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1、(10)授权公告号 CN 102577966 B (45)授权公告日 2013.06.19 CN 102577966 B *CN102577966B* (21)申请号 201210050973.7 (22)申请日 2012.03.01 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 玉溪明珠花卉股份有限公司 地址 653100 云南省玉溪市高新区腾霄路 11 号 (72)发明人 陈朋从 瞿萍梅 胡绪岚 (74)专利代理机构 昆明慧翔专利事务所 53112 代理人 邓丽春 CN 102124956 ,2011.07.20, 全文 . CN 1994067 A,2007.07.11, 全文。
2、 . J. M. Van Tuyl 等 .Application of in vitro pollination, ovary culture, ovule culture and embryo rescue for overcoming incongruity barriers in interspecific Lilium crosses.Plant Science .1991, 第 74 卷 115-126. 屈云慧等 . 百合幼胚离体培养成株体系的建 立 .云南农业科技 .2002,( 第 2 期 ),9-12. 王春彦等 . 椰乳和香蕉泥对东方百合杂 交幼胚离体培养的影响 .沈阳农业。
3、大学学 报 .2011,( 第 5 期 ),618-621. 王丹菲等 . 百合种间杂种胚离体培养研 究 .北方园艺 .2006,157-159. (54) 发明名称 一种幼胚拯救获得东方百合远缘杂种的方法 (57) 摘要 本发明提供了一种幼胚拯救获得东方百合远 缘杂种的方法， 具体通过以下步骤完成 ： A、 果实 消毒， B、 剥胚， C、 增殖培养， D、 成球培养， E、 低温处 理。 该发明克服了现有技术存在的不足， 使大量远 缘杂交胚继续发育成正常种子， 有效避免了远缘 杂种胚早衰， 同时获得大量的远缘杂交后代， 实现 百合属种间远缘杂交。该方法能够提高东方百合 杂交后代的杂种成活率。
4、， 缩短育种周期。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李安 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 (10)授权公告号 CN 102577966 B CN 102577966 B *CN102577966B* 1/1 页 2 1. 一种幼胚拯救获得东方百合远缘杂种的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： A、 果实消毒 ： 将授粉后3060天的未完全发育子房切割下来， 在27温度条件下， 存放 24 72 小时后取出， 用浓度为 75% 的酒精对其表面擦拭 2 3 次后带到超净工作台 ； B、 剥胚。
5、 ： 用分析纯酒精浸泡 10 15 秒， 放在酒精灯上烧 5 10 秒， 然后选取膨大部 位， 将子房沿着心皮线切开， 选出有胚种子剥离出胚， 接入 1/2MS+ 糖 60g/L+ 琼脂 5.5g/L， PH 5.8 培养基中培养 15 45 天后幼胚萌发率达 100% ； C、 增殖培养 ： 将萌发的幼胚接种到 MS+KT 5mg/L+NAA 0.2mg/L+CPPU 4mg/L+ 糖 40 g/L +BA 0.3mg/L+ 琼脂 6.5 7.0g/L， PH 5.8， 在温度 22 25， 光照强度 1500 2000Lx， 光 照 8 12h/d 的环境条件下进行幼苗小鳞茎培养， 20 。
