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1、10申请公布号CN104059907A43申请公布日20140924CN104059907A21申请号201410049893922申请日2014021361/778,78820130313USC12N15/11200601C12N15/10200601C12Q1/6820060171申请人安捷伦科技有限公司地址美国加利福尼亚州72发明人J拉基S陈M斯里尼瓦桑74专利代理机构北京市嘉元知识产权代理事务所特殊普通合伙11484代理人陈静54发明名称含有树状分子染料的寡核苷酸探针及其制备方法和应用57摘要本发明提供了新型寡核苷酸探针，其具有树状分子染料，可用于检测和分析生物样品。还提供了其组合物及。
2、方法。该含有树状分子的寡核苷酸探针可用于在核酸例如DNA和RNA的原位杂交FISH中进行高灵敏度荧光成像。30优先权数据51INTCL权利要求书2页说明书16页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书16页附图1页10申请公布号CN104059907ACN104059907A1/2页21一种寡核苷酸探针，包括能够与感兴趣的靶核酸杂交的核酸序列；和共价联接于该寡核苷酸的引物，其中该引物共价联接于包含两个或更多个荧光部分的树状分子基团。2权利要求1的寡核苷酸探针，其中所述树状分子基团共价联接于所述引物的5端。3权利要求12中任一项的寡核苷酸探针，其中所述一个或多。
3、个荧光部分是选自下组的荧光染料CY2、CY3、CY35、CY5、CY55、CY7、IR染料、DYOMICS染料、OREGONGREEN488、PACIFICBLUE、罗丹明绿和ALEXA染料。4权利要求13中任一项的寡核苷酸探针，其中所述树状分子基团具有如下的结构式其中L包含选自下组的反应性基团炔、叠氮化物、巯基、烯、异腈和四嗪；并且I是约06的整数；并且Q是选自下组的荧光部分CY2,CY3,CY35,CY5,CY55,CY7,IR染料,DYOMICS染料,OREGONGREEN488,PACIFICBLUE,罗丹明绿,和ALEXA染料。5权利要求14中任一项的寡核苷酸，其中所述树状分子基团是。
4、通过点击反应与所述引物共价连接的，并且其中该点击反应是在所述引物上存在的炔部分与所述树状分子基团中存在的叠氮部分之间发生的，或者该点击反应是在所述引物上存在的叠氮部分与树状分子基团中存在的炔部分之间发生的。6一种生成寡核苷酸探针的方法，包括生成寡核苷酸文库；提供多个引物，其中每一个引物均包含炔部分；形成扩增子文库，其中每一个扩增子均包含所述寡核苷酸文库的成员和来自所述多个引物中的引物；提供包含两个或更多个荧光部分且包含叠氮部分的树状分子基团；和权利要求书CN104059907A2/2页3通过使所述炔部分与所述叠氮部分反应而使所述扩增子与所述树状分子基团反应，从而生成寡核苷酸探针文库。7权利要求。
5、6的方法，其中该树状分子基团共价联接于所述多个引物中每一个的5端，并且其中所述一个或多个荧光部分是选自下组的荧光染料CY2,CY3,CY35,CY5,CY55,CY7,IR染料,DYOMICS染料,OREGONGREEN488,PACIFICBLUE,罗丹明绿,和ALEXA染料，并且其中所述树状分子基团包含三个或更多个荧光部分。8权利要求67中任一项的方法，其中所述树状分子基团具有如下的结构式其中L包含选自下组的反应性基团炔、叠氮化物、巯基、烯、异腈和四嗪；并且I是约06的整数；并且Q是选自下组的荧光部分CY2、CY3、CY35、CY5、CY55、CY7、IR染料、DYOMICS染料、OREG。
6、ONGREEN488、PACIFICBLUE、罗丹明绿、和ALEXA染料。9权利要求68中任一项的方法，其中所述树状分子基团是通过点击反应与所述多个引物中的每一个共价连接的，并且其中该点击反应是在所述引物上存在的炔部分与所述树状分子基团中存在的叠氮部分之间发生的，或者是在所述引物上存在的叠氮部分与所述树状分子基团中存在的炔部分之间发生的。10一种用于检测或分析感兴趣的靶核酸的方法，包括提供寡核苷酸探针，其包含能够与感兴趣的靶核酸杂交的核酸序列和共价联接于第一反应性部分的引物；使该寡核苷酸探针与待分析感兴趣的靶核酸之存在的样品在一定条件下接触，使得如果所述感兴趣的靶核酸存在，则在该寡核苷酸探针与。
