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1、10申请公布号CN104054426A43申请公布日20140924CN104054426A21申请号201410116389622申请日20140326CGMCCNO852720131209A01C1/00200601A01G7/00200601A01G7/06200601C12N1/20200601C12R1/0120060171申请人上海辰山植物园地址201602上海市松江区辰花路3888号72发明人韩继刚王云山胡永红74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅任凤华54发明名称利用促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌使牡丹种子萌发和促进牡丹幼苗生长的方法57摘要本发明公开。
2、了利用促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌使牡丹种子萌发和促进牡丹幼苗生长的方法。本发明的使牡丹种子生根和萌发的方法，包括将休眠的牡丹种子进行浸种处理得到浸种后的牡丹种子，用多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101处理所述浸种后的牡丹种子13小时，得到菌剂处理的牡丹种子，将所述菌剂处理的牡丹种子进行培养得到生根和发芽的幼苗；所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNO8527。83生物保藏信息51INTCL权利要求书2页说明书13页序列表2页附图1页19中华人民共。
3、和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书13页序列表2页附图1页10申请公布号CN104054426ACN104054426A1/2页21使牡丹种子生根的方法，包括将休眠的牡丹种子进行浸种处理得到浸种后的牡丹种子，用多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101处理所述浸种后的牡丹种子13小时，得到菌剂处理的牡丹种子，将所述菌剂处理的牡丹种子进行生根培养得到牡丹生根种子；所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNO8527。2根据权利要求1所述的方法。
4、，其特征在于用多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101处理所述浸种后的牡丹种子13小时为将所述浸种后的牡丹种子置于所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的菌悬液中浸泡13小时。3根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的菌悬液中所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的含量为108CFU/ML109CFU/ML。4根据权利要求13中任一所述的方法，其特征在于所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPO。
5、LYMYXA）CSM1101的菌悬液按照包括如下步骤的方法制备将促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂悬浮于无菌水中得到所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的菌悬液，所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的菌悬液中所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的含量为108CFU/ML109CFU/ML；所述促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的制备方法包括1将玉米秸秆在180200和1020MPA条件下进行水热处理，得到经过预处理的玉米秸秆；2将所述经过预处理的玉米秸秆粉碎后，用纤维素酶进行酶。
6、解，分别收集酶解液和酶解残渣；（3）用所述酶解液、NH42SO4、MGSO4、CACO3、玉米浆和水配制发酵培养基，每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为2050G；4向所述发酵培养基中接入促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌进行发酵，发酵结束后收集发酵液，将所述发酵液和所述酶解残渣混合，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂；所述促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌为多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNO8527。5根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述水热处理时。
