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1、10申请公布号CN104195169A43申请公布日20141210CN104195169A21申请号201410438235922申请日20140829C12N15/84200601A01H5/0020060171申请人兰州理工大学地址730050甘肃省兰州市七里河区兰工坪路287号72发明人马建忠刘丹肖成斌马燕林王永刚张伟杰74专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所普通合伙11350代理人汤东凤54发明名称一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法57摘要本发明提供了一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法，首先，利用RTPCR法扩增出了菠菜的硬脂酰基载体蛋白去饱和酶。
2、基因SAD，连接该基因至植物遗传转化载体PBI121上；经核苷酸序列分析克隆并重组正确的载体转化至农杆菌AGROBACTERIUMTUMEFACIENSLBA4404中；含重组质粒的农杆菌以叶盘法转化烟草无菌苗外植体，筛选出卡那霉素抗性植株并移栽于花盆中，生长成熟后收集种子；种子播种于含卡那霉素的MS培养基上使其萌发生长；从卡那霉素抗性植株的叶片提取核DNA进行PCR检测、点杂交及SOUTHERN杂交鉴定；最后，以分子鉴定的阳性转基因烟草作为实验材料，在低温胁迫下，分别进行电导率测定和叶绿素含量测定，转SAD基因烟草的抗寒性有明显的改善。51INTCL权利要求书1页说明书8页附图2页19中华人。
3、民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图2页10申请公布号CN104195169ACN104195169A1/1页21一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法，其特征在于、包括以下步骤1利用RTPCR法扩增出的菠菜硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因连接至植物遗传转化载体PBI121上；2将核苷酸序列测定正确的重组载体转化至农杆菌AGROBACTERIUMTUMEFACIENSLBA4404中并鉴定阳性转化菌落；3将阳性转化子浸染烟草叶盘，形成愈伤组织并分化出芽后，在抗性MS培养基含100MG/LKM，500MG/LCB上进行诱导生根，待根长达数厘米时，移栽于盛有。
4、营养土的花盆中，在自然光下生长；提取卡那霉素抗性植株的叶片DNA进行点杂交及SOUTHERN杂交，确定SAD基因导入的烟草植株；4以SAD基因导入的转基因烟草作为实验材料，20冷冻40分钟后置于室温下，测定叶绿素含量随时间的变化；室温27下培养的转基因烟草移至6生长，测定电导率随时间的变化；以转SAD基因烟草的叶绿素含量和电导率变化判断转基因烟草的抗寒性是否有明显改善。2如权利要求1所述的基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法，其特征在于，在步骤1中，所述RTPCR法扩增所用引物为上游引物5AGATTCGAACAATGGCTCTGAATCTCAACC3，下游引物5AGATCTAGAA。
5、CTCAAAGCTTTACTTG3。权利要求书CN104195169A1/8页3一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法技术领域0001本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法。背景技术0002植物尤其是农作物的抗寒性问题一直是国内外研究的热点。倘若农作物在较低的温度下也能够正常生长，这对农作物抵抗低温寒害、尤其是对防止我国农作物种植中的倒春寒、早霜等农业灾害具有重大的经济意义。0003已有的研究结果表明，植物抵御低温胁迫的能力与植物细胞的膜脂不饱和度呈正相关性，也就是说，膜脂的不饱和度越高，则植物对低温环境的抵抗力越强。硬脂酰基载体。
6、蛋白去饱和酶SAD是植物脂肪酸去饱和代谢过程的关键酶，它催化植物最主要的脂肪酸硬脂酸的第一个去饱和反应，并通过随后的一系列去饱和反应提高植物细胞、尤其是植物细胞膜上的脂酰基的不饱和度，从而提高植物的抗寒能力。0004以往对植物寒害的生理学与生物化学研究阐明了植物遭受寒害的过程与机理，比如，零上低温对植物伤害的主要原发部位是细胞膜、膜脂不饱和度与寒害程度密切相关。然而，目前尚未见国内外通过导入高表达硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因来改良植物抗寒性的报道。发明内容0005本发明的目的在于提供一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法，旨在解决植物在零上低温条件下遭受伤害的问题。0006本发明。
