STAG2基因突变序列、其检测方法以及STAG2基因突变在检测膀胱癌中的应用.pdf

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1、10申请公布号CN104059966A43申请公布日20140924CN104059966A21申请号201410213970X22申请日20140520C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人吴松地址518035广东省深圳市福田区笋岗西路3002号深圳市第二人民医院银华大厦六楼622办公室申请人蔡志明72发明人吴松杨泽雨张蒙黄毅蔡志明74专利代理机构深圳市合道英联专利事务所普通合伙44309代理人廉红果谢成毅54发明名称STAG2基因突变序列、其检测方法以及STAG2基因突变在检测膀胱癌中的应用57摘要本发明STAG2基因突变序列、其检测方法以及STAG2基因突变。

2、在检测膀胱癌中的应用，属于分子生物学基因检测技术领域。包括下述步骤1、从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA；2、对步骤1中提取的两种DNA分别进行全基因组测序和全外显子测序；3、对步骤2的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测，得到突变基因；4、采用SANGER测序来验证步骤3所得突变基因的体细胞替换和插入与缺失；5、突变基因为显著突变基因的鉴定。本发明具有确立了STAG2的突变是膀胱癌预后差的指标之一，也可以作为治疗膀胱癌的一个新的作用靶点的优点。51INTCL权利要求书2页说明书11页序列表23页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申。

3、请权利要求书2页说明书11页序列表23页附图3页10申请公布号CN104059966ACN104059966A1/2页21一种检测STAG2基因突变的方法，包括下述步骤1、从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA；2、对步骤1中提取的两种DNA分别进行全基因组测序和全外显子测序；3、对步骤2的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测，得到突变基因；4、采用SANGER测序来验证步骤3所得突变基因的体细胞替换和插入与缺失；5、突变基因为显著突变基因的鉴定。2根据权利要求1所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，步骤2中的全基因组测序过程为用ILLUMIN。

4、A公司的HISEQ2000平台对从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA，测序方式为双末端测序，测序读长为100BP。3根据权利要求1所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，步骤2中的全外显子组测序过程为对对从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA进行随机打断后，按照AGILENTTECHNOLOGIES说明书提供的实验流程，采用SURESELECTHUMANALLEXON50MBKIT来捕获全外显子组序列；全外显子组测序平台是ILLUMINA公司的HISEQ2000平台，测序方式为双末端测序，测序读长为100BP。4根据权利要求。

5、1所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，步骤3中对步骤2的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测的过程为A、去除含有测序接头和包含五个以上未知碱基的低质量序列，用BWA在容缺口模式下将其余的高质量双末端测序序列比对到NCBI人类参考基因组HG18；B、随后用基因组分析工具包GATK对BWA的比对结果进行了局部重新比对；C、根据BWA的比对结果，利用VARSCAN找出了所有潜在的体细胞替换位点；基本排除所有的生殖细胞突变的参数及过滤条件I肿瘤样本和匹配的血液样本在突变位点的基因组位置必须有足够的覆盖深度8；II对于一个给定的基因组位置，肿瘤和血液样本平均碱基质量值应不小于15；。

6、III变异型应至少被肿瘤标本的20的总读取数支持,而在血液样本没有高质量的变异支持读取也被认为是变异型；IV在肿瘤组织中，支持突变的序列应不少于三条采用上述过滤条件，基于GATK局部重新比对的结果，找出了所有可能的插入或缺失类型体细胞突变；为进一步降低假阳性，用SAMTOOLS软件包来检测肿瘤组织中包括单核苷酸变异和插入与缺失的所有变异，排除了满足以下任何一个过滤条件的所有体细胞变异I一致序列PHRED质量值或SNP质量值20；II比对质量值30；III只发生于一条DNA链上的变异；IV单碱基替换位点周围30BP范围内存在可疑的插入或者缺失位点。将所获得的体细胞突变与单核苷酸多态性数据库DBS。