7、间为1020MIN。6根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述2为将所述经过预处理的玉米秸秆粉碎后，按以干重计每克秸秆加入1015FPU的比例加入纤维素酶，在5580、PH为4850的条件下在水中酶解2448H，得到玉米秸秆酶解物，将所述玉米秸秆酶解物进行离心，分别收集上清液和沉淀，所述上清液即为所述酶解液，所述沉淀即为所述酶解残渣。7根据权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于每升所述发酵培养基中，NH42SO4的含量为10G，MGSO4的含量为04G、CACO3的含量为6G、玉米浆的含量为2G；和/或，所述发酵液和所述酶解残渣按照11的质量比进行混合。8根据权利要求4或5或6或7所述的。
8、方法，其特征在于所述4在30培养1830小时进行发酵。权利要求书CN104054426A2/2页39使牡丹种子发芽的方法，包括将权利要求18中任一所述的使牡丹种子生根的方法得到的牡丹生根种子在35贮藏721天进行栽植，在1025培养，得到发芽的牡丹种子。10促进牡丹幼苗生长的方法，包括将权利要求18中任一所述的使牡丹种子生根的方法得到的牡丹生根种子在35贮藏721天进行后进行栽植，在1025培养，得到牡丹幼苗。权利要求书CN104054426A1/13页4利用促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌使牡丹种子萌发和促进牡丹幼苗生长的方法技术领域0001本发明涉及利用促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌使牡丹种。
9、子萌发和促进牡丹幼苗生长的方法。背景技术0002植物根际是指生物、化学和物理特性受到影响的紧密环绕植物根的区域，其范围内的微生物多而活跃，构成了根际特有的微生物区系。根际微生物区其中主要以细菌为主，其中对植物有益的菌群称为植物促生根际菌（PLANTGROWTHPROMOTINGRHIZOBACTERIA，PGPR）。PGPR旺盛的代谢作用，如生物固氮、解磷作用、产生铁载体等，可加强土壤中有机物质的分解和植物营养元素的矿化，同时其分泌的多种植物生长激素可促进植物的根系发达发育、从而加强对营养物质的吸收，促进植物的生长发育。0003牡丹归芍药科（PAEONIACEAE）、芍药属（PAEONIA），。
10、一直以来都是中国最重要的观赏植物和药用植物之一。近年来，牡丹的油用价值日渐凸显，牡丹已经成为兼具观赏价值、药用价值和油用价值的重要经济植物。对于观赏牡丹来讲，一个突出的问题是，由于不同地区气候环境和土壤性质的差异造成的土壤微生态活性降低，是引种地区栽培牡丹生长状况不良、观赏性状下降的重要原因之一。而对于油用牡丹，如何科学施肥并显著提高牡丹籽的产量则是非常迫切的问题。在牡丹的栽培过程中，还面临着一些真菌病害的威胁，主要有灰霉病（BOTRYTISPAEONIAE）、红斑病（CLADOSPORIUMAEONIAE）和褐斑病（CERCOSPORAPAEONIAE）等。此外，牡丹种子具有休眠特性，牡丹种。
11、子成熟当年秋播后，胚根逐步发育成根，但是胚轴不伸长，处于休眠状态，必须经过一定的低温期（约6090天）和一定的低温值（约010）以后，上胚轴才能解除休眠而发芽出土。如何促使牡丹种子尽早萌发，并且得到较高的发芽率是改进牡丹播种育苗技术的关键之一。0004因此，研制促进牡丹生长并拮抗多种病原菌的微生物菌剂具有显著和迫切的现实意义。目前大多数菌剂的发酵都采用淀粉质原料，但我国耕地资源紧张，粮食生产压力巨大，难以支撑庞大发酵工业的可持续发展。因此，需要寻找更丰富的可再生资源作为原料用于菌剂的生产。发明内容0005本发明所要解决的一个技术问题是提供一种利用促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌提高牡丹种子的生根。
12、率、缩短牡丹种子生根时间、提高主根长度40MM的种子百分率和增加牡丹种子主根长度的使牡丹种子生根（使牡丹种子胚根萌发）的方法。0006本发明所提供的使牡丹种子生根的方法，包括将休眠的牡丹种子进行浸种处理得到浸种后的牡丹种子，用多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101处理所述浸种后的牡丹种子13小时（如1小时），得到菌剂处理的牡丹种子，将所述菌剂处理的牡丹种子进行生根培养得到牡丹生根种子；所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）说明书CN104054426A2/13页5CSM1101在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为。
