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1、10申请公布号CN104212811A43申请公布日20141217CN104212811A21申请号201410472965022申请日20140917C12N15/12200601C07K14/47200601A01K67/02720060171申请人山东农业大学地址271018山东省泰安市岱宗大街61号72发明人王建民张春兰刘冠卿纪志宾秦孜娟王桂芝54发明名称一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL3基因及其应用57摘要本发明属于生物技术领域，提供了一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL3基因CDNA序列的克隆方法，该基因的CDNA序列如SEQIDNO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所。
2、示。应用该基因可以通过对其表达调控进行操作，为实现培育生长速度快的绵羊品种奠定基础，具有重要的现实意义。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表6页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表6页附图2页10申请公布号CN104212811ACN104212811A1/1页21一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL3基因，其特征在于具有如SEQIDNO1所示的CDNA序列，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。2根据权利要求1所述的MYL3基因，其特征在于其来源于小尾寒羊骨骼肌的肌球蛋白轻链3。3权利要求1所述的调控骨骼肌生长的MYL3基因，在绵羊。
3、育种中的应用。4根据权利要求3所述的应用，其特征在于通过对MYL3基因的调控实现培育生长速度快的绵羊育种。权利要求书CN104212811A1/7页3一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL3基因及其应用技术领域0001本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL3基因及其在绵羊育种中的应用。背景技术0002肌球蛋白轻链3MYL3为肌球蛋白轻链家族中的一员，是一种基本性轻链，对肌球蛋白构型的维系起主要作用，主要在骨骼肌快肌中表达。研究发现该基因在斑马鱼的骨骼肌卫星细胞分化为快肌纤维的早期阶段表达，并且发现在增殖速度较慢的成肌细胞中高表达，因而认为该基因可能具有。
4、抑制成肌细胞增殖而促进肌细胞的分化的功能。目前，在绵羊基因组中可见MYL3基因的预测序列，还未见到该基因的确切序列报道，并且关于该基因对肌肉生长和发育的调控机制还不清楚。发明内容0003基于上述的原因，本发明提供了一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL3基因，其CDNA序列如SEQIDNO1所示，除POLYA外长为925BP；该序列中的开放读码框编码199个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO2所示。该基因具有调控骨骼肌生长的功能，应用该基因可以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生长速度快的绵羊品种奠定基础，具有重要的现实意义。0004本发明所提供的调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL3基因，。
5、其CDNA序列如SEQIDNO1所示，除POLYA外长为925BP；该序列中的开放读码框编码199个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0005上述的MYL3基因是通过如下方法获得的00061小尾寒羊肌肉总RNA的提取和反转录0007采用TRIZOL法提取小尾寒羊肌肉组织总RNA，提取的RNA以AGILENT2100BIOANALYZER进行检测，要求总RNA含量在10G以上且RINRNA完整性指标75，并根据现有技术经ROCHE公司的CDNA反转录试剂盒反转录合成CDNA第一链；00082MYL3基因CDNA序列保守区的扩增0009比对已有物种MYL3基因的CDNA序列，根据保守区设计。