7、该感兴趣的靶核酸之间形成杂交复合物；和使该经接触的样品与包含两个或更多个荧光部分以及第二反应性部分的树状分子成像剂反应，从而该第二反应性部分与该第一反应性部分反应而形成共价键；和对所述两个或更多个荧光部分进行成像，以检测或分析所述感兴趣的靶核酸之存在。权利要求书CN104059907A1/16页4含有树状分子染料的寡核苷酸探针及其制备方法和应用技术领域0001本发明一般地涉及用于生物检测和生物样品分析的探针。更具体地，本发明涉及以可用于检测和分析生物样品的树状分子染料为特征的寡核苷酸探针，并涉及其组合物及方法。背景技术0002自1980年代以来，荧光原位杂交FISH已经发展成为用于生物学研究和。
8、医学的一种强有力的工具。FISH是一种细胞遗传学技术，用于检测和定位特定DNA序列在染色体上的有无LANGERSAFER,ETAL1982PROCNATLACADSCIUSA791443815。联合使用荧光探针和荧光显微镜在细胞、循环肿瘤细胞和组织样品中鉴定DNA的特定特征，或检测和定位特定的RNAMRNA,LNCRNA和MIRNA靶标AMANN,ETAL2008NATUREREVIEWSMICROBIOLOGY6339348。FISH是一种重要的用于疾病例如癌症的辅助诊断和预后的技术。0003荧光探针已经成为分析基因、组织和细胞的强有力工具WAGGONER1986APPLICATIONSOF。
9、FLUORESCENTINTHEBIOMEDICALSCIENCES,EDSTAYLORETAL,NEWYORKALANRLISS,INCPP328MASON,EDITOR1993FLUORESCENTANDLUMINESCENTPROBESFORBIOLOGICALACTIVITY,BIOLOGICALTECHNIQUESSERIES,EDITEDBYSATTELLE,ACADEMICPRESSLIMITED,LONDON。通常被标记的生物分子包括核苷酸、寡核苷酸、核酸、氨基酸、肽和多肽、蛋白质、糖和脂质，以及其他SINGERSINGERETAL1986BIOTECBNIQUES423025。
10、0PITTAETAL1990STRATEGIES333SOUTHERN,1975JMOLBIOL98503517ALWINEETAL1977PROCNATLACADSCIUSA7453505354CALLOWETAL2000GRENOMERES1020272029。0004先前的荧光团标记方法使用NTP核苷三磷酸染料进行标记见例如WO2000/06773。另一种荧光标记技术使用铂化合物标记核酸见例如EP1373572BL。基于铂的标记化合物通过铂II金属中心与靶生物分子上的氮或硫原子的配位COORDINATION而附着在靶生物分子上。这些策略的缺点包括只有有限数目的染料可以被引入到探针中，从而。
11、限制了探针的“亮度”BRIGHTNESS。此外，NTP染料会由于高度修饰的三磷酸难以掺入POORINCORPORATION而导致产量低，并且基于铂的化合物可能导致探针的降解。而且，这两种策略都会造成包括碱基对区在内的整条链的碱基修饰，这会对杂交产生不良影响。0005因此，仍然需要新型荧光探针和荧光团标记方法学来解决现有的荧光探针和方法的缺点。发明内容0006本发明部分地基于意外地发现了缀合有树状分子染料、可用于检测和分析生物样说明书CN104059907A2/16页5品的新型寡核苷酸探针。0007这些独特的探针提供了许多优点，同时克服了现有荧光探针的缺陷。首先，可以掺入探针内的荧光染料的量不受。
12、限制。其次，已知树状分子染料比它们相应的单独个体更加明亮，导致探针更加灵敏见例如US2012256102AL。第三，点击化学的应用一般可导致定量或接近定量的标记。而且，因为含有染料的部分将会位于FISH探针的5侧，所以荧光部分不会影响探针与靶种类例如基因组DNA或RNA的杂交。0008在一个方面中，本发明一般性地涉及寡核苷酸探针。该寡核苷酸探针包括一个或多个能够与一个或多个感兴趣的靶核酸杂交的核酸序列；和一个或多个共价联接于该寡核苷酸的引物，其中该引物共价联接于包含两个或更多个荧光部分的树状分子基团DENDRIMERICGROUP。0009在另一个方面中，本发明一般地涉及用于产生寡核苷酸探针的。
13、方法。该方法包括产生寡核苷酸文库；提供多个引物，每一个引物均包含一个或多个炔部分；形成扩增子的文库ALIBRARYOFAMPLICONS，其中每一个扩增子包含所述寡核苷酸的文库中的一个或多个成员和来自该多个引物中的一个或多个引物；提供一个或多个树状分子基团，所述树状分子基团包含两个或更多个荧光部分且包含一个或多个叠氮部分；通过使所述炔部分与所述叠氮部分反应而使该扩增子与该树状分子基团反应，藉此产生寡核苷酸探针的文库。0010在另外一个方面中，本发明一般地涉及用于检测或分析感兴趣的靶核酸的方法。该方法包括提供寡核苷酸探针，其包含一个或多个能够与感兴趣的靶核酸杂交的核酸序列和共价联接于一个或多个第。