13、CGMCCNO8527。0007上述使牡丹种子生根的方法中，所述生根培养为将所述菌剂处理的牡丹种子与层积基质混合在1025（如昼2025,夜1015）放置。0008上述使牡丹种子生根的方法中，所述层积基质可为珍珠岩或河沙等。0009上述使牡丹种子生根的方法中，用多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101处理所述浸种后的牡丹种子13小时为将所述浸种后的牡丹种子置于所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的菌悬液中浸泡13小时（如1小时）。0010上述使牡丹种子生根的方法中，所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLY。
14、MYXA）CSM1101的菌悬液中所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的含量为108CFU/ML109CFU/ML（如109CFU/ML）。0011上述使牡丹种子生根的方法中，所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的菌悬液按照包括如下步骤的方法制备将促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂悬浮于无菌水中得到所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的菌悬液，所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的菌悬液中所述多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLU。
15、SPOLYMYXA）CSM1101的含量为108CFU/ML109CFU/ML（如109CFU/ML）；0012所述促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的制备方法包括00131将玉米秸秆在180200和1020MPA条件下进行水热处理，得到经过预处理的玉米秸秆；00142将所述经过预处理的玉米秸秆粉碎后，用纤维素酶进行酶解，分别收集酶解液和酶解残渣；0015（3）用所述酶解液、NH42SO4、MGSO4、CACO3、玉米浆和水配制发酵培养基，每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为2050G；00164向所述发酵培养基中接入促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌进行发酵，发酵。
16、结束后收集发酵液，将所述发酵液和所述酶解残渣混合，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂；所述促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌为多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNO8527。0017上述使牡丹种子生根的方法中，所述（1）中，所述水热处理时间可为1020MIN（如10MIN或20MIN）。0018上述使牡丹种子生根的方法中，所述2可为将所述经过预处理的玉米秸秆粉碎后，按以干重计每克秸秆加入1015FPU（纤维素酶活单位）（如15FPU）的比例加入纤维素酶，在5580（如55）、PH为4850。
17、的条件下在水中酶解2448H（如48H），得到玉米秸秆酶解物，将所述玉米秸秆酶解物进行离心，分别收集上清液和沉淀，所述上清液即为所述酶解液，所述沉淀即为所述酶解残渣。0019上述使牡丹种子生根的方法中，每升所述发酵培养基中，NH42SO4的含量为10G，MGSO4的含量为04G、CACO3的含量为6G、玉米浆的含量为2G。所述（4）中，所述发酵液和所述酶解残渣可按照11的质量比进行混合。所述（2）中，所述粉碎是将所述经过预处理的玉米秸秆粉碎至50100目。0020上述使牡丹种子生根的方法中，所述4在30培养1830小时（如2430小时）说明书CN104054426A3/13页6进行发酵。在本发。
18、明的一个实施方式中，在所述发酵培养基中培养14小时时补加所述酶解液，使发酵培养基中的葡萄糖含量为20G/L，继续培养16小时结束发酵；在本发明的另一个实施方式中，在所述发酵培养基中培养24小时结束发酵。0021本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种利用促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌缩短发芽时间、提高发芽率的使牡丹种子发芽（使牡丹种子胚芽萌发）的方法。0022本发明所提供的使牡丹种子发芽（使牡丹种子胚芽萌发）的方法，包括将上述任一种使牡丹种子生根的方法得到的牡丹生根种子在35贮藏721天（如21天、7天或14天）进行栽植，在1025培养（如昼2025,夜1015），得到萌芽的牡丹种子。0023。