7、NP132和1000人基因组计划中获得的SNP数据集进行了比较，排除在上述数据库中记录的所有位点，得到剩余的的变异。5根据权利要求1所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，步骤4中采用SANGER测序来验证步骤3所得突变基因的体细胞替换和插入与缺失的过程为对肿瘤组权利要求书CN104059966A2/2页3织DNA与外周血DNA分别进行PCR扩增，扩增产物经SANGER测序得到突变位点。6根据权利要求5所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，PCR扩增的引物为SEQNO12SEQNO77所示。7根据权利要求5所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，PCR扩增的热循环条件。

8、为945分钟酶的活性化反应；9430秒、6530秒和7230秒，共35个循环；7210分钟；PCR反应体系为2LDNTP、2L10XPCRBUFFER、1LTF10M、1LTR10M、1LDNA模板、125LDH2O灭菌蒸馏水和05LTAKARATAQHS。8根据权利要求1所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，步骤5中显著基因的鉴定过程为根据外显子组测序中找到的同义突变数量来计算样本的背景突变率，背景突变率BI计算公式为BI14MI/NI，其中I为每一突变类别，该类突变数目的观测值为MI，该类核苷酸在肿瘤样本中成功测序8的总碱基数为NI；14为HAPMAP数据库中非同义突变比同义突变。

9、的比值；基因G作为随机突变基因的概率PG值为7类突变的概率之积，即其中7为同义突变的7个不同的类别；采用似然比检验来确定每个基因的P值，当P001时为显著突变基因。9由权利要求18中任一权利要求所述的检测STAG2基因突变的方法检测得到的STAG2基因突变序列。10权利要求9所述的STAG2基因突变序列在检测膀胱癌中的应用，优选的所述膀胱癌为膀胱移行细胞癌。权利要求书CN104059966A1/11页4STAG2基因突变序列、其检测方法以及STAG2基因突变在检测膀胱癌中的应用技术领域0001本发明属于分子生物学基因检测技术领域，具体涉及STAG2基因突变序列、其检测方法以及STAG2基因突变。

10、在检测膀胱癌中的应用。背景技术0002在全世界各个国家和地区，膀胱癌是一种最常见泌尿生殖系统恶性肿瘤。据估计，仅在2008年单年度就有386300例新发病例和150200例死亡病例。过去的研究表明膀胱癌是一个具有较高异质性的疾病，它有两个不同亚型浅表型和侵入型，其临床表现多变和遗传背景复杂。最近，我们开展的一项研究结果表明在膀胱移行细胞癌中，有八个染色质重塑基因UTX，MLLMLL3，CREBBPEP300，NCOR1，ARID1A和CHD6存在频发突变。然而，目前我们对膀胱癌的体细胞突变情况仍缺乏系统的认识，我们对膀胱癌发生过程中的关键“驱动基因”也知之甚少。0003为了确定这些突变基因与膀。

11、胱癌发生的相关性，我们采用过去研究中所描述的统计学方法分析了每个基因的体细胞突变率是否显著高于整个基因组的背景突变率。通过该分析，我们一共发现了37个显著突变基因图1和附表6，其中包括7个已知膀胱癌的基因TP53，HRAS，FGFR3，PIK3CA，RB1，KRAS和TSC1以及我们过去所发现的八个染色质重塑基因UTX,ARID1A,MLLMLL3，CREBBPEP300，NCOR1和CHD6。此外，我们还分析了染色质重塑相关基因和基因家族的突变情况，并在膀胱癌中观察到多个其他染色质重塑基因的频发突变，包括组蛋白脱甲基酶基因UTX/UTY30，核染色质重塑基因ARID1A/4A17，组蛋白赖氨。

12、酸甲基转移酶基因MLL/MLL3/MLL516，组蛋白乙酰转移酶基因EP300/40015，SWI/SNF复合体相关基因SMARCA4/C17和组蛋白脱甲基酶基因JARID1A/B6。总的来说，在99例病例中，至少有57例58患者的染色质重塑基因存在体细胞突变，这进一步表明调节染色质构象的表观遗传学改变和翻译后修饰可能是膀胱癌发生过程中的一种主要的驱动机制。发明内容0004本发明的目的在于公开了一种检测STAG2基因突变的方法。0005本发明的另一个目的在于公开了STAG2基因突变在检测膀胱癌中的应用。0006本发明的第三个目的在于公开了通过上述检测方法得到的STAG2基因突变序列。0007本。