14、一反应性部分REACTIVEMOIETY的引物；使该寡核苷酸探针与待分析感兴趣的靶核酸之存在的样品在这样的条件下接触，在该条件下，如果存在感兴趣的靶核酸，则在该寡核苷酸探针与该感兴趣的靶核酸之间会形成杂交复合物；并使该经接触的样品与包含两个或更多个荧光部分FLUORESCENTMOIETIES以及一个或多个第二反应性部分的树状成像剂反应，由此使所述第二反应性部分与所述第一反应性部分反应形成共价键；和对所述两个或更多个荧光部分进行成像以检测或分析感兴趣的靶核酸的存在。附图说明0011图1显示了根据本发明的寡核苷酸探针的一个实施方案的示意图。0012定义0013除非另外定义，否则这里所用的全部技术。
15、和科学术语的意义与本发明所属领域的普通技术人员所公知的意义相同。本文中所用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和标识遵循本领域的标准论文和教科书中的含义，例如KORNBERG和BAKER编著,DNAREPLICATION,第二版WHFREEMAN,NEWYORK,1992LEHNINGER,BIOCHEMISTRY,第二版WORTHPUBLISHERS,NEWYORK,1975STRACHAN和READ编著,HUMANMOLECULARGENETICS,第二版WILEYLISS,NEWYORK,1999ECKSTEIN,编辑,OLIGONUCLEOTIDESANDANALOGSAPR。
16、ACTICALAPPROACHOXFORDUNIVERSITYPRESS,NEWYORK,1991GAIT,编辑,OLIGONUCLEOTIDESYNTHESISAPRACTICALAPPROACHIRLPRESS,OXFORD,1984SAMBROOK等,MOLECULARCLONINGALABORATORY说明书CN104059907A3/16页6MANUAL,补充第二版COLDSPRINGHARBORLABORATORY,1989，等。不过，为清楚和便于查阅起见，在下面定义了一些术语。0014术语“生物分子”可以指在自然界中发现的化合物，自然中发现的化合物的衍生物，自然界中发现的化合物的。
17、合成的修饰类似物，自然界中发现的化合物的基因工程类似物，自然界中发现的化合物的基因工程修饰类似物。例如，生物分子可以是和/或包括蛋白质；抗体；抗体片段；半抗原；糖蛋白；细胞膜蛋白；酶，如碱性磷酸酶，半乳糖苷酶，辣根过氧化物酶，或尿素酶；肽核酸（PNAS）；锁定核酸（LNA）；基因工程肽；基因工程蛋白；基因工程抗体；基因工程抗体片段；寡核苷酸；RNA；DNA；含糖分子；单糖；二糖；三糖；寡聚糖；多糖，如葡聚糖；小分子，包括药物样分子；药物；抗原，如肿瘤抗原；病原体；毒素；聚合物，包括生物聚合物和/或树状分子；核受体；核受体底物和/或配体；细胞因子；表位，包括肽表位，抗原表位，和/或病原体表位；酶。
18、的底物；和/或其组合或衍生物。0015如本文中所使用的，术语“样品”是指含有一种或多种感兴趣的分析物的材料或材料混合物，其通常是，但不一定是液体形式。0016如本文中所使用的，术语“核酸样品”是指包含核酸的样品。样品可以包含单一核酸种类或任何数目的核酸种类。某些样品包含至少10种、至少100种、至少1,000种、或者更多种例如至少100,000种或至少1,000,000种不同种类的不同核酸片段或不同序列。样品可以是来自任何来源的生物样品，例如来自人的脑脊液、淋巴、血液、血液衍生物例如血清、液化组织、尿液、粪便材料、拭子或鼻洗，细胞培养物、或食物。0017如本文中所使用的，术语“基因组样品”是指。
19、包含来自生物体的遗传材料的材料或材料混合物。0018如本文中所使用的，术语“基因组DNA”是指从生物体获得的脱氧核糖核酸。0019如本文中所使用的，术语“基因组样品”和“基因组DNA”包括可能经过扩增、纯化或断裂的遗传材料。0020如本文中所使用的，术语“标记物”是指任何可检测的标记物，包括放射性标记物和非放射性标记物。非放射性标记物包括任意的可检测标记物，包括荧光标记物和荧光条形码，以及带质量标签的标记物MASSTAGGEDLABELS。标记物包括能直接检测的和能间接检测的非放射性标记物，例如荧光标记物和质量标签。0021如本文中所使用的，术语“荧光标记物”是指任何可通过标记的荧光发射，例如。