6、上下游引物，以步骤1中的CDNA第一链为模板进行PCR扩增克隆测序得到保守区序列；00103应用3降落巢式PCR法对MYL3基因CDNA序列的3端进行扩增0011根据所得保守区序列设计MYL3基因的3特异内侧和外侧引物；0012以3特异外侧引物和3通用外侧引物采用退火温度逐渐降落法对上述CDNA第一链进行第一轮PCR扩增；0013然后以3特异内侧引物和3通用内侧引物采用同样的退火温度逐渐降落法对第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增；0014对第二轮PCR产物经克隆测序得到MYL3基因CDNA序列的3端序列；说明书CN104212811A2/7页400154应用5RACE法对MYL3基因CD。
7、NA序列的5端进行扩增0016对小尾寒羊肌肉组织经TRIZOL法所提总RNA依次进行常规的去磷酸化处理、“去帽子”反应、与接头序列连接并以TAKARA公司的5FULLRACEKITWITHTAP试剂盒反转录合成CDNA的第一链；0017根据所得保守区序列设计MYL3基因的5特异外侧和特异内侧引物；0018以5特异外侧和5通用外侧引物进行第一轮PCR扩增；0019以5特异内侧和5通用内侧引物进行第二轮PCR扩增；0020内侧PCR产物经克隆测序得到MYL3基因CDNA序列的5端序列；00215全长序列拼接及克隆测序验证0022根据重叠区域对上述步骤获得的CDNA的保守区、5和3所得序列进行拼接，。
8、获得MYL3基因的全长CDNA序列；设计两端序列为上下游引物，PCR扩增并克隆测序得到MYL3基因的全长CDNA序列,具有如SEQIDNO1的核苷酸序列。0023对该CDNA序列进行生物信息学分析，得到该基因编码产生含有199个氨基酸的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0024之后发明人利用QRTPCR法测定MYL3基因在小尾寒羊心、肝、肌肉等组织中的表达量，发现该基因主要在小尾寒羊的心肌和背最长肌中表达，表明该基因具有调控骨骼肌生长的功能。0025综上所述，本发明提供了一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL3基因，该基因具有调控骨骼肌生长的功能，应用该基因可以通过对该基因的表达调控。
9、进行操作，为实现培育生长速度快的绵羊品种奠定基础。附图说明0026图1为本发明中小尾寒羊MYL3基因CDNA保守区扩增图，0027图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL3基因CDNA保守区序列；0028图2为本发明中小尾寒羊MYL3基因3端扩增图，0029图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL3基因CDNA的3端序列；0030图3为本发明中小尾寒羊MYL3基因5RACE扩增图，0031图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL3基因CDNA的5端序列；0032图4为本发明中小尾寒羊MYL3基因CDNA全长序列扩增图，0033图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL3的。
10、全长CDNA序列；0034图5为本发明中MYL3在小尾寒羊不同组织中的表达水平柱状图，0035图中A、B、C表示小尾寒羊各组织间的差异显著性P005；MYL3主要在心肌和背最长肌中表达。具体实施方式0036以下结合附图对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。应理解，这些实施例仅为了说明本发明而不是为了限制本发明的保护范围。0037下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的实验条件或常规方法，如SAMBROOK等编著的分子克隆实验手册NEWYORKCOLDSPRINGHARBOR说明书CN104212811A3/7页5LABORATORYPRESS,1989中所述的条件。0。
11、038实施例1小尾寒羊背最长肌组织总RNA的提取及反转录0039取小尾寒羊背最长肌约20G，使用康为世纪公司的总RNA提取试剂盒NOCW0580提取肌肉组织的总RNA；将提取的RNA采用ROCHE公司的CDNA反转录试剂盒NO05081955001反转录合成CDNA第一链，20保存备用。0040实施例2CDNA保守区序列的克隆与测序00411引物的设计从NCBI上下载人、猪、牛、鼠等各物种MYL3基因的CDNA序列，以DNAMAN60软件进行比对获得保守区序列，设计该基因CDNA的保守区引物为F1GGAGGCTCACCTACCCTG，如SEQIDNO3所示，和F2GCCATGATGTGCTTG。