13、发明的目的是通过以下技术方案实现的0008一种检测STAG2基因突变的方法，包括下述步骤00091、从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA；00102、对步骤1中提取的两种DNA分别进行全基因组测序和全外显子测序；00113、对步骤2的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测，得到突变基因；说明书CN104059966A2/11页500124、采用SANGER测序来验证步骤3所得突变基因的体细胞替换和插入与缺失；00135、突变基因为显著突变基因的鉴定。0014上述技术方案所述的检测STAG2基因突变的方法，其中，步骤2中的全基因组测序过程为用ILLUMIN。

14、A公司的HISEQ2000平台对从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA，测序方式为双末端测序，测序读长为100BP。0015上述技术方案所述的检测STAG2基因突变的方法，其中，步骤2中的全外显子组测序过程为对对从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA进行随机打断后，按照AGILENTTECHNOLOGIES说明书提供的实验流程，采用SURESELECTHUMANALLEXON50MBKIT来捕获全外显子组序列；全外显子组测序平台是ILLUMINA公司的HISEQ2000平台，测序方式为双末端测序，测序读长为100BP。0016上述技术。

15、方案所述的检测STAG2基因突变的方法，其中，步骤3中对步骤2的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测的过程为0017A、去除含有测序接头和包含五个以上未知碱基的低质量序列，用BWA在容缺口模式下将其余的高质量双末端测序序列比对到NCBI人类参考基因组HG18；0018B、随后用基因组分析工具包GATK对BWA的比对结果进行了局部重新比对；0019C、根据BWA的比对结果，利用VARSCAN找出了所有潜在的体细胞替换位点；0020基本排除所有的生殖细胞突变的参数及过滤条件0021I肿瘤样本和匹配的血液样本在突变位点的基因组位置必须有足够的覆盖深度8；0022II对于一个给定的基因组位置。

16、，肿瘤和血液样本平均碱基质量值应不小于15；0023III变异型应至少被肿瘤标本的20的总读取数支持,而在血液样本没有高质量的变异支持读取也被认为是变异型；0024IV在肿瘤组织中，支持突变的序列应不少于三条；0025采用上述过滤条件，基于GATK局部重新比对的结果，找出了所有可能的插入或缺失类型体细胞突变；为进一步降低假阳性，用SAMTOOLS软件包来检测肿瘤组织中包括单核苷酸变异和插入与缺失的所有变异，排除了满足以下任何一个过滤条件的所有体细胞变异0026I一致序列PHRED质量值或SNP质量值20；0027II比对质量值30；0028III只发生于一条DNA链上的变异；0029IV单碱基。

17、替换位点周围30BP范围内存在可疑的插入或者缺失位点。0030将所获得的体细胞突变与单核苷酸多态性数据库DBSNP132和1000人基因组计划中获得的SNP数据集进行了比较，排除在上述数据库中记录的所有位点，得到剩余的的变异。0031上述技术方案所述的检测STAG2基因突变的方法，其中，步骤4中采用SANGER测序来验证步骤3所得突变基因的体细胞替换和插入与缺失的过程为对肿瘤组织DNA与外周血DNA分别进行PCR扩增，扩增产物经SANGER测序得到突变位点。0032上述技术方案所述的检测STAG2基因突变的方法，其中，PCR扩增的引物为SEQ说明书CN104059966A3/11页6NO12S。

18、EQNO77所示。0033上述技术方案所述的检测STAG2基因突变的方法，其中，PCR扩增的热循环条件为945分钟酶的活性化反应；9430秒、6530秒和7230秒，共35个循环；7210分钟；PCR反应体系为2LDNTP、2L10XPCRBUFFER、1LTF10M、1LTR10M、1LDNA模板、125LDH2O灭菌蒸馏水和05LTAKARATAQHS。0034上述技术方案所述的检测STAG2基因突变的方法，其中，步骤5中显著基因的鉴定过程为根据外显子组测序中找到的同义突变数量来计算样本的背景突变率，背景突变率BI计算公式为BI14MI/NI，其中I为每一突变类别，该类突变数目的观测值为M。