20、通过荧光显微镜加以检测的标记物。生物分子例如核酸可以直接或间接标记。直接标记的核酸与标记物共价或非共价连接。0022如本文中所使用的，术语“核苷酸”是指核酸的具有磷酸基团、5碳糖和含氮碱基的亚单位，以及这样的亚单位的功能类似物无论是人工合成或天然存在的，其在聚合物形式下作为多核苷酸能够与天然存在的多核苷酸以类似于两个天然存在的多核苷酸的序列特异性方式杂交。脱氧核糖核酸的核苷酸亚单位是脱氧核糖核苷酸，而核糖核酸的核苷酸亚单位是核糖核苷酸。0023术语“核苷”和“核苷酸”意图包括这样的部分，其不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基部分，还包含其它已经被修饰的杂环碱基部分。这样的修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、乙酰。
21、化嘌呤或嘧啶、或其它杂环。此外，术语“核苷”和“核苷酸”包括这样的部分，其不仅含有常规的核糖和脱氧核糖，还含有其它的糖。修饰的核苷或核苷酸还包括糖部分上的修饰，例如其说明书CN104059907A4/16页7中一个或多个羟基被卤族原子或脂肪族基团代替，或者被官能化为醚、胺等等。一般地，如本文中所使用的，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可以互换使用。进一步，一般地，术语“核酸”或“核酸分子”还包括寡核苷酸和多核苷酸。0024在这里，术语“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用，用于描述由核苷酸如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的任意长度例如大于约2个碱基，大于约10个碱基，大于约100个碱基，大于约500。
22、个碱基，大于1,000个碱基，直至大约10,000个或更多个碱基的聚合物，并可以通过酶学或合成方式产生例如美国专利NO5,948,902及其中引用的参考文献中所述的PNA，其能够与天然存在的核酸以类似于两个天然存在的核苷酸的序列特异性方式杂交，例如，能够参与WATSONCRICK碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶分别为G、C、A和T。0025如本文中所使用的，术语“寡核苷酸”是指由约2500个核苷酸形成的核苷酸单链多聚体。寡核苷酸可以是合成的或者可以通过酶促制成，并且在一些实施方案中长度为1050个核苷酸。寡核苷酸可以含有核糖核苷酸单体即可以是寡核糖核苷酸或。
23、脱氧核糖核苷酸单体。寡核苷酸的长度可以是例如1020，2130，3140，4150，5160，6170，7180，80100，100150，150200个核苷酸，或者大于200个核苷酸。0026如本文中所使用的，术语“核糖核酸”和“RNA”是指由核糖核苷酸构成的核酸。0027如本文中所使用的，术语“脱氧核糖核酸”或“DNA”是指由脱氧核糖核苷酸构成的核酸。0028如本文中所使用的，术语“使杂交”或“杂交”是指核酸分子在合适的条件下，例如严格条件下，与特定核苷酸序列结合或双链体化。如本文中所使用的，术语“严格条件”（或“严格杂交条件”）是指这样的条件，其适合互补性足以在测定中提供期望水平的特异性。
24、的核酸例如表面结合的核酸和溶液相核酸产生结合配对；而较不适合互补性不足以提供期望特异性的结合成员之间形成结合配对。严格条件是杂交条件和清洗条件二者的加和或组合全体。0029严格条件（例如在阵列、SOUTHERN或NORTHERN印迹或杂交中），可以是序列依赖性的，并且在不同实验参数下经常是不同的。可用于使核酸杂交的严格条件包括，例如，在含有50甲酰胺、5SSC（盐、柠檬酸钠）和1SDS的缓冲液中在42进行杂交，或者在含有5SSC和1SDS的缓冲液中在65进行杂交，两者均在65下用02SSC和01SDS清洗。其它严格条件的实例包括在含有40甲酰胺、1MNACL和1SDS的缓冲液中在37进行杂交，。
25、并在45用1SSC清洗。在另一个实例中，可以采用在05MNAHPO4、7十二烷基磺酸钠SDS、1MMEDTA中在65与结合于滤膜的DNA杂交，并在68用01SSC/01SDS清洗。其他严格条件实例包括在60或更高温度下在3SSC450MM氯化钠/45MM柠檬酸钠中杂交，或者在42下在含有30甲酰胺、1MNACL、05月桂酰基肌氨酸钠、50MMMES、PH65的溶液中温育。普通技术人员可以容易地想到，可以使用替代的但是相当的杂交和清洗条件以提供严格程度相似的条件。0030在某些实施方案中，清洗条件的严格程度展现了确定核酸是否与另一个核酸特异杂交的条件（例如当核酸与核酸探针杂交时）。用于鉴定核酸的。