7、是这样实现的，一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法，包括以下步骤00071利用RTPCR法扩增出的菠菜硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因连接至植物遗传转化载体PBI121上；00082将核苷酸序列测定正确的重组载体转化至农杆菌AGROBACTERIUMTUMEFACIENSLBA4404中并鉴定阳性转化菌落；00093将阳性转化子浸染烟草叶盘，形成愈伤组织并分化出芽后，在抗性MS培养基含100MG/LKM，500MG/LCB上进行诱导生根，待根长达数厘米时，移栽于盛有营养土的花盆中，在自然光下生长；提取卡那霉素抗性植株的叶片DNA进行点杂交及SOUTHERN杂交，确定SAD基因导入的。
8、烟草植株；00104以SAD基因导入的转基因烟草作为实验材料，20冷冻40分钟后置于室温下，测定叶绿素含量随时间的变化；室温27下培养的转基因烟草移至6生长，测定电导率随时间的变化；以转SAD基因烟草的叶绿素含量和电导率变化判断转基因烟草的抗寒性是否有明显改善。说明书CN104195169A2/8页40011在步骤1中，所述RTPCR法扩增所用引物为0012上游引物5AGATTCGAACAATGGCTCTGAATCTCAACC3，0013下游引物5AGATCTAGAACTCAAAGCTTTACTTG3。0014本发明利用基因工程技术，提供了一种抗寒性转基因烟草的制备方法，通过将一个能够提高植物。
9、抗寒性的基因即菠菜硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因SAD转化至烟草植株并进行了抗寒性分析。结果表明，构建的转SAD基因烟草的抗寒性具有显著改善。附图说明0015图1是菠菜SAD基因RTPCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1DNA分子量标志BAMHIHINDIIIDIGESTEDDNA；2RTPCR扩增产物。0016图2是重组质粒PBI12113含正向SAD基因，PBI1216含反义SAD基因经酶切后的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1重组质粒PBI12113经XBAI酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；2PBI1216经XBAI酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；3DNA分子量标志BAMHIHINDIIIDIGESTED。
10、DNA。0017图3是卡那霉素抗性烟草植株的DNA点杂交图，以NOS终止子区域为探针。其中，A重组载体PBI12113转化的烟草植株1至6号；B重组载体PBI12113转化的烟草植株8至13号；CAB为重组载体PBI12113转化的烟草植株14至15号；CF为重组载体PBI1216转化的烟草植株1至4号；DAB为重组载体PBI12113转化的样品1至2号；CD为未转化的烟草植株阴性对照，F为PBI121空载质粒转化的烟草植株阳性对照。0018图4是转基因烟草的SOUTHERN杂交分析图。其中，泳道1含有GUSNOSTER片段的阳性对照；泳道2PBI121质粒；泳道3、4、7、8用重组质粒PBI。
11、12113转化的2号、13号、9号、14号植株；泳道5、6、9、10用重组质粒PBI1216转化的3号、4号、1号、2号植株。具体实施方式0019为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。0020实施例1植物遗传转化载体的构建0021硬脂酰基载体蛋白去饱和酶SAD是植物脂肪酸去饱和代谢过程的关键酶，而细胞膜脂的不饱和度又与植物的抗寒性呈正相关。SAD基因在植物中表达较低，SAD酶是硬脂酰去饱和的第一步，也是随后一系列去饱和反应的限速步骤。所以本发明将克隆到的菠菜SAD。
