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1、10申请公布号CN104212812A43申请公布日20141217CN104212812A21申请号201410473378322申请日20140917C12N15/12200601C07K14/47200601A01K67/02720060171申请人山东农业大学地址271018山东省泰安市岱宗大街61号72发明人王建民刘冠卿张赛赛晁天乐王桂芝纪志宾刘昭华侯磊54发明名称一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的CSRP3基因及其应用57摘要本发明属于生物技术领域，特别提供了一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的CSRP3基因CDNA序列及其克隆方法，该基因的CDNA序列如SEQIDNO1所示，其编码的氨基酸。
2、序列如SEQIDNO2所示；应用该基因可以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生长速度快、肌肉品质好的绵羊品种奠定基础，对养羊业生产具有较高的指导意义。51INTCL权利要求书1页说明书8页序列表5页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页序列表5页附图2页10申请公布号CN104212812ACN104212812A1/1页21一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的CSRP3基因，其特征在于其CDNA序列如SEQIDNO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。2根据权利要求1所述的CSRP3基因，其特征在于其来源于绵羊的富含半胱氨酸蛋白3基因。3。
3、根据权利要求1所述的调控骨骼肌生长的CSRP3基因，在绵羊育种中的应用。4根据权利要求3所述的应用，其特征在于通过调控CSRP3基因的表达，为培育生长速度快、肌肉品质好的绵羊品种提供科学依据。权利要求书CN104212812A1/8页3一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的CSRP3基因及其应用技术领域0001本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的CSRP3基因及其在绵羊育种中的应用。背景技术0002羊肉肉质细嫩，脂肪和胆固醇含量低，逐渐受到人们的青睐。随着羊肉价格的逐渐盘升，提高羊只生长速度、改善羊肉品质对提高动物生产者的经济效益、满足广大消费者对优质羊肉的需求。
4、具有重大意义。0003CRP家族是LIM结构域蛋白中一类蛋白家族，有四个成员分别是CRP1、CRP2、CRP3、TLPWEISKIRCHENETAL,1995；KIRCHNERETAL,2001，其中CRP3蛋白的编码基因CSRP3CYSTEINEANDGLYCINERICHPROTEIN3特异性表达于心肌和骨骼肌中。CSRP3基因在肌肉生长发育过程中起重要作用，研究表明CSRP3基因富含半胱氨酸蛋白3基因又叫肌肉特异性LIM蛋白MUSCLELIMPROTEIN，MLP是一个肌肉分化的正调节因子ARBERETAL,1994。研究还发现该基因在骨骼肌卫星细胞中作用时期为快肌纤维的早期阶段表达调控。
5、，并且发现在增殖速度较慢的成肌细胞中高表达，因而认为该基因可能具有影响成肌细胞增殖而促进肌细胞的分化的功能。另外，CRP3蛋白可以通过某种物理方式与肌肉组织的螺旋环螺旋BHLH转录因子发生作用，这种作用具有高度的特异性，即CRP3蛋白不与非肌肉组织的BHLH蛋白或其他成肌因子发生作用KONGETAL,1997，表明该基因具有表达特异性。0004但到目前为止，尚未见到有关小尾寒羊CSRP3基因克隆和功能的研究报道，而其对于肌肉生长和发育的调控作用更是未知。发明内容0005基于上述的原因，本发明提供了一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的CSRP3基因，其CDNA序列如SEQIDNO1所示，全长899B。