26、清洗条件包括，例如大约002摩尔的盐浓度、PH7、和至少约50或者约55约60的温度；或者盐浓度约为015MNACL、72、历时约15分钟；或者盐浓度为约02SSC、温度为至少约50或约说明书CN104059907A5/16页855约60，历时约15约20分钟；或者用盐浓度为约2SSC、含有01SDS的溶液在室温清洗杂交复合物15分钟2次，然后用盐浓度为01SSC、含有01SDS的溶液在68清洗15分钟2次；或者等价的条件。清洗的严格条件还可以是例如02SSC/01SDS，42。0031严格的测定条件是这样的杂交条件，其至少与上述的代表性条件同样严格，其中，如果在给定一组条件下，与上述的具体条。
27、件相比，几乎没有更多的缺乏足以提供期望特异性的互补性的结合复合物产生，则该组条件被认为是至少同样严格的；其中“几乎没有更多”是指少于其约5倍，典型地少于约3倍。其它的严格杂交条件是本领域已知的，并且也可以适当地采用。如前所述，术语“高严格度条件”或“高度严格的杂交条件”一般是指如下的条件，其适宜于在互补的结合成员之间即在固定的探针和互补的样品核酸之间产生复合物，而不会导致非互补核酸之间发生任何实质性的复合物形成例如任何无法通过相对于阵列上的特征间区INTERFEATUREAREA和/或对照区的背景信号标准化而检测到的复合物形成。0032严格杂交条件还可以包括水相核酸与可降低复杂度的核酸COMP。
28、LEXITYREDUCINGNUCLEICACIDS的“预杂交”，以抑制重复序列。例如，某些严格杂交条件包括在与表面结合的多核苷酸杂交之前，先与COT1DNA或类似物进行杂交。0033其他的杂交方法在描述CGH技术的参考文献中有描述KALLIONIEMI等，1992SCIENCE258818821WO93/18186。有若干关于通用技术的指南可用见例如TIJSSEN,HYBRIDIZATIONWITHNUCLEICACIDPROBES,PARTSIANDII,ELSEVIER,AMSTERDAM1993。关于适合于原位杂交的技术的描述见例如GALL等1981METHENZYMOL2147048。
29、0和ANGERER等GENETICENGINEERINGPRINCIPLESANDMETHODS,SETLOW和HOLLAENDER编辑VOL7,4365页PLENUMPRESS,NEWYORK1985美国专利NOS6,335,167,6,197,501,5,830,645,和5,665,549。0034如本文中所使用的，术语“引物”是指具有与靶核酸的某个区域互补的核苷酸序列的寡核苷酸。引物与互补区结合，并且在引物延伸条件下使用靶核酸作为模板被延伸。引物可以是约20约60个核苷酸，尽管也想到了该长度范围外的引物。“引物”可以在聚合酶的作用下从其3端延伸。不能在聚合酶的作用下从其3端延伸的寡核苷。
30、酸不是引物。0035如本文中所使用的，术语“引物延伸条件”是指适合结合于靶核酸互补区中的引物延伸的条件。引物延伸条件包括在特定温度下用核苷酸、聚合酶和缓冲液温育双链体核酸一段时间。这些条件是本领域众所周知的。由引物延伸产生的新链在本文中被称作“引物延伸产物”。0036如本文中所使用的，术语“扩增”是指使用靶核酸作为模板产生靶核酸的一个或多个拷贝。0037如本文中所使用的，术语“扩增子”是指多核苷酸扩增反应的产物；即，多核苷酸的克隆群体，其可以是单链的或双链的，并且是从一个或多个起始序列复制而来的。所述一个或多个起始序列可以是同一序列的一个或多个拷贝，或者它们可以是不同序列的混合物，所述不同序列。
31、含有共同的被扩增区域，例如存在于从某一样品中提取的DNA片段的混合物中的特定外显子序列。优选地，扩增子是通过单一起始序列的扩增形成的。扩增子可以通过多种扩增反应产生，所述扩增反应的产物包括所述一个或多个起始核酸或靶核酸说明书CN104059907A6/16页9的复制物REPLICATES。在一个方面中，产生扩增子的扩增反应是“模板驱动的”，体现在反应物核苷酸或寡核苷酸的碱基配对在模板多核苷酸中具有互补物COMPLEMENT，该互补物是产生反应产物所需要的。在一个方面中，模板驱动的反应是利用核酸聚合酶的引物延伸或利用核酸连接酶的寡核苷酸连接。这样的反应包括，例如，聚合酶链式反应PCR、线性聚合酶。