19、上述使牡丹种子发芽（使牡丹种子胚芽萌发）的方法中，所述牡丹生根种子的主根长度40MM。0024本发明所要解决的在一个技术问题是提供一种利用促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌增加牡丹苗高和生物量的促进牡丹幼苗生长的方法。0025本发明所提供的促进牡丹幼苗生长的方法，包括将上述任一种使牡丹种子生根的方法得到的牡丹生根种子在35贮藏721天（如21天、7天或14天）进行栽植，在1025培养（如昼2025,夜1015），得到牡丹幼苗。0026上述促进牡丹幼苗生长的方法中，所述牡丹生根种子的主根长度40MM。0027上文中，所述牡丹可为凤丹（PAEONIAOSTII）。0028实验证明，以多粘类芽孢杆菌（P。
20、AENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101CGMCCNO8527为活性成分的促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂显著地促进了牡丹种子的生根（胚根萌发）和发芽（胚芽萌发）和牡丹幼苗的生长菌剂组层积处理的生根时间比对照组层积处理提前了10天；菌剂组层积处理的生根率达到950，比对照组层积处理的生根率提高了338；菌剂组层积处理的主根长度为690MM，是对照组层积处理的168倍；菌剂组层积处理的主根长度40MM的种子百分率达到9005，是对照组层积处理的13倍；菌剂组层积处理的发芽时间比对照组层积处理缩短了10天；菌剂组层积处理的发芽率达到990，是对照组层积处理的12倍；菌剂组层积处理的苗。
21、高是对照组层积处理的177倍，菌剂组层积处理的干重是对照组层积处理的227倍。0029保藏说明0030菌种名称多粘类芽孢杆菌0031拉丁名PAENIBACILLUSPOLYMYXA0032菌株编号CSM11010033保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心0034保藏机构简称CGMCC0035地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号0036保藏日期2013年12月09日0037保藏中心登记入册编号CGMCCNO8527附图说明0038图1为菌剂组层积处理和对照组层积处理部分种子生根培养60天的照片。0039A为对照组层积处理，B为菌剂组层积处理。说明书CN104054426A4/13页7。
22、具体实施方式0040下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。0041下述实施例中所用的牡丹葡萄孢菌（BOTRYTISPAEONIAE）ACCC36053和牡丹枝孢霉（CLADOSPORIUMPAEONIAE）ACCC36063于本申请的申请日前均收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心（简称ACCC，地址北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081），这两个菌。
23、株的收藏日均为2006年8月31日，自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。0042下述实施例中所用的牡丹褐斑病病原菌为芍药杂色尾孢霉菌（CERCOSPORAVARRICOLORWINTER）（张建国，2001牡丹的主要病害及防治中国花卉园艺，233234）公众可从上海辰山植物园获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。0043下述实施例中的牡丹为凤丹（PAEONIAOSTII）（JIGANGHAN,YAOSONG,ZHIGANGLIU,ETC2011CULTURABLEBACTERIALCOMMUNITYANALYSISINTHE。
24、ROOTDOMAINSOFTWOVARIETIESOFTREEPEONYPAEONIAOSTIIFEMSMICROBIOLLETT,3221524）公众可从上海辰山植物园获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。0044下述实施例中所用的培养基如下0045半固体无氮培养基蔗糖，10G；苹果酸，5G；KH2PO4H2O，04G；K2HPO4H2O，01G；MGSO47H2O，02G；NACL，01G；CACL22H2O，002G；FECL3，001G；NA2MOO42H2O，002G；琼脂，3G；用蒸馏水定容至1000ML、PH7072。121蒸气灭菌20MIN。004。