12、基因插入到CAMV的35S启动子下游，构建成可高效表达SAD基因的植物遗传转化载体PBI12113。同时将反义的SAD基因也构建至PBI121，获得重组植物遗传转化载体PBI1216，作为阴性对照。0022首先，用酚/氯仿抽提法提取菠菜总RNA，根据GENBANK的菠菜SAD基因的CDNA序列设计并合成一对特异性引物，用于SAD基因的克隆0023上游引物5AGATTCGAACAATGGCTCTGAATCTCAACC3，0024下游引物5AGATCTAGAACTCAAAGCTTTACTTG3；说明书CN104195169A3/8页50025用合成的这一对引物及提取的菠菜总RNA进行RTPCR扩增。
13、。经08琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条约12KB的扩增产物图1。0026将植物双元表达载体PBI121和纯化后的RTPCR产物分别经CSP45I和XBAI双酶切，用T4DNA连接酶将线性化的载体和PCR产物进行16度过夜连接，再将连接产物转化至大肠杆菌ESCHERICHIACOLIDH5菌株，37培养过夜。次日挑选阳性菌落进行培养、制备重组质粒。重组质粒经酶切后进行08琼脂糖凝胶电泳，检测有无插入片段及片段大小图2。通过对重组质粒上插入的DNA片段进行核苷酸序列测定并与SAD基因序列比对，结果表明扩增出来的DNA片段是SAD基因的CDNA。所得到的重组质粒命名为PBI12113。同时，利用上述方。
14、法，将反义的SAD基因也克隆在PBI121载体上，所得重组质粒命名为PBI1216。0027实施例2PBI121、PBI12113、PBI1216等植物遗传转化载体转化烟草0028取出储存于70冰箱的农杆菌AGROBACTERIUMTUMEFACIENSLBA4404，划线于YEB平板上，28培养，直至长出单菌落。挑取单菌落于5MLYEB培养基中，28，250RPM培养过夜。取2ML接种于40MLYEB中继续培养。约3小时后，倒入预冷的离心管中，冰浴30分钟，6000RPM离心10分钟，沉淀悬浮于1ML01MCACL2溶液中，吸取200L分装于预冷的离心管中，分别加入约800NGPBI121，。
15、PBI12113，PBI1216。冰浴5分钟，置于液氮中8分钟，取出后立即放入37水浴5分钟，加入YEB至1ML，28、250RPM培养45小时，离心，沉淀悬浮于200LYEB中，涂布于含有卡那霉素50G/ML的LB平板上，28培养，直至长出单菌落。挑取单菌落接种于含有卡那霉素50G/ML的液体LB培养基中，待到生长至对数期，提取质粒并电泳检测。0029将上述以冻融法导入了植物遗传转化载体PBI121，PBI12113，PBI1216的农杆菌菌株进行筛选并鉴定阳性转化子。挑取阳性农杆菌单菌落分别接种于5ML含卡那霉素50G/ML的YEB培养基中，28、250RPM培养至OD6000810，离心。
16、收集菌体，用MS培养基洗涤后，调节菌体浓度到OD6000506。将烟草革新29号无菌叶片切成1CM见方小块，浸于不同农杆菌悬液中，57分钟，然后置于MS平板上，28光照培养三天后，将转化处理的叶盘置于MS培养液中，57分钟后，再转到MS平板，25培养，光/暗为12H/12H，直至形成愈伤并分化出芽。将顺利分化出的芽切割并转接至MS固体培养基中，诱导生根，待根长达数厘米时，移栽至盛有营养土的花盆中，于实验室自然光照下使其生长。当长至67片叶时，取植株叶片提取核DNA进行分子鉴定。0030实施例3点杂交及SOUTHERN杂交筛选转基因烟草0031准备杂交用尼龙膜，将尼龙膜用双蒸水浸湿，在2XSSC。
17、溶液中浸泡5分钟，抽滤点样，加150L2XSSC冲洗，待DNA完全干燥，放置在用04MNAOH饱和的滤纸上变性5分钟，然后再用2XSSC饱和的滤纸中和5分钟，80真空烘箱中烤膜1小时，干燥处存放备用。0032将PBI121质粒用BAMHI和ECORI双酶切，电泳检查酶切完全后，用低熔点琼脂糖胶电泳回收GUSNOSTER片段作为探针DNA。探针DNA的放射性标记，采用RANDOMPRIMER方法标记。0033杂交将放射性标记的DNA探针100煮沸5分钟，冰浴冷却，加EDTA至20MM。倒出预杂交液，加入杂交液，加入探针，42杂交1624小时。洗膜与放射自显影弃去杂交液，杂交膜先用2XSSC05S。
18、DS溶液冲洗一次，再在室温下洗涤5分钟，再用2XSSC01说明书CN104195169A4/8页6SDS洗涤5分钟，最后在68于01XSSC05SDS中洗涤30分钟，并用01XSSC洗去SDS，然后用滤纸吸去尼龙膜残留液，包上保鲜膜，压上X光片及增感屏于70放射自显影，23天后显影X光片。0034选取经卡那霉素抗性筛选出来的PBI12113，PBI1216，PBI121转化植株及2株未遗传转化植株做对照，提取叶片DNA并进行点杂交实验。根据点杂交结果图3，选杂交信号最强的PBI12113转化植株的2、13号，PBI1216转化的3、4号提取核DNA做双酶切；PBI12113转化的9、4号和PB。