32、反应、基于核酸序列的扩增NASBAS、滚环复制等，它们公开于下列参考文献中，本文通过援引并入这些参考文献MULLIS等,美国专利NOS4,683,1954,965,1884,683,2024,800,159PCRGELFAND等,美国专利NO5,210,015使用“TAQMAN”探针的实时PCRWITTWER等,美国专利NO6,174,670KACIAN等,美国专利NO5,399491“NASBA“LIZARDI,美国专利NO5,854,033AONO等,日本专利公开JP4262799滚环复制等。在一个方面中，本发明的扩增子是通过PCR产生的。如本文中所使用的，术语“扩增”意指实施扩增反应。0。
33、038如本文中所使用的，术语“聚合酶链式反应”或“PCR”是指一种酶反应，其中一种特定的模板DNA用一对或多对序列特异性引物扩增。“PCR条件”是实施PCR的条件，并包括提供试剂例如核苷酸、缓冲液、聚合酶等以及温度循环例如通过适合于变性、复性和延伸的温度的循环，并且是本领域已知的。0039如本文中所使用的，术语“互补”是指通过非共价键与感兴趣的靶核酸碱基配对的核苷酸序列。在经典的WATSONCRICK碱基配对中，DNA中的腺嘌呤A与胸腺嘧啶T形成碱基对，鸟苷酸G与胞嘧啶C形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶U代替。这样，A与T互补，而G与C互补。在RNA中，A与U互补，反之亦然。典型地，“。
34、互补”是指与感兴趣的靶标完全互补的核苷酸序列，从而序列中的每一个核苷酸均与靶核酸相应位置处的每一个核苷酸互补。在某些情况下，核苷酸序列可以与靶部分互补，其中不是所有核苷酸均与靶核酸所有相应位置处的每一个核苷酸互补。0040如本文中所使用的，术语“探针”是指与感兴趣的核苷酸序列互补的核酸。在某些情况下，靶分析物的检测需要探针与靶杂交。在某些实施方案中，探针可能被固定在基质表面上，其中基质可以具有多种构型，例如片层、珠子或其它结构。在某些实施方案中，探针可以存在于平面支持物的表面上，例如呈阵列的形式。0041如本文中所使用的，术语“链”STRAND是指由通过磷酸二酯键共价连接在一起的多个核苷酸构成。
35、的核酸。一条核酸链不包括仅藉由氢键键合即通过碱基配对而缔合的核苷酸，尽管该链可以藉由氢键键合与互补链碱基配对。0042核酸可以单链或双链形式存在。双链核酸具有两个互补的核酸链，它们在此可以称作“第一链”或“第二链”，或者其他任意命名。第一链和第二链是不同的分子，而且将某条链指定为第一链或第二链是任意的，并不暗示任何特定的方向、功能或结构。数种示例哺乳动物染色体区例如BAC、组装体、染色体等以及许多病原体的第一链的核苷酸序列是已知的，并可以在例如NCBI的GENBANK数据库中找到。某一区域的第二链是与该区域互补的。0043本发明的某些实施方案包括阵列，例如核酸阵列。“阵列”包括可寻址区域的任何。
36、一维、二维或基本上二维以及三维排列，可寻址区域带有与该区域缔合ASSOCIATED的特定化学部分例如配体，例如生物聚合物如多核苷酸或寡核苷酸序列核酸、多肽例如蛋白质、碳水化合物、脂质等。“固定的”的意思是，所述部分与所述区域中的基质说明书CN104059907A7/16页10表面稳定缔合，以至于它们在使用该阵列的条件下，例如杂交和洗脱条件下，不会从该区域脱离。如本领域已知的，所述部分可以共价或非共价结合于所述区域的表面。例如，在基质为多孔的情况下，每个区域可以延伸到第三个维度，而在基质是非多孔的情况下，则不会有任何显著的第三维度尺寸厚度。核酸阵列是本领域已知的，其中可以修改成为如本文所述的本发。
37、明阵列的代表性阵列包括在下列文献、以及其中引证的参考文献中描述的那些美国专利NOS6,656,7406,613,8936,599,6936,589,7396,587,5796,420,1806,387,6366,309,8756,232,0726,221,653和6,180,351。0044如本文中所使用的，术语“基质”是指这样的表面，其上可附着标记分子或探针，例如阵列。玻片是最常见的用于生物芯片的基质，但熔融石英、硅、塑料和其它材料也可以是合适的。0045基质可以成形为几乎任何形状。在一组实施方案中，基质有至少一个基本上平的表面。然而，在其它实施方案中，基质还可以包括缺口INDENTATIO。
38、N、突起PROTUBERANCE、阶STEP、脊RIDGE、梯级TERRACE等。取决于应用，基质可以用任何合适的材料形成。例如，基质可以是硅基芯片或玻片。其它适合用于本发明的阵列的基质材料包括，例如玻璃、陶瓷、塑料、金属、合金、碳、琼脂、硅石、石英、纤维素、聚丙烯、聚酰胺、聚酰亚胺、和明胶，以及其它聚合物支持物或其它固体材料支持物。可以用于基质中的聚合物包括，例如聚苯乙烯、聚四氟乙烯PTFE、聚偏二氟乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯基乙烯POLYVINYLETHYLENE、聚乙烯亚胺、聚甲醛POM、聚乙烯苯酚POLYVINYLPHENOL、聚交酯、聚甲基丙烯酰亚胺PMI、聚亚烷基砜P。