25、6无氮培养基蔗糖，10G；苹果酸，5G；KH2PO4H2O，04G；K2HPO4H2O，01G；MGSO47H2O，02G；NACL，01G；CACL22H2O，002G；FECL3，001G；NA2MOO42H2O，002G；琼脂18G；用蒸馏水定容至1000ML、PH7072。121蒸气灭菌20MIN。0047NB培养基葡萄糖50G，蛋白胨50G，牛肉膏30G，用蒸馏水定容至1000ML，PH7072，121灭菌20MIN。0048NA培养基葡萄糖50G，蛋白胨50G，牛肉膏30G，琼脂18G，用蒸馏水定容至1000ML，PH7072，121灭菌20MIN。0049PDA培养基葡萄糖20G。
26、，琼脂18G，马铃薯200G，加水1000ML煮沸30MIN滤取汁液，加水补足1000ML，PH6070，121灭菌20MIN。0050下述实施例中的纤维素酶购于生工生物工程（上海）股份有限公司。下述实施例中的纤维素酶酶活力单位（FPU）定义为1G纤维素酶粉在55下60MIN内水解滤纸所得葡萄糖MOL数。纤维素酶酶活力的具体测定方法如下取纤维素酶1000G，加100MLPH485的005MOL/L醋酸醋酸钠缓冲液充分溶解，得到纤维素酶液，将纤维素酶液稀释后，吸取05ML，加入005MOL/L醋酸醋酸钠缓冲液15ML，16CM新华一号滤纸条一张，55下水解60MIN。水解完毕后采用如下的DNS法。
27、测定体系中的葡萄糖含量,并计算纤维素酶的酶说明书CN104054426A5/13页8活力。0051下述实施中，发酵培养基中葡萄糖含量的测定方法采用DNS法，具体如下00521DNS试剂的配制200G酒石酸钾钠，溶于一定量的水中，加热溶解，添加100G3,5二硝基水杨酸，10GNAOH溶解后加入2G苯酚，05G无水亚硫酸钠，全部加热溶解后，冷却至室温，定容至1000ML。00532葡萄糖标准曲线的绘制准确称取1000MG分析纯的无水葡萄糖（预先在105干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ML容量瓶中，再定容到刻度、摇匀，浓度为1MG/ML。取10支试管，分别加入葡萄糖标准溶液02M。
28、L、04ML、06ML、08ML、10ML、12ML、16ML后，用蒸馏水稀释至2ML，再加入25MLDNS试剂混合均匀，在沸水中加热5MIN。取出后即用水冷却至室温，定容到25ML，摇匀。30MIN后于520NM下测OD值。以OD520值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线，形式为YAXB。00543发酵液中葡萄糖浓度的测定取稀释到一定浓度的发酵上清液4000R/MIN，离心20MIN，加入25MLDNS试剂混合均匀，在沸水中加热5MIN。取出用水冷却到室温，定容至25ML，摇匀，静置30MIN后于520NM出测OD520值。根据样品的OD520值与标准曲线计算发酵液中的葡萄糖含量。00。
29、55实施例1、多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的分离与鉴定0056一、多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的分离0057从安徽省铜陵市顺安镇金山村丹皮种植地的牡丹（PAEONIAOSTII，凤丹）（株龄6年）植株的根际采集土样，将土样放入装有无菌水和灭菌玻璃珠的小三角瓶中，200RPM/MIN振荡20MIN；取振荡后的悬液做系列梯度稀释，103、104稀释度悬液各吸取200L均匀涂布无氮培养基，置30培养4D后，挑取单菌落，在无氮培养基固体培养基平板上用平板划线法进行菌种纯化。将分离纯化所得的其中一个菌株命名为牡丹。
30、根际固氮菌CSM1101。0058二、牡丹根际固氮菌CSM1101的鉴定00591形态特征观察和生理生化特性测定0060形态学和生理生化特性鉴定参考“伯杰氏系统细菌学手册”（GARRITY,2001）和“一般细菌学常用鉴定方法”（东秀珠等，2001），按照常规方法进行。0061牡丹根际固氮菌CSM1101的形态学特征如下革兰氏阳性，运动，菌体呈杆状，直径为0608M，长为2076M。芽孢柱状，16351215M，中生到次端生。孢子囊明显膨大成纺锤型或棒状。其菌落边缘不整齐裂片状，半透明到不透明。后其菌落粗糙，浅白色，中间略突起。菌落粘着在培养基表面。0062牡丹根际固氮菌CSM1101的生理生。
31、化特征测定结果如下0063水解淀粉阴性；0064水解酪蛋白阴性；0065水解明胶阴性；0066利用柠檬酸盐阴性；0067酪氨酸分解阴性；0068苯丙氨酸脱氨酶实验阴性；0069卵黄卵磷脂酶实验阴性；说明书CN104054426A6/13页90070吲哚产生阴性；0071马尿酸盐实验阴性；0072接触酶实验阳性；0073硝酸盐还原实验阳性；0074二羟丙酮产生阳性；0075抗溶菌酶实验阳性；0076分解葡萄糖产酸产气阳性；0077分解阿拉伯糖产酸产气阳性；0078分解木糖产酸产气阳性；0079分解甘露醇产酸产气阳性；0080耐盐性试验7NACL生长；0081在PH68的营养肉汤培养基（NB）和P。