6、30 天转接一次 ； D、 成球培养 ： 经过步骤 C 的处理， 当增殖数量达到目标数量时， 将其分离成单株， 切除 叶片后接种到 MS+ NAA0.1 mg/L + 糖 60g/L+ 琼脂 6.5g/L+ 活性炭 2 5g/L， PH 5.8 的培 养基上， 20 30 天即可生根， 大部分小球膨大为直径 0.5 1.0cm 籽球 ； E、 低温处理 ： 将步骤 D 的籽球放入冷库中， 在温度为 3 4的条件下， 冷藏处理 30 40 天后打破休眠， 即可移栽， 测得成活率达 95 98%。 2. 根据权利要求 1 所述的一种幼胚拯救获得东方百合远缘杂种的方法， 其特征在于， 所述步骤 A 。
7、中未完全发育子房切割下来后， 在 2 7温度条件下， 存放 36 48 小时后取 出。 权 利 要 求 书 CN 102577966 B 2 1/3 页 3 一种幼胚拯救获得东方百合远缘杂种的方法 技术领域 0001 本发明涉及通过组织培养技术的植物再生， 尤其涉及一种利用幼胚拯救获得东方 百合远缘杂种的方法。 背景技术 0002 百合是百合科百合属多年生草本球根植物， 主要分布在亚洲东部、 欧洲、 北美洲等 北半球温带地区， 全球已发现有百多个品种， 中国是其最主要的起源地， 原产五十多种， 是 百合属植物自然分布中心。 近年更有不少经过人工杂交而产生的新品种， 如亚洲百合、 麝香 百合、 。
8、香水百合等。百合的主要应用价值在于观赏， 有些品种可作为蔬菜食用和药用。 0003 百合花素有 “云裳仙子” 之称。由于其外表高雅纯洁， 天主教以百合花为玛利亚的 象征， 而梵蒂冈以百合花象征民族独立， 经济繁荣并把它做为国花。 百合的鳞茎由鳞片抱合 而成， 有 “百年好合” “百事合意” 之意， 中国人自古视为婚礼必不可少的吉祥花卉。百合在 插花造型中可做焦点花， 骨架花。它属于特殊型花材。产地分布产地及分布 ： 中国、 日本、 北 美和欧洲等温带地区。 百合花花姿雅致， 叶片青翠娟秀， 茎干亭亭玉立， 是名贵的切花新秀。 0004 百合新品种的培育多数是通过种间或种系间远缘杂交实现的， 要。
9、使杂交组合获得 成功， 不仅要有足够数量的杂交种子， 而且必须保证杂种后代植株有足够的生活力与生育 力。 杂种胚的挽救培养技术作为组织培养的一个重要领域己有近百年的历史， 杂交子房、 胚 珠和杂交幼胚的离体培养， 是目前克服受精后发育障碍的有效方法， 在植物育种工作中发 挥着极为重要的作用， 己广泛运用于水稻、 小麦、 玉米等粮食作物的育种工作中。当前世界 各国培育的亚洲百合和东方百合杂种系， 多数是属于不同的种群和杂种间杂交育成的， 由 于是远缘杂交， 杂交胚的胚乳发育不正常或是胚与胚乳之间生理上的不协调而使杂种胚早 期败育。 发明内容 0005 为克服上述问题， 本发明提供了一种幼胚拯救获。
10、得东方百合远缘杂种的方法， 该 方法能够提高东方百合杂交后代的杂种成活率， 缩短育种周期。 0006 本发明通过下列技术方案实现 ： 一种幼胚拯救获得东方百合远缘杂种的方法， 包 括以下步骤 ： 0007 A、 果实消毒 ： 将授粉后 30 60 天的未完全发育子房切割下来， 在 2 7温度 条件下， 存放 24 72 小时后取出， 用浓度为 75% 的酒精对其表面擦拭 2 3 次后带到超净 工作台。 0008 B、 剥胚 ： 用分析纯酒精浸泡 25 35 秒， 放在酒精灯上烧 10 30 秒， 然后选取膨 大部位， 将子房沿着心皮线切开， 选出有胚种子剥离出胚， 接入1/2MS+糖60g/L。