19、I，该类核苷酸在肿瘤样本中成功测序8的总碱基数为NI；14为HAPMAP数据库中非同义突变比同义突变的比值；0035基因G作为随机突变基因的概率PG值为7类突变的概率之积，即其中7为同义突变的7个不同的类别；0036采用似然比检验来确定每个基因的P值，当P001时为显著突变基因。0037上述技术方案中任一技术方案所述的检测STAG2基因突变的方法检测得到的STAG2基因突变序列。0038上述技术方案所述的STAG2基因突变序列在检测膀胱癌中的应用，优选的所述膀胱癌为膀胱移行细胞癌。0039本发明具有以下有益效果00401、STAG2的突变是膀胱癌预后差的指标之一；00412、STAG2的突变可。

20、以作为膀胱癌诊断的一个辅助指标；00423、STAG2可以作为治疗膀胱癌的一个新的作用靶点。附图说明00431、图1为5例患者STAG2染色体缺失；00442、图2为99例膀胱癌患者STAG2的氨基酸测序结果；00453、图3图7为99例膀胱癌中5例患者发生STAG2缺失。具体实施方式0046为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明STAG2基因突变序列、其检测方法以及STAG2基因突变在检测膀胱癌中的应用作进一步的说明。0047本发明实施例中未作特殊说明的操作方法均按照仪器中的说明书进行操作。0048试验例1STAG2基因突变在检测膀胱癌中的应用0049一、样本来源与及选择标。

21、准0050通过泌尿生殖系统癌症基因组联盟UCGC的中国成员机构，从新诊断的患者中获取肿瘤样本和与其匹配的外周血或正常对照组相邻的形态正常的膀胱组织。按照伦理审查委员会规定的制度，每个病人在招聘研究之前均签署了知情同意书。患者的详细的临床资料。所有的标本在收集后用液氮速冻并立即储存在80用于进一步研究。苏木精伊红HE染色切片均由两个病理医生在显微镜下独立地进行评估。在本研究中，我们说明书CN104059966A4/11页7只选取了膀胱癌细胞纯度超过85的组织用于DNA提取和后续的测序。0051样本的选择标准1、所有99例患者患者情况见表1所示在术前都未经放疗或化疗；2、患者都是由中山肿瘤中心确诊。

22、的；3、样本组织都是新鲜组织，切下后30分钟内放入RNALATER中，并在4冷藏过夜，其后80低温储存；4、经HE染色，肿瘤细胞超过80的肿瘤组织；5、正常膀胱组织在病理学检查中显示正常组织无肿瘤细胞污染；6、年龄大于18岁。0052表199例膀胱癌患者信息00530054说明书CN104059966A5/11页80055说明书CN104059966A6/11页90056二、主要试剂和仪器0057SURESELECTHUMANALLEXON50MBKIT0058TRUSEQRNA样品制备试剂盒ILLUMINA公司0059DUAL96WELLGENEAMPPCRSYSTEM9700APPLIED。

23、BIOSYSTEMS00603730XLDNA分析仪APPLIEDBIOSYSTEMS0061EPITECTBISULTEKITQIAGEN,HILDEN,GERMANY0062HOTSTARTAQDNA聚合酶QIAGEN,HILDEN,GERMANY0063ABISTEPONEAPPLIEDBIOSYSTEMS0064SYBRPREMIXEXTAQTMIITAKARA试剂0065GENEAMPPCRSYSTEM9700THERMALCYCLERLIFETECHNOLOGIES0066三、操作步骤0067一、基因组DNA提取和基于ILLUMINA公司测序平台的全基因组和全外显子组测序0068D。