32、H57的沙氏葡萄糖肉汤培养基中均可生长。在MRVP肉汤上产生乙酰甲基甲醇，PH60。0082216SRDNA的序列扩增和分析0083采用细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）提取基因组DNA作为PCR反应的模板。PCR引物（PF5CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3和PR5CGGGATCCAAGGAGGTGATCCAGCC3）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用PERKINELMERGENEAMPPCRSYSTEM9700PCR扩增细菌的16SRDNA。反应体系为10PCRBUFFER，25UL；DNTP（25MM）（TAKARA），2UL，PF（10P。
33、MOL/UL）01UL，PR（10PMOL/UL）01UL，TAQ聚合酶（5U/UL）（TAKARA），0125UL，基因组DNA05UL，加DDH2O至25UL。PCR反应条件为，94预变性5MIN，94变性1MIN，52复性1MIN，72延伸1MIN，72最后延伸10MIN，30个循环。PCR扩增产物由生工生物工程（上海）股份有限公司纯化并测序。将菌株的16SRDNA序列在GENBANK核酸序列数据库进行序列比较分析。0084结果表明测得的牡丹根际固氮菌CSM110116SRDNA序列全长1496BP，如SEQIDNO1。在GENBANK进行BLASTN分析的结果表明，其序列与PAENIB。
34、ACILLUSPOLYMYXASTRAINM1（EF656457）的相似性达到99。0085根据牡丹根际固氮菌CSM1101的形态特征、生理生化特征和16SRDNA序列同源性分析结果，将牡丹根际固氮菌CSM1101鉴定为多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）。多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101已于2013年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCCNO8527。0086实施例2、多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）。
35、CSM1101的生物活性0087一、多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的固氮活性测定固氮活性测定采用乙炔还原法。在15MM15MM螺口试管中加入25ML半固体无氮培养基，接种多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101CGMCCNO8527后，塞好棉塞，30培养24H；再换无菌胶塞密封，抽出10气体，注入相同体积的乙炔,30培养24H。抽取气样在VARIANVISTA6000型气相色谱仪上测定ARA（ACETYIENEREDUCTIONACTIVITY，乙炔还原活性）。实验设三个重复，取其平均值并计算方差不大于5。0088测。
36、定结果表明，CSM1101在无氮培养基中表现出了较高的固氮活性。说明书CN104054426A7/13页10其乙炔还原活性为126C2H4NMOLML1H1。0089二、多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的抑菌活性0090以牡丹葡萄孢菌（BOTRYTISPAEONIAE）ACCC36053、牡丹枝孢霉（CLADOSPORIUMPAEONIAE）ACCC36063、芍药杂色尾孢霉菌（CERCOSPORAVARRICOLORWINTER）中的任一菌株单独为病原菌，均采用平板对峙法测定抑菌率，具体方法如下病原菌菌株在PDA斜面上活化后，加入无菌水制成病原菌悬浮。
37、液，将病原菌悬浮液加到融化后冷却到4550的PDA培养基中混匀倒平板，在30培养4天，得到病原菌平板，用直径为6MM的打孔器打取病原菌菌饼。0091按照如下方法测定多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101对每种病原菌的抑菌率实验重复三次，每次重复病原菌设两个处理，即CSM1101组和对照组。将20个无菌PDA平板均分为两组，即CSM1101组和对照组，每组10个平板，进行以下接种处理在CSM1101组的无菌PDA平板中心接种直径为6MM的病原菌菌饼，将多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101CGMCCNO8527斜面活化菌种接。
