醇溶液，超声粉碎后二次超滤；收集滤过液，再用无水乙醇冲洗超滤柱，回收全部无水乙醇与滤过液混合，真空浓缩、真空冷冻干燥、粉碎即得铁皮石斛干细胞干粉；0025所述超滤使用中空纤维超滤柱；0026所述的乙醇溶液其体积浓度是7080；0027B、干细胞提取液0028将放大培养后得到的细胞系过滤，截留回收粘胶状细胞系培养物，将其在30下预冻25小时，再放入液氮中速冻25小时，再于232下解冻1小时，重复该预冻、速冻、解冻的操作1次；将获得的细胞系黏液质粉碎，然后注入乙醇溶液真空浓缩，将浓缩物真空冷冻干燥、粉碎，溶于水后即得铁皮石斛干。
14、细胞提取液；说明书CN104195098A3/7页50029所述的过滤是使用孔径为13M的过滤器；0030所述的乙醇溶液其体积浓度是7080。0031对于得到的铁皮石斛干细胞，申请人以D半乳糖法致小鼠衰老模型，观察铁皮石斛干细胞对衰老小鼠机体抗氧化的影响，进行血清中SOD、GSHPX、TAOC含量的测定，从整体上体现衰老的现象以及铁皮石斛干细胞的抗氧化、抗衰老作用，表明铁皮石斛干细胞能增加D半乳糖法致衰老小鼠血清中SOD、GSHPX、TAOC活性，促进氧自由基的清除。0032另外，申请人建立脂溢性脱发的大鼠模型，研究铁皮石斛干细胞对大鼠血清中睾酮T、雌二醇E2、肝细胞因子水平HGF的影响，表明。
15、铁皮石斛干细胞可使紊乱的T/E2趋于正常，并升高HGF水平，以减少毛发脱落。0033本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果00341、本发明对植物干细胞的分离培养方法不会诱发环境问题，且可稳定提供来源于铁皮石斛的有用物质如抗氧化剂、抗癌物质及功能性保健品添加剂等。00352、本发明克服了铁皮石斛离体材料易褐化的问题，其干细胞系的细胞尚未分化，营养条件下细胞增量大，培养时间短，细胞活性强大。本发明具有技术工艺易操作、流程少、产出量大，所得铁皮石斛干细胞抗衰老、抗氧化、促头发生长及抗脱发活性强，可制成防治各种衰老及脱发的功能保健品、化妆品以及中药抗衰老、抗脱发等相关药品。附图说明0036图1是铁。
16、皮石斛干细胞对衰老雌性小鼠血清SOD的影响试验结果图。0037图2是铁皮石斛干细胞对衰老雌性小鼠血清GSHPX的影响试验结果图。0038图3是铁皮石斛干细胞对衰老雌性小鼠血清TAOC的影响试验结果图。0039图4是铁皮石斛干细胞对脂脱大鼠血清睾酮T的影响试验结果图。0040图5是铁皮石斛干细胞对脂脱大鼠雌二醇E2的影响试验结果图。0041图6是铁皮石斛干细胞对脂脱大鼠血清睾酮/雌二醇水平的影响试验结果图。0042图7是铁皮石斛干细胞对脂脱大鼠肝细胞生长因子HGF水平的影响试验结果图。0043注0044图13中，与模型组相比，P005，P001；0045图47中，与正常对照组相比，P005，P0。
17、01；与模型对照组相比，P005，P001。具体实施方式0046下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。0047实施例10048铁皮石斛干细胞的分离培养方法，包括以下步骤00491来自铁皮石斛静止中心的细胞系的诱导与分离0050收集铁皮石斛植株的含有静止中心的无菌根尖，去掉根冠，从切口开始截取1MM长作为外植体，将外植体放入N6诱导培养基，培养基中加入2MG/L2,4D，培养温度说明书CN104195098A4/7页6251，培养40D后，静止中心干细胞由于与其他根部组织细胞的不同，两者自然分离；00512铁皮石斛干细胞的传代培养及放大培养005221铁皮石。
18、斛干细胞的传代培养0053将步骤1中所诱导培养的干细胞用接种铲将其移入烧瓶液态培养基N6培养基内，PH值为58，在受控暗室中，用旋转摇床，251下培养，传代时间设定为30D。从而可致使培养细胞始终在对数生长期状态维持高的活力。005422铁皮石斛干细胞的放大培养0055将传代培养30D的细胞系移入3升的气升式生物反应器中继续放大培养，不间断搅拌，培养液使用烧瓶液态培养基相同的培养液，培养温度为251，培养15天后，再向生物反应器内加入蔗糖10G，甲基茉莉酮酸酯50MG，N苯酰甘氨酸50MG以及05升无菌磁化水的混合液这里蔗糖、甲基茉莉酮酸酯、N苯酰甘氨酸和无菌磁化水的用量对应每05L培养液，再。