24、NA提取根据说明书提供的实验步骤，提取表1中99例膀胱癌患者的肿瘤组织和匹配的外周血样本的基因组DNA，构建DNA文库；0069全基因组测序所使用的测序平台是ILLUMINA公司的HISEQ2000平台，测序方式为双末端测序，测序读长为100BP；0070全外显子组测序对来自同一批99对肿瘤血液样本的基因组DNA进行随机打断后，按照AGILENTTECHNOLOGIES说明书提供的实验流程，采用SURESELECTHUMANALLEXON50MBKIT来捕获全外显子组序列。全外显子组测序所使用的测序平台是ILLUMINA公司的HISEQ2000平台，测序方式为双末端测序，测序读长为100BP。。

25、0071二、全外显子组序列比对与体细胞突变检测00721、去除含有测序接头和包含五个以上未知碱基的低质量序列以后，我们使用BWA在容缺口模式下将其余的高质量双末端测序序列比对到NCBI人类参考基因组HG18；说明书CN104059966A7/11页1000732、随后我们使用基因组分析工具包GATK对BWA的比对结果进行了局部重新比对；00743、根据BWA的比对结果，利用VARSCANV22找出了所有潜在的体细胞替换位点；0075基本排除所有的生殖细胞突变的参数及过滤条件0076I肿瘤样本和匹配的血液样本在突变位点的基因组位置必须有足够的覆盖深度8；0077II对于一个给定的基因组位置，肿瘤。

26、和血液样本平均碱基质量值应不小于15；0078III变异型应至少被肿瘤标本的20的总读取数支持,而在血液样本没有高质量的变异支持读取也被认为是变异型；0079IV在肿瘤组织中，支持突变的序列应不少于三条。采用上述过滤条件，基于GATK局部重新比对的结果，我们找出了所有可能的插入或缺失类型体细胞突变。0080为进一步降低假阳性，我们采用SAMTOOLS软件包来检测肿瘤组织中的所有变异包括单核苷酸变异SNVS和插入与缺失。我们排除了满足以下任何一个过滤条件的所有体细胞变异0081I一致序列PHRED质量值或SNP质量值20；0082II比对质量值30；0083III只发生于一条DNA链上的变异；0。

27、084IV单碱基替换位点周围30BP范围内存在可疑的插入或者缺失位点。0085为了去除任何以前发现的生殖细胞变异，我们将所获得的体细胞突变与单核苷酸多态性数据库DBSNP132和1000人基因组计划中获得的SNP数据集HTTP/WWW1000GENOMESORG进行了比较。在上述数据库中记录的所有位点均被排除，其余的变异可用于进一步研究。0086三、采用SANGER测序来验证体细胞替换和插入与缺失0087通过基于PCR扩增的SANGER测序来验证非沉默体细胞替换和插入与缺失。我们采用PRIMER3针对所有可能的体细胞突变位点来设计PCR扩增引物，33对PCR引物如SEQNO1244所示每对引物。

28、加入相应配对的肿瘤样本，PCR引物首先被用来扩增肿瘤组织的DNA；PCR扩增实验均在DUAL96WELLGENEAMPPCRSYSTEM9700APPLIEDBIOSYSTEMS系统完成，每个反应中都加入了来自不同个体的20NG模板DNA。00881、按表2中的组份配制PCR反应体系在冰上进行反应体系的配制。0089表2PCR反应体系0090说明书CN104059966A108/11页11009100922、在EPPENDOFPCR热循环仪上进行PCR扩增，热循环条件为945分钟酶的活性化反应；9430秒、6530秒和7230秒，共35个循环；7210分钟；00933、将获得的PCR产物在4保。

29、存。0094通过上述PCR扩增得到肿瘤组与正常对照组的PCR产物。00954、扩增出的PCR片断送到深圳华大基因研究院，PCR扩增产物均由3730XLDNA分析仪APPLIEDBIOSYSTEMS完成测序。所有测序结果都由测序分析软件52版本APPLIEDBIOSYSTEMS完成分析。如果肿瘤中突变被成功验证，相同的引物对被用来扩增同一个体的血液DNA，以确定该突变是否为体细胞突变。0096突变序列如SEQNO1SEQNO11所示，其中与SEQNO1相对应的正常序列的第301位上为G，而突变序列中第301位为A；与SEQNO2相对应的正常基因与突变基因相比，突变基因在第301位上多了碱基A；与。