38、种于距病原菌菌饼3CM处。同时，在对照组的无菌PDA平板中心只接种直径为6MM的病原菌菌饼。将经过上述接种处理的CSM1101组平板和对照组平板在30培养57天，待对照组平板（仅接种病原菌）长满整个培养皿时，测量对照组的病原菌菌落直径和CSM1101组的病原菌菌落直径，计算抑菌率。0092抑菌率（）（对照组的病原菌菌落直径CSM1101组的病原菌菌落直径）/对照组的病原菌菌落直径100。0093结果如表1所示，表明多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101CGMCCNO8527对牡丹葡萄孢菌（BOTRYTISPAEONIAE）ACCC36053、牡丹枝孢霉（CL。
39、ADOSPORIUMPAEONIAE）ACCC36063和芍药杂色尾孢霉菌（CERCOSPORAVARRICOLORWINTER）均具有较强的平板抑菌活性，其抑菌率分别达到了572、657和883。0094表1多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101CGMCCNO8527对病原菌的抑菌率00950096下述实施例36采用的原料均是相同的，只是工艺条件有差异，如表2所示。0097表2、实施例36的工艺条件0098说明书CN104054426A108/13页110099实施例3、利用玉米秸秆酶解液生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂A01001、发酵培养基的制备01。
40、01取玉米秸秆8000G（以干重计），切成小段，投入水热反应釜，在180和10MPA的条件下进行水热处理20MIN后自然晾干，得到经过预处理的玉米秸秆；将该经过预处理的玉米秸秆粉碎至100目后，按照以干重计每克秸秆加入15FPU的比例加入纤维素酶，按照以干重计每200克干秸秆加入1L蒸馏水的比例加入蒸馏水，于55，100RPM（旋转半径20MM），PH48的条件下水解48H后冷却离心，分别收集上清液和沉淀，该上清液即为酶解液，该沉淀即为酶解残渣。测定酶解液中的葡萄糖含量，结果表明酶解液中的葡萄糖含量为55G/L。用酶解液、NH42SO4、MGSO4、CACO3、玉米浆和水配制发酵培养基（即发酵。
41、培养基由酶解液、NH42SO4、MGSO4、CACO3、玉米浆和水组成），每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为20G；每升所述发酵培养基中，NH42SO4的含量为10G、MGSO4的含量为04G、CACO3的含量为6G、玉米浆的含量为2G。01022、发酵培养010321种子培养0104将多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101CGMCCNO8527在NA培养基斜面上活化培养后取23环接种到500ML三角瓶内的50MLNB培养基中。28，26MM振幅，200R/MIN振荡培养24H作为种子液，准备用于发酵罐发酵培养。0105。
42、22发酵培养说明书CN104054426A119/13页120106取50L步骤1的发酵培养基置于100L全自动发酵罐中，于121灭菌20MIN，冷却后，将21所得的种子液接入发酵培养基，接种量（VV）为10。培养温度为30，通过调节通气量和搅拌转速维持发酵培养基中的溶氧量为30，发酵过程中自动调节PH为6872。培养14小时时补加步骤1的酶解液，使发酵培养基中的葡萄糖含量为15G/L，继续培养16小时，结束发酵。总共发酵30小时。取发酵液，测定发酵液中的菌体含量，实验重复三次，结果取平均值。结果表明发酵液中实施例1的多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的。
43、含量为2581010CFU/ML，芽孢含量为85。将该发酵液和步骤1中的酶解残渣等质量混合，喷雾干燥后（60）制粒，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂A。0107实施例4、利用玉米秸秆酶解液生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂B01081、发酵培养基的制备0109取玉米秸秆8000G（以干重计），切成小段，投入水热反应釜，在180和10MPA的条件下进行水热处理20MIN后自然晾干，得到经过预处理的玉米秸秆；将该经过预处理的玉米秸秆粉碎至100目后，按照以干重计每克秸秆加入15FPU的比例加入纤维素酶，按照以干重计每200克干秸秆加入1L蒸馏水的比例加入蒸馏水，于55，100RPM（旋转半径20。