6、P；该序列中的开放阅读框编码氨基酸序列如SEQIDNO2所示，共编码194个氨基酸；该基因具有调控骨骼肌生长的功能，应用该基因可以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生长速度快、肌肉品质好的绵羊品种奠定基础，对养羊业生产有较高的现实意义。0006本发明所提供的调控骨骼肌生长的CSRP3基因，CDNA序列如SEQIDNO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示，CSRP3的CDNA序列长899BP，该序列中的开放阅读框编码194个氨基酸。0007上述的CSRP3基因是通过如下方法获得的00081小尾寒羊肌肉总RNA的提取和反转录0009采用TRIZOL法提取小尾寒羊肌肉组织总RNA。
7、，提取的总RNA用核酸蛋白分析仪进行检测，要求总RNA吸光度OD260/280在18至20之间，并根据现有技术采用TAKARA公司的RRIMESCRIPTTMRTREAGENTKIT试剂盒反转录合成CDNA第一链；说明书CN104212812A2/8页400102CSRP3基因CDNA序列保守区的扩增0011比对已有物种CSRP3基因的CDNA序列，根据保守区设计上下游引物，以步骤1中的CDNA第一链为模板进行PCR扩增，克隆测序得到保守区序列；00123应用降落巢式PCR法对CSRP3基因CDNA序列的3端进行扩增0013根据步骤2所得保守区序列设计CSRP3基因的3特异性内侧和外侧引物；0。
8、014以步骤1中提取的总RNA为模板，以OLIGODTAP为引物，反转录获得CDNA第一链模板；0015以3特异性外侧引物和3通用外侧引物采用降落PCR法以步骤3中CDNA第一链为模板进行第一轮PCR扩增；0016以3特异性内侧引物和3通用内侧引物采用同样降落PCR法，以第一轮PCR扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增；0017对第二轮PCR产物经克隆测序得到CSRP3基因CDNA序列的3端序列；00184应用RACE法对CSRP3基因CDNA序列的5端进行扩增0019以步骤1中提取的总RNA为模板依次进行去磷酸化处理、“去帽子”反应、接头序列连接反应并以TAKARA公司的5FULLRACEKI。
9、TWITHTAP试剂盒反转录合成CDNA的第一链；0020根据步骤2所得保守区序列设计CSRP3基因的5特异性内侧和外侧引物；0021以5特异性外侧和5通用外侧引物，以步骤4中得到的CDNA第一链为模板进行第一轮PCR扩增；0022以5特异性内侧和5通用内侧引物，以第一轮PCR扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增；0023对第二轮PCR产物经克隆测序得到CSRP3基因CDNA序列的5端序列；00245全长序列拼接及克隆测序验证0025根据重叠区域对上述步骤获得的CDNA的保守区、5和3所得序列进行拼接，获得CSRP3基因的全长CDNA序列；设计两端序列为上下游引物，PCR扩增并克隆测序得到CS。
10、RP3基因的全长CDNA序列，获得了CSRP3的CDNA序列如SEQIDNO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0026之后发明人利用QRTPCR法测定CSRP3基因CDNA序列在小尾寒羊心、肝、肌肉等组织间的表达量，并最终发现CSRP3在心肌和背最长肌中的表达量均极显著高于其他组织P001，表明该基因具有调控骨骼肌生长的功能。0027综上所述，本发明提供了一种可以调控骨骼肌生长的CSRP3基因，该基因具有调控骨骼肌生长的功能，应用该基因可以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生长速度快、肌肉品质好的绵羊品种奠定基础，具有较高的现实意义。附图说明0028图1为本发明中小尾寒。