30、SEQNO3相对应的正常序列的第301位上为G，而突变中第301位为T；与SEQNO4相对应的正常序列的第301位上为G，而SEQNO1中第301位为A；与SEQNO5相对应的正常序列的第301和第302位上为T和G，而突变序列中缺少T和G；与SEQNO6相对应的正常序列的第301位上为C，而突变中第301位为T；与SEQNO7相对应的正常序列的第301位上为G，而突变序列中第301位为A；与SEQNO8相对应的正常序列的第301位为A，而突变序列中缺少A；与SEQNO9相对应的正常序列的第301位上为T，而SEQNO1中第301位为C；与SEQNO10相对应的正常序列的第301位上为C，而突。

31、变序列中第301位为T；与SEQNO11相对应的正常序列的第301位上为C，而突变序列中第301位为T。0097四、显著突变基因的鉴定0098根据外显子组测序中找到的同义突变数量来估计99例样本的背景突变率，其定义公式为所观察到的同义突变率乘以HAPMAP数据库中非同义突变比同义突变的比值14。简而言之，就是根据突变的相邻序列和突变类型，将同义突变分为7个不同的类别。对于每一突变类别I，假设该类突变数目的观测值为MI，该类核苷酸在99例肿瘤样本中成功测序8的总碱基数为NI；那么该类背景突变率BI可计算为BI14MI/NI。0099为了检验某一基因的非沉默突变率非同义突变是否明显高于背景突变率，。

32、采用从外显子测序数据中得到验证的突变数据进行计算。然后，根据SJOBLOM,T等研究者所建立的统计方法来依次估算每个基因可能作为随机突变基因的概率。具体地说，采用二项分布作为统计模型，以BI作为二项分布中事件的成功概率，以此来估算基因G每类突变发生数量的机率PGI。每类突变成功测序的核苷酸数量为99例肿瘤样本中该类突变覆盖深度足够8的核苷酸总数。基因G作为随机突变基因的概率PG值为7类突变的概率之积，即根据GADGETZ等研究者确定的方法，我们采用似然比检验来确定每个基因的P值。我们将显著突变基因定义为在99例样本中至少5例发生突变并且其非同义突变率显著高于背景突变率P001。0100四验证步。

33、骤说明书CN104059966A119/11页120101一、扩大样本验证STAG2基因突变01021、运用PRIMER50PREMIERBIOSOFT设计了33对引物（如SEQNO1277），来独立扩增基因STAG2基因3号到35号外显子之间的编码序列。（按照PRIMER说明书要求）01032、利用DUAL96WELLGENEAMPPCRSYSTEM9700APPLIEDBIOSYSTEMS设备，在另外50例膀胱癌患者的肿瘤组织和匹配的血液样本进行PCR扩增，利用3730XLDNAANALYZERAPPLIEDBIOSYSTEMS系统来对样本进行测序并通过APPLIEDBIOSYSTEMS5。

34、2版本测序分析软件对测序结果进行分析。0104结果如图37所示，表明STAG2在正常组织中没有发现变异，在膀胱癌组织中检测有变异。0105二、通过亚硫酸盐测序对STAG2启动子甲基化进行分析01061、根据亚硫酸盐测序说明书的具体操作步骤，我们利用EPITECTBISULTEKITQIAGEN,HILDEN,GERMANY对99例患者选取30例患者的肿瘤组织和正常组织的基因组DNA进行亚硫酸盐修饰。01072、通过亚硫酸盐测序PCR来测定PROSCAN所预测的STAG2启动子的甲基化状态。亚硫酸盐PCR引物由METHPRIMER33在线程序设计，序列如表3所示SEQNO78NO79；0108表。