19、I1216转化的1、2号提取核DNA做单酶切。以GUSNOSTER为探针进行SOUTHERN杂交检测。SOUTHERN杂交结果表明，双酶切样品在20KB的位置有一条杂交带，单酶切样品在不同位置有多条杂交带图4。说明这些植物是转基因植物，且为多个拷贝。0035实施例4对照烟草和转SAD基因烟草的抗寒性分析0036电导率变化测定将SOUTHERN杂交呈阳性的62，63，64，139，1315，1314植株及未经遗传转化的植株对照，从室温约27、光下移至6、黑暗的培养箱中。分别于40小时、88小时后测室温下和低温下植株的电导率。然后将植株转移至室温约27，自然光下，48小时后测电导率。0037取大小。
20、相近的叶片，用打孔器打取1015个小圆片，放入10MLDDH2O中，斜放在摇床上摇1H，测电导，然后沸水煮15分钟，冷却后测电导，以煮沸前电导值占煮沸后电导值的百分率为每种植物的相对电导率。0038叶绿素含量测定从SOUTHERN杂交呈阳性的62，63，64，139，1315，1314植株及未经遗传转化的植株对照上，各剪取大小，叶龄一致的两片叶子，放入一次性使用的薄膜手套中，封口。其中一片置于20冷冻40分钟，取出后放于室温约27下，另一片叶保持于室温下作对照。4天后测叶绿素含量。0039取1G左右叶片组织，加少量CACO3及80的丙酮，研磨至匀浆，过滤。再用80丙酮洗研钵数次并将洗液过滤合并。
21、，用80丙酮定容滤液至10ML。在652NM波长下测OD值，计算叶绿素的总量。比较各组叶绿素含量的变化。0040低温处理前各组烟草叶片的相对电导率基本一致。6度下40小时后，各组的电导率出现差异、但相对较小。低温处理88小时后，对照组和PBI1216转化植株组的相对电导率都明显升高。而PBI12113转化植株组的相对导电率始终保持在较低的水平表1。0041表1不同温度下对照组和处理组的电导率0042说明书CN104195169A5/8页70043注CK1、CK2未进行遗传转化的1号、2号植株；139、1314、1315用重组质粒PBI12113转化的9号、14号、15号植株；62、63、64用。
22、重组质粒PBI1216转化的2号、3号、4号植株0044将烟草叶片经短暂冷冻20，40分钟处理后，置于室温下4天，测定叶绿素含量在处理和非处理烟叶中的差异。尽管有些个体差异，但PBI12113转化植株的总叶绿素损失量明显低于对照和PBI1216转化植株表2。0045表2各组烟草叶片在冷冻处理前后叶绿素含量的差异0046各处理组处理前处理后处理后/处理前CK11423047673350CK22271076533370CK32471063422567CK419270560429081313188609639511113216650825497313142161079953699说明书CN10419。
23、5169A6/8页8131526020686726396123370631527026224630448518216326180790530196423380418217890047注13PBI12113；6PBI12160048从表1和表2的实验数据可以看出，PBI12113遗传转化的转基因植株高表达正义SAD基因组的抗寒性明显优于未经遗传转化的对照组和PBI1216遗传转化的转基因植株高表达反义SAD基因组。因此，本发明从正、反两个方面，证明了增强SAD基因在植物体内的表达，可以显著改善植物的抗寒性。0049与现有技术的缺点和不足相比，本发明具有以下有益效果为获得抗寒高产作物品种，常规方法。
24、杂交育种耗时长，盲目性大。以基因工程技术定向改造植物抗寒性是国际基因工程研究的一个重要和热门领域。长期以来，已知植物的抗寒性与植物细胞膜脂不饱和度呈正相关，但如何提高植物的膜脂不饱和度进而改善植物的抗寒性仍是目前基因工程与分子生物学探索的课题。在所有的高等植物脂肪酸去饱和酶中，硬脂酰基载体蛋白去饱和酶SAD是目前唯一鉴定的可溶性的脂质去饱和酶，而SAD是不饱和脂肪酸合成的第一步，其活性高低是决定植物细胞中饱和与不饱和脂肪酸比例的一个关键因素。目前还未见有关转SAD基因植物与抗寒性关系的报道。实验证明，本发明构建的转SAD基因烟草可明显地改善其抗寒性。0050以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。0051说明书CN104195169A7/8页90052说明书CN104195169A8/8页10说明书CN104195169A101/2页11图1图2图3说明书附图CN104195169A112/2页12图4说明书附图CN104195169A12。