11、羊CSRP3基因CDNA保守区扩增图，0029图中M为DL2000分子量标准；1为CSRP3基因CDNA保守区序列；0030图2为本发明中小尾寒羊CSRP3基因3端扩增图，0031图中M为DL2000分子量标准；1为CSRP3基因3端序列；说明书CN104212812A3/8页50032图3为本发明中小尾寒羊CSRP3基因5RACE扩增图，0033图中M为DL2000分子量标准；1为CSRP3基因5端序列；0034图4为本发明中小尾寒羊CSRP3基因CDNA全长序列扩增图，0035图中M为DL2000分子量标准；1为CSRP3的全长CDNA序列；0036图5为本发明中CSRP3基因MRNA在小。
12、尾寒羊不同组织中表达水平柱状图,0037图中A、B、C表示小尾寒羊各组织间的差异极显著性P001；由图可见CSRP3主要在心肌和背最长肌中表达。具体实施方式0038以下结合附图对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。应理解，这些实施例仅为了说明本发明而不是为了限制本发明的保护范围。0039下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的实验条件或常规方法，如SAMBROOK等编著的分子克隆实验手册NEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS,1989中所述的条件。0040实施例1背最长肌总RNA的提取及反转录0041取小尾寒羊背最长肌2G，使用T。
13、IANGEN公司的RNASIMPLETOTALRNAKIT总RNA提取试剂盒CATDP419提取肌肉组织的总RNA，具体操作参照试剂盒说明进行；将提取的RNA采用TAKARA公司的RRIMESCRIPTTMRTREAGENTKITCATRR037A反转录合成CDNA第一链，20保存备用。0042实施例2CDNA保守区序列的克隆与测序00431引物的设计从NCBI上下载人、猪、牛、鼠等各物种CSRP3基因的CDNA序列，以DNAMAN60软件进行比对获得保守区序列，设计该基因CDNA的保守区引物为上游引物F1AATACGGAGCCTGCGAGAA，如SEQIDNO3所示，和下游引物R10044C。
14、CCCAAACCCAATACCTGTC，如SEQIDNO4所示。00452PCR扩增以实施例1获得的CDNA第一链为模板，应用TIANGEN的PCRMASTERMIXKT201体系进行PCR扩增，具体如下00460047保守区PCR扩增条件943MIN；9430SEC，5730SEC，723MIN35CYCLES；7210MIN；4。获得保守区序列，扩增结果见附图1；为了验证获得的条带是否是保守区目标序列进行如下步骤37；00483扩增条带胶回收PCR扩增产物经1琼脂糖凝胶电泳后，切取相应条带；采用AXYPREPDNA凝胶回收试剂盒0691对PCR胶回收产物进行纯化回收；00494连接PMD1。
15、8T载体与步骤3中回收产物的摩尔比控制在1318；依TAKARA公司PMD18T载体试剂盒说明书NO6011进行连接反应。说明书CN104212812A4/8页600505连接产物转化取5L连接产物，依TIANGEN公司大肠杆菌感受态细胞DH5CB101使用说明进行转化及细菌的培养操作；00516菌液PCR鉴定吸取1L菌液作模板，依据2中PCR扩增条件进行扩增，1琼脂糖凝胶电泳检测目的条带；00527克隆产物测序分析吸取1ML步骤6中获得的阳性菌液送SANGONBIOTECH公司测序分析，经测序得到序列长为528BP的CDNA保守区目标序列。0053实施例3CDNA3端序列的克隆与测序0054。
16、采用降落巢式PCR法克隆CDNA序列的3端，具体步骤如下00551引物的设计与合成根据实施例2所得CSRP3基因CDNA保守区的测序结果，设计两条上游嵌套式引物，3GSPTTGGAGCATCGGAGAAGTG，如SEQIDNO5所示，和3NGSPTGAGAAGGTGATGGGCGGTGGT，如SEQIDNO6所示；并合成两条下游3通用引物，3UPGACTCGAGTCGATCGA，如SEQIDNO7所示，和OLIGODTAPGACTCGAGTCGATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT，如SEQIDNO8所示；00562反转录合成CDNA第一链取4L实施例1中提取的总RNA，利用实施例1中。