35、3BISULTEPCRPRIMERS01090110I将2UL经亚硫酸盐处理过的DNA加入50UL的反应液中，并0111II加入HOTSTARTAQDNA聚合酶QIAGEN,HILDEN,GERMANY后在以下条件下完成扩增反应9510分钟,94中1分钟循环45次,61中45秒，以及72中1分钟，最后72条件下延伸10MIN。0112III将PCR产物纯化后，连接至PMD18T载体。每个样品随机挑选10个白色的克隆进行测序，以确定每一个CPG点的甲基化状态。0113IV运用THEBISMABISULTESEQUENCINGDNAMETHYLATIONANALYSIS软件来确定每一个CPG点的甲。

36、基化状态并展示其甲基化特征。用LOG2倍数比肿瘤组织比正常组织来衡量每一患者共30例STAG2启动子甲基化水平的变化情况。0114V运用卡方检验计算P值并确定差异甲基化的样本。0115结果如表4所示，我们认为甲基化水平10，LOG2倍数比1和PVALUE0001的STAG2启动子为高甲基化。0116表430例肿瘤组织及匹配的正常膀胱癌组织样本中STAG2启动子甲基化状态0117说明书CN104059966A1210/11页1301180119说明书CN104059966A1311/11页140120在新发现的突变基因中，STAG2基因的非同义突变率显著性最高P81011。STAG2基因的非同义。

37、突变率显著高于随机发生的同义突变P002。STAG2是一个位于X染色体上的基因，其编码产物是与细胞周期纺锤体检验点功能相关的聚合体的组成部分，该聚合体在细胞分裂过程中调节姐妹染色单体的分离。如图1和图2所示，11例患者11STAG2基因发生突变，其中9例为截断突变3例小移码插入或缺失，4例无义突变，2例剪接位点突变。0121此外，如图3图7所示，在99例肿瘤中还发现5例STAG2基因发生缺失，ID分别为B16、B9、B80、B83和B8912。0122我们利用SANGER测序在另外50例膀胱癌病人的肿瘤组织及匹配的正常对照中进一步分析了STAG2基因的全部外显子序列，结果在4个肿瘤样品中发现了。

38、5个体细胞突变。我们还采用亚硫酸氢盐测序技术在19例膀胱癌患者中分析了STAG2启动子的甲基化状态。相对于正常样本，我们发现三例肿瘤STAG2启动子甲基化15见上表4。为了明确STAG2变异情况和个体生存之间的联系，我们采用KAPLANMEIER生存分析方法进行分析，发现与野生型个体相比，STAG2体细胞变异的个体预后更差。同样，不论在浅表型或侵入性亚型膀胱癌中，STAG2体细胞突变都与患者生存率显著相关P0001，这提示STAG2突变可能是一个预测膀胱癌预后差的独立因子。先前有研究表明在尤因氏肉瘤、胶质母细胞瘤和黑色素瘤中，STAG2的失活可引起染色单体结合缺陷并导致形成非整倍体。0123以。

39、上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。说明书CN104059966A141/23页1500010002序列表CN104059966A152/23页160003序列表CN104059966A163/23页170004序列表CN104059966A174/23页180005序列表CN104059966A185。

40、/23页190006序列表CN104059966A196/23页200007序列表CN104059966A207/23页210008序列表CN104059966A218/23页220009序列表CN104059966A229/23页230010序列表CN104059966A2310/23页240011序列表CN104059966A2411/23页250012序列表CN104059966A2512/23页260013序列表CN104059966A2613/23页270014序列表CN104059966A2714/23页280015序列表CN104059966A2815/23页290016序列表C。

41、N104059966A2916/23页300017序列表CN104059966A3017/23页310018序列表CN104059966A3118/23页320019序列表CN104059966A3219/23页330020序列表CN104059966A3320/23页340021序列表CN104059966A3421/23页350022序列表CN104059966A3522/23页360023序列表CN104059966A3623/23页37序列表CN104059966A371/3页38图1图2说明书附图CN104059966A382/3页39图3图4图5说明书附图CN104059966A393/3页40图6图7说明书附图CN104059966A40。