39、OLYALKENESULFONE,PAS、聚丙烯、聚乙烯、聚羟乙基甲基丙烯酸酯HEMA、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚酰亚胺、各种嵌段共聚物等。0046用作探针的核酸的选择可能受到关于特定染色体或染色体区与某些疾病条件相关性的在先知识的影响见例如WO93/18186，其列举了示例染色体异常及相关疾病。或者，可以使用本发明下文中将进一步讨论的方法进行全基因组扫描以鉴定拷贝数频繁变化的新区域。0047如本文中所使用的，术语“染料”一般是指可吸收电磁辐射例如波长大于或等于340NM的电磁辐射的任何有机或无机分子或部分。0048如本文中所使用的，术语“荧光染料”一般是指任何在被电磁辐射源例如灯、光电二。
40、极管或激光器辐照时，通过荧光机制发射波长更长的电磁辐射的染料。0049术语“分离的”，在与核酸关联使用时如在“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”中，是指被鉴定并与其在自然来源中通常相伴随的至少一种组分或污染物分离的核酸序列。分离的核酸存在的形式或环境不同于其在自然界中出现的形式或环境。与之相对，非分离的核酸，如核酸如DNA和RNA，则以其在自然中出现的状态存在。例如，给定的DNA序列例如基因出现在其宿主细胞染色体上相邻基因的附近；RNA序列，例如编码特定蛋白的特定MRNA序列，在细胞中作为与许多编码多种蛋白的其它MRNA的混合物出现。但是，编码给定蛋白的分离的核酸包括例如这样的情况该核酸存在。
41、于通常表达该给定蛋白的细胞中，但位于不同于天然细胞中的染色体位置，或者其侧翼的核酸序列与自然界中出现的侧翼核酸序列不同。分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以单链或双链形式存在。当要使用分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸表达蛋白时，寡核苷酸或多核苷酸将会至少含有有义或说明书CN104059907A108/16页11编码链即寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的，但是也可以同时含有有义链和反义链即寡核苷酸或多核苷酸可以是双链的。0050如本文中所使用的，术语“纯化的”或“纯化”是指，从样品中除去组分例如污染物。例如，通过除去污染性非免疫球蛋白来纯化抗体；也可以通过除去不结合靶分子的免疫球蛋白来纯化它们。非免疫球。
42、蛋白的去除和/或不结合靶分子的免疫球蛋白的去除导致样品中的靶反应性免疫球蛋白的百分比增加。在另一个实例中，在细菌宿主细胞中表达重组多肽，并通过除去宿主细胞蛋白来纯化该多肽；重组多肽在样品中的百分比由此得以提高。0051发明详细说明0052本发明提供了含有树状染料分子的新型寡核苷酸探针，其可用于高灵敏度FISH核酸，例如DNA和RNA。本发明的寡核苷酸探针克服了常规荧光探针的许多不足和缺陷。0053首先，与现有荧光探针相比，探针中可掺入的荧光染料的数目没有限制。其次，已知树状分子染料一般比其对应的单独个体更加明亮，导致探针更加灵敏。第三，本发明荧光探针的一个独有特征是使用点击化学，这一般可导致定。
43、量或接近定量的标记。而且，因为含有染料的部分将位于FISH探针的5侧，所以荧光部分不会影响探针与靶种类如基因组DNA或RNA的杂交。0054在一个方面中，本发明一般地涉及寡核苷酸探针。寡核苷酸探针包括能够与感兴趣的靶核酸杂交的核酸序列；和共价联接于所述寡核苷酸的引物，其中该引物共价联接于含有两个或更多个荧光部分的树状分子基团。0055在某些优选实施方案中，该树状分子基团共价联接于所述引物的5端图1。0056可用于本发明荧光探针的荧光染料可以是任何合适的染料，包括例如花青染料CYANINEDYES、罗丹明染料RHODAMINEDYES、荧光酮染料FLUORINEDYES、吖啶染料ACRIDINE。