17、反转录试剂盒，加入OLIGODTAP为反转录引物反转录合成CDNA第一链；00573外侧PCR扩增以3GSP和3UP为上下游引物，以步骤2中的CDNA第一链为模板，依TAKARA公司HSDNAPOLYMERASEPCR反应试剂盒NOR010A体系进行，具体如下00580059降落PCR扩增条件9830S；9810S，7030S，7230S3CYCLES；9810S，6830S，7230S4CYCLES；9810S，6630S，7230S5CYCLES；9810S，6430S，7230S6CYCLES；9810S，6230S，7230S8CYCLES；9810S，6030S，7230S10CYC。
18、LES；7210MIN；4；00604内侧PCR扩增以3NGSP和3UP为上下游引物，步骤3的扩增产物为模板，依上述步骤3中反应条件和扩增程序进行PCR扩增，得到3端目标序列，扩增结果见附图2；00615扩增条带胶回收PCR扩增产物经1琼脂糖凝胶电泳后，切取相应条带；采用AXYPREPDNA凝胶回收试剂盒0691对PCR胶回收产物进行纯化回收；00626连接PJET12载体与步骤5中回收产物的摩尔比控制在1318；依THERMOSCIENTICFERMENTAS公司CLONEJETTMPCRCLONINGKIT试剂盒说明书进行连接反应。00637连接产物转化取5L连接产物，依TIANGEN公司。
19、的大肠杆菌感受态细胞说明书CN104212812A5/8页7DH5CB101使用说明进行转化及细菌的培养操作；00648菌液PCR鉴定吸取1L菌液作模板，依据步骤3中PCR扩增条件进行扩增，1琼脂糖凝胶电泳检测目的条带；00659PCR产物的克隆测序吸取1ML步骤8中获得的阳性菌液送SANGONBIOTECH公司测序分析，经测序得到序列长为449BP的CDNA3端目标序列。0066实施例4CDNA5端序列的克隆与测序0067采用RACE法克隆5端序列，步骤如下00681引物的设计与合成根据实施例2所得CSRP3基因CDNA保守区的测序结果，设计两条下游嵌套式引物，5GSPAACTTGGAAGG。
20、GTTGCTG，如SEQIDNO9所示，和5NGSPTGCTTTGGGGACTGTTGG，如SEQIDNO10所示；并合成两条上游5通用引物，5OUTERPRIMERCATGGCTACATGCTGACAGCCTA，如SEQIDNO11所示，和5INNERPRIMERCGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG，如SEQIDNO12所示；00692去磷酸化处理0070配制去磷酸反应液00710072混匀，50反应1H；0073加入20LCH3COONA3MOL/L，PH52，然后加入130L的RNASEFREEDDH2O后轻轻混匀。随后加入200L苯酚/氯仿/异戊醇252。
21、41，混匀后于室温13000G离心5MIN，取上层水相；0074加入02ML氯仿，吹打混匀后于室温13000G离心5MIN，取上层水相；0075加入2LNACARRIER后均匀混匀，再加入02ML异丙醇，混匀后冰上冷却10MIN，随后13000G4离心20MIN，弃上清；0076加入500L的预冷的70乙醇进行漂洗，13000G4离心5MIN，弃上清后，室温放置2MIN充分干燥；0077加入7LRNASEFREEDDH2O溶解沉淀，得到CIAPTREATEDRNA。00783“去帽子”反应0079配制“去帽子”反应液00800081将上述试剂混匀，37，反应1H，得到CIAP/TAPTREAT。
22、ED的RNA。说明书CN104212812A6/8页8008245RACE接头的连接0083依下表配制溶液0084008565保温5MIN后，放置2MIN冰上，然后加入下述试剂0086008716，反应1H；0088加入20L的CH3COONA3MOL/L，PH52于以上反应液中，然后加入140L的RNASEFREEDDH2O，再加200L苯酚/氯仿/异戊醇25241，吹打混匀后于室温、13000G离心5MIN；0089取出上层水相，加入200L氯仿，充分混匀后于13000G离心5MIN，取上层水相加入2LNACARRIER后均匀混匀，再加入200L异丙醇，混匀后于冰上冷却10MIN；0090。