19、继续培养15天。00563铁皮石斛干细胞干粉的制备0057将步骤2培养所得细胞系通过中空纤维超滤柱进行超滤，将截留的大分子团取出，放入玻璃容器内，注入体积浓度为75的乙醇溶液05升，放入40KHZ的超声波清洗机内，超声粉碎大分子团细胞系，然后二次超滤，然后再用95的乙醇4升冲洗超滤柱。将冲洗的全部乙醇与二次超滤滤过液混合，经另一容器内快速搅拌3小时，再进行间接加热50进行旋转吸空蒸发，浓缩至小于原液体体积五分之一时取出，再放入真空冷冻干燥机内真空冷冻干燥，30小时后，在含水量小于3以下时取出，粉碎100目，装入铝泊袋内真空封口，冷藏存放，即成为铁皮石斛干细胞干粉。00584铁皮石斛干细胞提取液。
20、的制备0059将步骤2培养所得的细胞系通过1M过滤器过滤，将培养液去掉，截留回收粘胶状细胞系培养物，置于30的冰箱内预冻25小时后，再放入液氮罐内超低温196速冻25小时，取出在室温下解冻1小时后，将预冻、速冻、解冻的操作重复一次。然后将细胞系黏液质取出，室温下保持15分钟后，高速粉碎成60目冻粉，之后放入3L75体积浓度乙醇液中间接加温，在26下以旋转式真空蒸发器浓缩，同时收集乙醇。将浓缩物放进低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥，待含水量3时取出，高速粉碎100目，溶于磁化水中，即成为铁皮石斛干细胞提取液。0060实施例20061铁皮石斛干细胞对D半乳糖致亚急性衰老小鼠的试验0062一、实验。
21、材料006311药品及试剂铁皮石斛干细胞干粉；超氧化物歧化酶SOD试剂盒，100T，南京建成生物工程研究所，批号20101009；谷胧甘肤过氧化物酶GSHPX测试盒，南京建成生物工程研究所，批号20101008；总抗氧化能力TAOC测定试剂盒，50T，南京建成生物工程研究所，批号20101013。006412实验动物SPF级KM小鼠，体质量202G，雌雄各半，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK粤20080020。0065二、实验方法006621造模取成年小鼠体重20士2G，雌雄各半。将动物随机分4组，分别为正常说明书CN104195098A5/7页7对照组、衰老模型组、阳性药组。
22、参维灵片、铁皮石斛干细胞组，每组10只。除正常对照组外，各鼠每天在颈背部皮下注射D半乳糖注射用水配制125MG/KG，连续10周，普通饲料常规喂养。各组动物在造模第10D后，同时每日灌胃相应受试药液0LML/10G，正常对照组和衰老模型组以同等剂量的蒸馏水灌胃。造模与给药期间，每周测定两次体重。006722方法取D半乳糖致亚急性衰老小鼠，给药9周后，小鼠麻醉下摘眼球取血，常规分离血清，在4下3000R/MIN离心5MIN，取上清液待测。按试剂盒说明书测定血清的超氧化物歧化酶SOD、谷肤甘肤过氧化物酶GSHPX等活性或含量、总抗氧化能力TAOC。0068三、实验结果与结论006931血清中SOD。
23、活性的测定结果见图1。模型组的血清SOD明显减少，与正常组相比，差异具有统计学意义P001。各给药组与模型组相比，均增加其SOD活性P005。实验结果说明铁皮石斛干细胞可提高小鼠血液抗氧化能力，雌性以铁皮石斛干细胞组血清SOD活性增强为主要表现。007032血清中GSHPX活性的测定结果见图2。与正常组相比，模型组的血清GSHPX有所减少。其余各给药组与模型组比较，阳性组P005、铁皮石斛干细胞组P005GSHPX均明显增加，差异具有统计学意义。007133血清中TAOC活性的测定结果见图3。模型组的血清TAOC明显减少，与正常组相比，差异具有统计学意义P005。其余各给药组与模型组比较，铁皮。
24、石斛干细胞组TAOC均明显增加，差异具有统计学意义P005。0072以上实验结果表明，铁皮石斛干细胞可提高小鼠血液总抗氧化能力TAOC，以SOD、GSHPX均明显增加为主要表现。0073实施例30074对脂溢性脱发大鼠性激素、肝细胞生长因子水平的影响试验0075一、实验材料007611药物与试剂铁皮石斛干细胞干粉；丙酸睾丸酮湖北远成集团远成药业有限公司，批号20100705；血清睾酮ELISA试剂盒，购于广州市齐云生物科技有限公司，生产批号E02T0007；雌二醇E2ELISA试剂盒，购于广州市齐云生物科技有限公司，生产批号E02E0023；肝细胞生长因子ELISA试剂盒，购于广州市齐云生物科。