12、ACAAATGC，如SEQIDNO4所示；00422PCR扩增以实施例1获得的CDNA第一链为模板，采用TIANGEN的PCRMASTERMIX试剂盒KT201进行PCR扩增；50L扩增体系中包含PCRMASTERMIX25L；F1102L；F2102L；CDNA第一链2L。扩增条件为94，5MIN；9430S，5830S，721MIN35CYCLES；72，10MIN。扩增结果见附图1；00433扩增条带的回收PCR扩增产物经1琼脂糖的TAE凝胶进行电泳凝，切取相应条带；采用AXYPREPDNA凝胶回收试剂盒0691对PCR产物进行纯化回收；00444回收产物与载体连接载体与片段的摩尔比控制。
13、在1318；根据扩增产物回收后凝胶电泳情况将回收产物稀释至标准浓度，依PMD18T载体试剂盒说明书NO6011进行连接反应。00455连接产物的转化取适量连接产物，依TIANGEN公司的大肠杆菌感受态细胞DH5CB101使用说明进行转化及细菌的培养操作；00466菌液PCR鉴定吸取12L菌液作模板，依据2中PCR扩增体系和条件进行扩增，1琼脂糖凝胶电泳检测目的条带；00477克隆产物的测序分析如果凝胶检测含有目的条带且较纯，则吸取1ML菌液测序分析，得到长为658BP的一条保守区目标序列。0048实施例3CDNA3端序列的克隆与测序0049采用降落巢式PCR法克隆CDNA序列的3端，具体步骤如。
14、下00501引物的设计与合成根据实施例2所得MYL3基因CDNA保守区的测序结果，设计两条上游嵌套式引物，3GSPGGACACCGGCACCTATGAGGAC，如SEQIDNO5所示，和3NGSPGAGAAGCTGATGGCGGGGCAAG，如SEQIDNO6所示；并合成两条下游3通用引物，3UPGACTCGAGTCGATCGA，如SEQIDNO7所示，和OLIGODTAPGACTCGAGTCGATCGAT18，如SEQIDNO8所示。00512反转录合成CDNA第一链取100PG1G实施例1中提取的RNA，加入OLIGODTAP为反转录引物反转录合成CDNA第一链；00523外侧PCR扩增以。
15、3GSP和OLIGODTAP为上下游引物，依实施例2中PCR反应试剂盒体系进行，扩增程序为98，30S；98，10S；70，30S；72，30S3CYCLES；98，10S；68，30S；72，30S4CYCLES；98，10S；66，30S；72，30S5CYCLES；98，10S；64，30S；72，30S6CYCLES；98，10S；62，30S；72，30S8CYCLES；98，10S；60，30S；72，30S10CYCLES；72，10MIN；4；说明书CN104212811A4/7页600534内侧PCR扩增以3NGSP和3UP为上下游引物，步骤3的扩增产物稀释30倍为模板，依上。
16、述步骤3中反应条件和扩增程序进行目的条带的扩增，扩增结果见附图2；00545PCR产物的克隆测序扩增条带的回收、与载体连接、连接产物的转化及测序同实施例2，得到长为341BP的一条序列。0055实施例4CDNA5端序列的克隆与测序0056采用5RACE法克隆5端序列，步骤如下00571引物的设计与合成根据实施例3所得MYL3基因CDNA保守区的测序结果，设计两条下游嵌套式引物，5GSPGTTCTTGGAGATGTGCTGGA，如SEQIDNO9所示，和5NGSPCGTGATCTTCATCTCGCACTTG，如SEQIDNO10所示；并合成两条上游5通用引物，5OUTERPRIMERCATGGC。
17、TACATGCTGACAGCCTA，如SEQIDNO11所示，和5INNERPRIMERCGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG，如SEQIDNO12所示。00582MRNA的去磷酸化处理0059配制去磷酸反应液00600061混匀，50反应1H；0062加入20LCH3COONA3MOL/L，PH52，然后加入130L的无RNASE水后轻轻混匀。并加入200L苯酚/氯仿/异戊醇25241，混匀后于室温13000G离心5MIN，取上层水相；0063加入02ML氯仿，吹打混匀后于室温13000G离心5MIN；0064取上层水相加入2LNACARRIER后均匀混匀，再加。
18、入02ML异丙醇，混匀后冷却10MIN于冰上，并于4，13000G离心20MIN，弃上清；0065加入500L的预冷的70乙醇进行漂洗，13000G离心5MIN4，弃上清后开盖于室温放置2MIN充分干燥；0066加入7L无RNASE水溶解沉淀，得到CIAPTREATEDRNA。00673“去帽子”反应0068配制“去帽子”反应液0069说明书CN104212811A5/7页70070将上述试剂混匀，37，反应1H，得到CIAP/TAPTREATED的RNA。007145RACE接头的连接0072依下表配制溶液0073007465保温5MIN后，放置2MIN冰上，然后加入下述试剂00750076。