23、13000G4离心20MIN，弃上清。加入500L预冷的70乙醇漂洗，13000G4离心5MIN，弃上清后干燥；加入6LRNASEFREEDDH2O溶解沉淀，得到LIGATEDRNA。00915反转录合成CDNA第一链0092反转录体系为00930094混匀后3010MIN；421H；7015MIN，生成反转录产物，20保存备用。00956外侧PCR扩增以5OUTERPRIMER和5GSP为上下游引物，以5中反转录合成的CDNA第一链为模板，扩增体系为0096说明书CN104212812A7/8页90097扩增程序为943MIN；9430S，5530S，7230S20CYCLES；7210MI。
24、N；4；00986内侧PCR扩增以外侧PCR产物为模板，扩增体系为00990100扩增程序为943MIN；9430S，5530S，7230S30CYCLES；7210MIN；4。反应结束后，取5LPCR反应液进行电泳检测，扩增结果见附图3。01018PCR产物的克隆测序扩增条带的回收、与载体连接、连接产物的转化及测序同实施例2，经测序得到长为355BP的CDNA5端目的序列。0102实施例5全长CDNA序列的拼接与克隆测序0103根据重叠区域对实施例2、3和4中所得序列进行常规拼接，设计两端序列为上下游引物，上游引物F4AAAGCTGAGCCGACAGA,如SEQIDNO13所示，和下游引物R。
25、4GTTTTGGACTTGAGTGT，如SEQIDNO14所示，以实施例1中的CDNA第一链为模板，经PCR扩增、克隆测序同实施例2，获得CSRP3基因的CDNA全长序列；序列全长为899BP，序列见SEQIDNO1。0104实施例6CDNA编码蛋白的氨基酸序列分析0105登录HTTP/GENESMITEDU/GENSCANHTML分析CSRP3的CDNA序列，确定它们编码蛋白的氨基酸序列。CSRP3的编码区编码194个氨基酸，具有如SEQIDNO2所述的氨基酸序列。0106实施例7小尾寒羊各组织中CSRP3基因的表达分析01071小尾寒羊组织采集选取小尾寒羊周岁母羊三只，分别取心、肝、肺、肾。
26、、背最长肌、脂肪、卵巢和血管组织23G，立即投入液氮保存备用。01082组织RNA的提取及反转录取步骤1各种组织200MG，总RNA提取及反转录合成CDNA第一链方法同实施例1。01093设计引物说明根据实施例5中的全长CDNA序列设计荧光定量引物，引物扩增片段长度为80200BP，引物序列如下说明书CN104212812A8/8页10011001114QRTPCR反应以GAPDH为内参基因，依照TAKARA公司的PREMIXEXTAQTMDRR081A说明书加样，反应体系为15L，具体成份如下01120113将上述试剂混匀，所有反应重复三份，采用SYBRGREENI染料法在MX3000P荧光。
27、定量仪上以两步法进行PCR扩增9510MIN；40CYCLES9530S，6030S，7220S。01145结果的分析统计反应结果经MX3000P配套软件对所得CT值进行初步分析。每个基因表达的相对值根据标准曲线运用2CT法进行计算，基因的表达水平表示为2CTSE。用SAS92软件中的ONEWAYANOVA法进行差异显著性分析，差异显著性表达水平为P005和差异极显著水平为P001。小尾寒羊各组织CSRP3MRNA表达水平见附图5。结果显示CSRP3在除肺之外的组织中均有表达，在心肌和背最长肌中大量表达且极显著高于其他组织P001。表明该基因具有调控骨骼肌生长的功能。0115定量PCR结果表明。
28、，CSRP3基因在小尾寒羊各组织间呈特异性表达，在心肌中表达量最高，其次为背最长肌，说明通过调控CSRP3基因的表达量增加，可以促进肌肉的生长，应用于分子育种领域，对培育生长速度快、肉质品质好的绵羊新品种具有重要的意义。说明书CN104212812A101/5页1100010002序列表CN104212812A112/5页120003序列表CN104212812A123/5页130004序列表CN104212812A134/5页140005序列表CN104212812A145/5页15序列表CN104212812A151/2页16图1图2图3图4说明书附图CN104212812A162/2页17图5说明书附图CN104212812A17。