25、技有限公司，生产批号E02H0208；肝素钠，上海源聚生物科技有限公司，生产批号20090124；金龙鱼花生油，益海嘉里食品营销有限公司；09氯化钠注射液，山东鲁抗辰欣药业有限公司，生产批号1004234202。007712实验动物SPF级SD大鼠，体质量20020G，雌雄各半，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK粤20080020。0078二、实验方法0079动物分组取健康SD大鼠40只，雌雄各半，适应性喂养1周后，随机分为正常对照组、脂溢性脱发模型组、101育发剂组及铁皮石斛干细胞组共4组，每组8只。0080给药方法实验前每只大鼠选取背部9CM7CM面积的皮毛，用3苦味酸溶液。
26、染成黄色以确定脱毛区。除正常对照组外，其余各组动物颈后皮下注射5MG/KG剂量的丙酸睾丸酮，1次/D，连续60天，后30天各组用药量减半，造成脂脱模型。正常对照组动物颈后皮说明书CN104195098A6/7页8下注射等体积生理盐水。造模的同时给药，将铁皮石斛干细胞提取物均匀涂抹于所选脱毛实验观察区内，给药剂量如表1所示，各组均每日给药1次。共给药60天。0081表1各组给药剂量表00820083检测指标0084血清性激素水平的检测末次给药后禁食12H，麻醉动物，进行腹主动脉取血，用ELISA法检测血清中的睾酮T、雌二醇E2水平，并计算T/E2值。0085肝细胞生长因子HGF的检测腹腔取血后，。
27、切下上述实验大鼠背部脱发区皮肤，加PBS液进行匀浆，离心后，取上清液，用ELISA法定量检测肝细胞生长因子的水平。0086三、实验结果008731毛发外观模型组连续皮下注射丙酸睾丸酮3W后，大鼠背部毛色灰暗，失去光泽，于第4周后逐渐出现毛发脱落，残存毛发变得纤细、质脆，证明雄性激素性脱发模型成功建立。008832铁皮石斛干细胞对大鼠血清睾酮T浓度的影响结果如图4所示，与正常对照组比较，模型组血清睾酮浓度显著升高P001，提示造模成功；101育发剂组的血清睾酮浓度亦显著升高P005；铁皮石斛干细胞组的睾酮浓度与正常对照组比较无显著性差异P005。与模型组比较，101育发剂组的血清睾酮浓度无显著性。
28、差异P005，铁皮石斛干细胞组的睾酮浓度显著降低P005。结果显示，铁皮石斛干细胞可降低脂溢性脱发大鼠的血清睾酮浓度，而101育发剂对血清睾酮浓度无影响。008933铁皮石斛干细胞对大鼠血清雌二醇E2浓度的影响结果如图5所示，模型组、铁皮石斛干细胞组的血清E2浓度与正常对照组无显著性差异P005，而101育发剂组血清E2浓度显著升高P005。结果提示101育发剂可显著升高脂溢性脱发大鼠血清E2浓度，铁皮石斛干细胞对血清E2浓度无影响。009034铁皮石斛干细胞对大鼠血清T/E2的影响结果如图6所示，与正常对照组比较模型组的血清T/E2值显著升高P005，提示造模成功；101育发剂组、铁皮石斛干。
29、细胞组的T/E2值与正常对照组无显著性差异P005；与模型组比较，101育发剂组、铁皮石斛干细胞组的T/E2值显著降低P001。结果显示，101育发剂和铁皮石斛干细胞均可显著降低脂溢性脱发大鼠T/E2值而减少脱发。009135铁皮石斛干细胞对大鼠毛囊肝细胞生长因子HGF的影响结果如图7所示，与正常对照组比较，模型组的大鼠毛囊HGF浓度显著降低P001；与模型组比较，101说明书CN104195098A7/7页9育发剂能显著升高脂脱大鼠的毛囊HGF浓度，与正常对照组无显著性差异P005；与模型组比较，铁皮石斛干细胞组大鼠毛囊HGF浓度显著升高P005。结果显示，101育发液和铁皮石斛干细胞均可显。
30、著升高脂脱大鼠毛囊HGF浓度，101育发液药效略优于铁皮石斛干细胞。0092本实验脂脱模型组大鼠HGF水平降低，铁皮石斛干细胞组的HGF水平升高，表明铁皮石斛干细胞促毛发生长的机制之一可能是通过促进毛乳头HGF的分泌而促进毛囊生长。0093上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104195098A1/4页10图1图2说明书附图CN104195098A102/4页11图3图4说明书附图CN104195098A113/4页12图5图6说明书附图CN104195098A124/4页13图7说明书附图CN104195098A13。