44、MM），PH48的条件下水解48H后冷却离心，分别收集上清液和沉淀，该上清液即为酶解液，该沉淀即为酶解残渣。测定酶解液中的葡萄糖含量，结果表明酶解液中的葡萄糖含量为55G/L。用酶解液、NH42SO4、MGSO4、CACO3、玉米浆和水配制发酵培养基（即发酵培养基由酶解液、NH42SO4、MGSO4、CACO3、玉米浆和水组成），每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为20G；每升所述发酵培养基中，NH42SO4的含量为10G、MGSO4的含量为04G、CACO3的含量为6G、玉米浆的含量为2G。01102、发酵培养011121种子培养0112将多粘类芽孢杆菌（。
45、PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101CGMCCNO8527在NA培养基斜面上活化培养后取23环接种到500ML三角瓶内的50MLNB培养基中。28，26MM振幅，200R/MIN振荡培养24H作为种子液，准备用于发酵罐发酵培养。011322发酵培养0114取50L步骤1的发酵培养基置于100L全自动发酵罐中，于121灭菌20MIN，冷却后，将21所得的种子液接入发酵培养基，接种量（VV）为10。培养温度为30，通过调节通气量和搅拌转速维持发酵培养基中的溶氧量为30，发酵过程中自动调节PH为6872。培养24小时，结束发酵。取发酵液，测定发酵液中的菌体含量，实验重复三次，结。
46、果取平均值。结果表明发酵液中实施例1的多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的含量为186108CFU/ML，芽孢含量为85。将发酵液和步骤1中的酶解残渣等质量混合，喷雾干燥后（60）制粒，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂B。0115实施例5、利用玉米秸秆酶解液生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂C01161、发酵培养基的制备0117取玉米秸秆8000G（以干重计），切成小段，投入水热反应釜，在200和20MPA的条件下进行水热处理20MIN后自然晾干，得到经过预处理的玉米秸秆；将该经过预处理的玉米秸秆粉碎至100目后，按照以干重计每克秸秆加入15FPU的比。
47、例加入纤维素酶，按照以说明书CN104054426A1210/13页13干重计每200克干秸秆加入1L蒸馏水的比例加入蒸馏水，于55，100RPM（旋转半径20MM），PH48的条件下水解48H后冷却离心，分别收集上清液和沉淀，该上清液即为酶解液，该沉淀即为酶解残渣。测定酶解液中的葡萄糖含量，结果表明酶解液中的葡萄糖含量为60G/L。用酶解液、NH42SO4、MGSO4、CACO3、玉米浆和水配制发酵培养基（即发酵培养基由酶解液、NH42SO4、MGSO4、CACO3、玉米浆和水组成），每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为20G；每升所述发酵培养基中，NH4。
48、2SO4的含量为10G、MGSO4的含量为04G、CACO3的含量为6G、玉米浆的含量为2G。01182、发酵培养011921种子培养0120将多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101CGMCCNO8527在NA培养基斜面上活化培养后取23环接种到500ML三角瓶内的50MLNB培养基中。28，26MM振幅，200R/MIN振荡培养24H作为种子液，准备用于发酵罐发酵培养。012122发酵培养0122取50L步骤1的发酵培养基置于100L全自动发酵罐中，于121灭菌20MIN，冷却后，将21所得的种子液接入发酵培养基，接种量（VV）为10。培养温度为30，通过。
49、调节通气量和搅拌转速维持发酵培养基中的溶氧量为30，发酵过程中自动调节PH为6872。培养24小时，结束发酵。取发酵液，测定发酵液中的菌体含量，实验重复三次，结果取平均值。结果表明发酵液中实施例1的多粘类芽孢杆菌（PAENIBACILLUSPOLYMYXA）CSM1101的含量为278109CFU/ML，芽孢含量为85。将发酵液和步骤1中的酶解残渣等质量混合，喷雾干燥后（60）制粒，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂C。0123实施例6、利用玉米秸秆酶解液生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂D01241、发酵培养基的制备0125取玉米秸秆8000G（以干重计），切成小段，投入水热反应釜，在200和20MPA的条件下进行水热处理10MIN后自然晾干，得到经过预处理的玉米秸秆；将该经过预处理的玉米秸秆粉碎至100目后，按照以干重计每克秸秆加入15FPU的比例加入纤维素酶，按照以干重计每200克干秸秆加入1L蒸馏水的比例加入蒸馏水，于55，100RPM（旋转半径20MM），PH48的条件下水解48H后冷却离心，分别收集上清液和沉淀，该上清液即为酶解液，该沉淀即为酶解残渣。测定酶解液中的葡萄糖含量，结果表明酶解液中。