19、16，反应1H；0077加入20L的CH3COONA3MOL/L，PH52于以上反应液中，然后加入140L的无RNASE水，再加200L苯酚/氯仿/异戊醇25241，吹打混匀后于室温、13000G离心5MIN；0078取出上层水相，加入200L氯仿，充分混匀后于13000G离心5MIN，取上层水相加入2LNACARRIER后均匀混匀，再加入200L异丙醇，混匀后于冰上冷却10MIN；00794，13000G离心20MIN，弃上清。加入500L预冷的70乙醇漂洗，13000G于4离心5MIN，弃上清后干燥；0080加入6LFREERNASE水溶解沉淀，得到LIGATEDRNA。00815反转录合。
20、成CDNA第一链0082反转录体系为0083说明书CN104212811A6/7页80084混匀后于30反应10MIN，然后于42反应1H后70反应15MIN生成反转录产物，20保存备用。00856外侧PCR扩增以5OUTERPRIMER和5GSP为上下游引物，以5中反转录合成的CDNA第一链为模板，扩增体系为00860087扩增程序为94，3MIN；94，30S；55，30S；72，30S20CYCLES；72，10MIN；4；00887内侧PCR扩增以外侧PCR产物为模板，扩增体系为00890090扩增程序为94，3MIN；94，30S；55，30S；72，30S30CYCLES；72，1。
21、0MIN；4。反应结束后，取35LPCR反应液进行电泳检测，扩增结果见附图3，产生了大小不同的两条带。00918PCR产物的克隆测序扩增条带的回收、与载体连接、连接产物的转化及测序同实施例2，经测序得到281BP的一条序列。0092实施例5全长CDNA序列的拼接与克隆测序0093根据重叠区域对实施例2、3和4中所得序列进行常规拼接，设计两端序列为上下游引物，引物序列分别为F1GGAGGCTCACCTACCCTG，如SEQIDNO13所示，和说明书CN104212811A7/7页9F2AGGAGGAGAAAGTAAAGAAG，如SEQIDNO14所示。经PCR扩增、克隆测序同实施例2，获得MYL。
22、3基因的CDNA全长序列，长为925BP，序列见SEQIDNO1。0094实施例6CDNA编码蛋白的氨基酸序列分析0095登录HTTP/GENESMITEDU/GENSCANHTML分析MYL3的CDNA序列，确定该基因编码蛋白的氨基酸序列。其编码区编码199个氨基酸，具有如SEQIDNO2所述的氨基酸序列。0096实施例7小尾寒羊各组织中MYL3基因的表达分析00971小尾寒羊各种组织的采取选取小尾寒羊母羊三只，分别取心、肝、肺、脾、肾、背最长肌、脂肪、卵巢、血管和胃组织25G，立即投入液氮保存备用。00982组织RNA的提取及反转录取各种组织2G左右，总RNA的提取及反转录合成CDNA第一。
23、链方法同实施例1。00993设计荧光定量PCR引物从两条CDNA序列的5端设计扩增片段长度为80200BP的荧光定量PCR引物，引物序列如下010001014QRTPCR反应以GAPDH为内参基因，依照TAKARA公司的PREMIXEXTAQTMDRR081A说明书加样，反应体系为15L，具体成份如下01020103将上述试剂混匀，所有反应一式三份，采用SYBRGREENI染料法在MX3000P荧光定量仪上以两步法进行PCR扩增95预变性10MIN；9530S，6030S，7220S40CYCLES。01045结果的分析统计反应结果经MX3000P配套软件对所得CT值进行初步分析。每个基因表达。
24、的相对值根据标准曲线运用2CT法进行计算，基因的表达水平表示为2CTSE。用SAS81软件中的ONEWAYANOVA法进行差异显著性分析，差异显著性表达水平为P005。各组织间MYL3的表达水平见附图5。0105定量PCR结果表明，MYL3在这十种组织中均有表达，而在心肌中表达量最高，其次为背最长肌，说明通过调控MYL3基因的表达量增加，可应用于培育生长速度快的绵羊进行育种。说明书CN104212811A1/6页1000010002序列表CN104212811A102/6页110003序列表CN104212811A113/6页120004序列表CN104212811A124/6页130005序列表CN104212811A135/6页140006序列表CN104212811A146/6页15序列表CN104212811A151/2页16图1图2图3图4说明书附图CN104212811A162/2页17图5说明书附图CN104212811A17。