11、+琼脂5.5g/ L， PH 5.8 培养基中培养 15 45 天后幼胚萌发率达 100%。 0009 C、 增殖培养 ： 将萌发的幼胚接种到 MS+KT 5mg/L+NAA 0.2mg/L+CPPU 4mg/L+ 糖 40 g/L +BA 0.3mg/L+琼脂6.57.0g/L， PH 5.8， 在温度2225， 光照强度15002000Lx， 说 明 书 CN 102577966 B 3 2/3 页 4 光照 8 12h/d 的环境条件下进行幼苗小鳞茎培养， 20 30 天转接一次。 0010 D、 成球培养 ： 经过步骤 C 的处理， 当增殖数量达到目标数量时， 将其分离成单株， 切除叶。
12、片后接种到 MS+ NAA0.1 mg/L + 糖 60g/L+ 琼脂 6.5g/L+ 活性炭 2 5g/L， PH 5.8 的培养基上， 20 30 天即可生根， 大部分小球膨大为直径 0.5 1.0cm 籽球。 0011 E、 低温处理 ： 将步骤 D 的籽球放入冷库中， 在温度为 3 4的条件下， 冷藏处理 30 40 天后打破休眠， 即可移栽， 测得成活率达 95 98%。 0012 优选的， 所述步骤A中未完全发育的子房切割下来后， 在27温度条件下， 存放 36 48 小时后取出。 0013 所述步骤 B 剥胚时用分析纯酒精浸泡 10 15 秒， 放在酒精灯上烧 5-10 秒。 0。
13、014 有益效果 ： 0015 本发明通过杂交授粉3060天后获得的幼胚离体培养， 此时胚已接近成熟， 易 剥离进行培养。 0016 该方法能使大量远缘杂交胚继续发育成正常种子， 有效避免远缘杂种胚早衰， 同时获得大量的远缘杂交后代， 实现百合属种间远缘杂交。 0017 本发明在剥胚过程对子房消毒时采用分析纯酒精浸泡 25 35 秒， 放在酒精灯 上烧1030秒， 避免了升汞消毒的毒害作用， 操作简单， 且能对子房进行有效的消毒处理。 0018 本发明采用的增值培养基， 即 MS+KT 5mg/L+NAA 0.2mg/L+CPPU 4mg/L+ 糖 40 g/L +BA 0.3mg/L+琼脂6。
14、.57.0g/L， PH 5.8， 可使幼苗增殖的鳞茎数目较多， 在短时间内 获得大量杂种苗， 同时有利于百合鳞茎的膨大， 从而保障了移栽后成活率， 大大节约成本。 0019 该方法采用低温处理， 促进膨大子房进一步成熟， 促使剥离胚快速萌芽， 大大缩 短育种周期 ； 同时提高了杂种成活率， 使其成活率达到 95 98 %。 具体实施例 0020 实施例 1 ： 一种幼胚拯救获得东方百合远缘杂种的方法， 包括以下步骤 ： 0021 A、 果实消毒 ： 将授粉后 40 天的未完全发育子房切割下来， 在 3温度条件下， 存放 24 小时后取出， 用浓度为 75% 的酒精对其表面擦拭 2 次后带到超。
15、净工作台。 0022 B、 剥胚 ： 用分析纯酒精浸泡 10 秒， 放在酒精灯上烧 6 秒， 然后选取膨大部位， 将子 房沿着心皮线切开， 选出有胚种子剥离出胚， 接入 1/2MS+ 糖 60g/L+ 琼脂 5.5g/L， PH 5.8 培 养基中培养 15 45 天后幼胚萌发率达 100%。 0023 C、 增殖培养 ： 将萌发的幼胚接种到 MS+KT 5mg/L+NAA 0.2mg/L+CPPU 4mg/L+ 糖 40 g/L +BA 0.3mg/L+ 琼脂 6.5g/L， PH 5.8， 在温度 22， 光照强度 1500Lx， 光照 8h/d 的环境 条件下进行幼苗小鳞茎培养， 20 。