44、DYES、噁嗪染料OXAZINDYES、菲啶染料PHENANTHRIDINEDYES。在某些优选实施方案中，一个或多个荧光部分是从下选出的荧光染料CY2,CY3,CY35,CY5,CY55,CY7,IR染料,DYOMICS染料、OREGONGREEN488、PACIFICBLUE、罗丹明绿RHODAMINEGREEN、和ALEXA染料。0057如本文中所使用的，术语“树状分子”DENDRIMER或“树状的”是指反复分枝REPEATEDBRANCHED的分子。树状分子是三维、高度分枝的、单分散性MONODISPERSE的纳米级NANOMETRIC大分子，通过一系列重复的反应REITERATIVE。
45、SEQUENCEOFREACTIONS而获得。树状分子可以是单价或多价的。例如，多价树状分子可以是二价、三价、四价、五价、六价、七价、八价、九价或十价的。在某些实施方案中，树状分子可以具有例如210个分枝，1120个分枝，或者超过20个分枝。树状分子通常具有规则重复的分枝结构。当某个树状分子结构单元作为其前一个树状分子结构单元的完全拷贝从其前一个树状分子结构单元延伸出来时，将该单元的延伸称为下一“代”GENERATION。0058迄今为止树状分子是通过点击化学制备，例如采用DIELSALDER反应、巯基炔反应THIOLYNEREACTION和叠氮炔反应AZIDEALKYNEREACTIONFR。
46、ANC,ETAL2009CHEMEURJVOL15,ISSUE23,PP56305639KATO,ETAL2008JAMCHEMSOC13015,PP50625064NODA,ETAL1991JPNJPSYCHIATRYNEUROL4511078MACHAIAH1991INDIANJEXPBIOL2954637FRANC,ETAL2008CHEMCOMM说明书CN104059907A119/16页12PP52675276。0059本领域已知有大量的树状分子合成方法学。树状分子的合成方法包括发散法DIVERGENTMETHOD，其中树状分子是从多官能核心开始，通过一系列反应例如迈克尔反应向外延伸。
47、组装而成。0060方案100610062树状分子的合成方法还包括收敛法CONVERGENTMETHOD，其中树状分子ENDRIMER从终止于球形的表面的小分子开始构建，反应向内进行，构建也向内进展，最终联接于核心。0063方案200640065每一个树状分子基团均可包含任意合适代数的延伸，例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,或多于10代。0066每一个树状分子基团均可包含任意合适数目的荧光部分。在某些优选实施方案中，树状分子基团包含三个或更多个荧光部分例如4个或更多个，5个或更多个，6个或更多个，10个或更多个。0067在某些优选实施方案中，树状分子基团具有如下的结构式0068说明书CN。
48、104059907A1210/16页130069其中L包含选自下组的反应性基团炔ALKYNES，叠氮化物AZIDES，巯基THIOL，烯ENE，异腈ISONITRILE和四嗪TETRAZINES；I是约06之间的整数例如1,2,3,4,5,6；并且Q是选自下组的荧光部分CY2,CY3,CY35,CY5,CY55,CY7,IR染料,DYOMICS染料,OREGONGREEN488,PACIFICBLUE,罗丹明绿RHODAMINEGREEN和ALEXA染料。0070在某些优选实施方案中，所述树状分子基团与所述引物共价连接。可以采用任何合适的反应用于将树状分子基团与引物共价连接。在某些优选实施方案。
49、中，树状分子基团通过点击化学反应或点击反应与引物共价偶联。如本文中所使用的，术语“点击化学”是指适用于通过将小的模块性单元连接在一起而快速而可靠地生成物质的化学见例如KOLB等2001ANGEWANDTECHEMIEINTLED4020042011EVANS2007AUSTRALIANJCHEM60384395CARLMARK等2009CHEMSOCREV38352362。0071点击化学反应的一个实例是叠氮炔HUISGEN环加成AZIDEALKYNEHUISGENCYCLOADDITION例如在室温下使用铜CU催化剂ROSTOVTSEV等2002ANGEWCHEMIEINTLED411425962599TORNOE等2002JORGCHEM67930573064。点击化学的其它实例包括巯基烯点击反应、DIELSALDER反应和反电子需求的DIELSALDER反应INVERSEELECTRONDEMANDDIELSALDERREACTION、异腈异氰和四嗪之间的41环加成见例如HOYLE等2010ANGEWCHEMIEINTLED49915401573BLACKMAN等2008JAMCHEMSOC130411351813519DEVARAJ等2008BIOCONJUGATECHEM191222972299。