16、天转接一次。 0024 D、 成球培养 ： 经过步骤 C 的处理， 当增殖数量达到目标数量时， 将其分离成单株， 切除叶片后接种到 MS+ NAA0.1 mg/L + 糖 60g/L+ 琼脂 6.5g/L+ 活性炭 2g/L， PH 5.8 的培 养基上， 20 30 天即可生根， 大部分小球膨大为直径 0.5cm 籽球。 0025 E、 低温处理 ： 将步骤 D 的籽球放入冷库中， 在温度为 3的条件下， 冷藏处理 30 天 后打破休眠， 即可移栽， 测得成活率达 95 98%。 0026 实施例 2 ： 一种幼胚拯救获得东方百合远缘杂种的方法， 包括以下步骤 ： 0027 A、 果实消毒 。
17、： 将授粉后 45 天的未完全发育子房切割下来， 在 4温度条件下， 存放 说 明 书 CN 102577966 B 4 3/3 页 5 48 小时后取出， 用浓度为 75% 的酒精对其表面擦拭 3 次后带到超净工作台。 0028 B、 剥胚 ： 用分析纯酒精浸泡 12 秒， 放在酒精灯上烧 7 秒， 然后选取膨大部位， 将子 房沿着心皮线切开， 选出有胚种子剥离出胚， 接入 1/2MS+ 糖 60g/L+ 琼脂 5.5g/L， PH 5.8 培 养基中培养 15 45 天后幼胚萌发率达 100%。 0029 C、 增殖培养 ： 将萌发的幼胚接种到 MS+KT 5mg/L+NAA 0.2mg/。
18、L+CPPU 4mg/L+ 糖 40 g/L +BA 0.3mg/L+ 琼脂 7.0g/L， PH 5.8， 在温度 23， 光照强度 1800Lx， 光照 10h/d 的环境 条件下进行幼苗小鳞茎培养， 25 天转接一次。 0030 D、 成球培养 ： 经过步骤 C 的处理， 当增殖数量达到目标数量时， 将其分离成单株， 切除叶片后接种到 MS+ NAA0.1 mg/L + 糖 60g/L+ 琼脂 6.5g/L+ 活性炭 3g/L， PH 5.8 的培 养基上， 20 30 天即可生根， 大部分小球膨大为直径 0.8cm 籽球。 0031 E、 低温处理 ： 将步骤 D 的籽球放入冷库中， 。
19、在温度为 4的条件下， 冷藏处理 35 天 后打破休眠， 即可移栽， 测得成活率达 95 98%。 0032 实施例 3 ： 一种幼胚拯救获得东方百合远缘杂种的方法， 包括以下步骤 ： 0033 A、 果实消毒 ： 将授粉后 50 天的未完全发育子房切割下来， 在 5温度条件下， 存放 72 小时后取出， 用浓度为 75% 的酒精对其表面擦拭 2 次后带到超净工作台。 0034 B、 剥胚 ： 用分析纯酒精浸泡 15 秒， 放在酒精灯上烧 8 秒， 然后选取膨大部位， 将子 房沿着心皮线切开， 选出有胚种子剥离出胚， 接入 1/2MS+ 糖 60g/L+ 琼脂 5.5g/L， PH 5.8 培。
20、 养基中培养 15 45 天后幼胚萌发率达 100%。 0035 C、 增殖培养 ： 将萌发的幼胚接种到 MS+KT 5mg/L+NAA 0.2mg/L+CPPU 4mg/L+ 糖 40 g/L +BA 0.3mg/L+ 琼脂 6.5g/L， PH 5.8， 在温度 24， 光照强度 2000Lx， 光照 12h/d 的环境 条件下进行幼苗小鳞茎培养， 30 天转接一次。 0036 D、 成球培养 ： 经过步骤 C 的处理， 当增殖数量达到目标数量时， 将其分离成单株， 切除叶片后接种到 MS+ NAA0.1 mg/L + 糖 60g/L+ 琼脂 6.5g/L+ 活性炭 4g/L， PH 5.8 的培 养基上， 20 30 天即可生根， 大部分小球膨大为直径 1.0cm 籽球。 0037 E、 低温处理 ： 将步骤 D 的籽球放入冷库中， 在温度为 3的条件下， 冷藏处理 40 天 后打破休眠， 即可移栽， 测得成活率达 95 98%。 说 明 书 CN 102577966 B 5 。