加速黄柄鹅膏菌丝体生长的优化培养方法.pdf

《加速黄柄鹅膏菌丝体生长的优化培养方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《加速黄柄鹅膏菌丝体生长的优化培养方法.pdf（7页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)授权公告号 CN 102696404 B (45)授权公告日 2013.07.31 CN 102696404 B *CN102696404B* (21)申请号 201210237012.7 (22)申请日 2012.07.10 A01G 1/04(2006.01) (73)专利权人 云南大学 地址 650091 云南省昆明市五华区翠湖北路 2 号云南大学 (72)发明人 李宗菊 张曦予 何隽 唐萍 李彪 周文 吴鹏 赵昱 冯辽辽 (54) 发明名称 加速黄柄鹅膏菌丝体生长的优化培养方法 (57) 摘要 本发明涉及一种加速黄柄鹅膏 （Amanita flavipes） 菌丝体生长的培养方。

2、法， 属于大型真菌 培养技术领域。其特征为 ： 由未开伞的成熟子实 体诱导菌丝体， 通过培养基改良， 提供简单、 培养 周期短、 成本低， 能促进菌丝快速生长的优化培养 基。 鹅膏属是特殊珍贵的大型经济真菌， 其价值大 应用范围广， 在开发新特效药如抗肿瘤、 抗菌抗病 毒、 镇静或麻醉药等领域具有潜在地应用前景， 但 至今因其资源珍稀、 难以人工驯化、 毒素的化学合 成品无活性等问题尚难以开发应用。本发明以云 南武定狮山采集的黄柄鹅膏为材料， 征对其菌丝 难以诱导、 菌丝生长非常缓慢等制约培养的问题 进行了创新性突破， 为今后鹅膏菌丝规模化培养 及人工驯化等提供了条件。 (51)Int.Cl.。

3、 审查员 吴锦娣 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 (10)授权公告号 CN 102696404 B CN 102696404 B *CN102696404B* 1/1 页 2 1. 一种加速黄柄鹅膏 （Amanita flavipes） 菌丝体生长的培养方法， 其特征为， 采用成 熟子实体室内诱导菌丝， 针对培养过程中菌丝体生长极其缓慢问题， 通过在培养基中加入 滇青冈及土对培养基进行改良， 由此提供一种能促进菌丝快速生长的优化培养方法， 主要 包括下列步骤 ： （1） 菌丝体诱导 ： 取成熟子实体， 将其。

4、从菌盖中部一分为四， 取菌柄与菌盖交接处的内 部组织块， 切成 0.08 0.16cm2的小块 ； 分别嵌入试管斜面诱导培养基表面， 培养温度为 2122， 暗培养1418天， 菌块周围开始萌发出极少白色菌丝， 5360天， 组织块多处 隆起， 表面长出团状、 稠密的绒毛状白色菌丝， 其所述的诱导培养基为 ： 马铃薯 200.00g/L、 葡萄糖 20.00g/L、 NH4NO3 0.30 0.40g/L、 谷氨酸 0.28 0.32 g/L、 VB1 0.10mg/L、 麦芽汁 150 ml/L、 琼脂 11.00 g/L， 控制 PH 值为 5.4 左右 ； （2） 菌丝体均一性与扩大培养。

5、 ： 将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入含诱导培养基 的培养皿中进行均一性培养， 在同温度下， 经过 38 40 天的暗培养， 培养皿中形成直径 2.5 3.0cm 的圆形规则菌落， 用直径 1.0 cm 的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块 进行扩大培养， 每 35 36 天扩大培养一次 ； （3） 培养基改良及优化 ： 以诱导培养基为基础， 对菌丝体的培养基进行了反复筛选， 得 到了优化的培养基， 使用该培养基， 22 25 天， 菌丝直径为 7.5 8.5cm， 菌丝基本长满培 养皿， 其所述的优化培养基为 ： 马铃薯 100.00 120.00g/L、 葡萄糖 9.00 12.00g。

6、/L、 过 80 100 目分样筛的滇青冈腐叶干粉 30.00 50.00g/L、 过 80 100 目分样筛的生境土 干粉 60.00 80.00g/L、 蛋白胨 3.00 5.00 g /L、 NH4NO3 0.60 0.80g/L、 6-BA1.20 1.50mg/L、 麦芽汁 200 230 ml/L、 琼脂 6.00 8.00 g/L， 控制 PH 值为 5.4 左右。 权 利 要 求 书 CN 102696404 B 2 1/5 页 3 加速黄柄鹅膏菌丝体生长的优化培养方法 技术领域 0001 本发明涉及一种加速黄柄鹅膏 （Amanita flavipes） 菌丝体生长的培养方法，。

7、 属于 生物技术领域， 具体地说是属于大型真菌室内培养范畴。 背景技术 0002 鹅 膏 菌 属 （Amanita）隶 属 于 担 子 菌 亚 门、层 菌 纲、伞 菌 目、鹅 膏 菌 科 （Amanitaceae） ， 是有毒的大型真菌中较特殊、 较有价值的一个世界性广布大属， 其物种多 样性是非常丰富的， 全球已报道近400种， 中国已记录的近100种 （含亚种、 变种及变型） 。 鹅 膏菌属中的大部份种属于著名剧毒菌， 因此， 鹅膏的价值在于其毒素。 鹅膏菌毒素可分为四 类， 其中最主要也是最重要的是肽类毒素， 肽类毒素又包括鹅膏毒肽 （amatoxins） 、 鬼笔毒 肽 （phallo。

8、toxins） 和毒伞素类 （virotoxins） 三种。鹅膏毒素的应用研究主要体现在以下 几方面 ： 可用于研究真核生物基因的表达、 调控及细胞定位 ； 可开发抗菌、 抗病毒、 抗 肿瘤、 镇静麻醉及其它特效新药 ； 可用于生物防冶。 0003 鹅膏菌属大多属于外生菌根真菌， 目前尚不能人工栽培， 难以开发利用。虽然已 有少数的种能进行菌丝的纯培养， 但也存在一些问题， 如菌丝生长缓慢、 菌丝中毒素含量不 高。鹅膏多肽毒素是一种由 7-8 个被修饰了的稀有氨基酸组成的环肽 , 可能不是基因编码 的直接产物 , 而是经过加工后的次级产物 , 要克隆毒素的基因是复杂而困难的， 且其化学 合成品。

9、也没有活性。因此， 至今国内外还没有一种能规模化开发的毒素产品。现作为生化 试剂的肽类毒素全部来源于欧美的毒鹅膏 (Amanita phalloides) 子实体， 销价昂贵。 0004 鹅膏种群小， 个体少， 产量低， 分布数量极其有限。 加之对生境敏感， 一旦生境受到 破坏， 极易消失或灭绝， 属于特殊的致危生物类群， 这更增加了其进一步被研究、 利用的难 度。 0005 鹅膏的人工驯化或栽培是保证鹅膏资源可持续性利用的前提或关键， 但此目前仍 然属于难以攻克的问题及盲点， 其中菌丝难以诱导， 菌丝生长非常缓慢是制约及影响人工 培养的重要环节或因素。 0006 黄柄鹅膏菌 (Amanita。

10、 flavipes Imai) 是鹅膏属中的一个广布种， 主要分布于 云南、 四川、 西藏 （东南部林区） ， 其形态特征如下 ： 子实体较小或中等 ； 菌盖直径 3-7.5cm， 初期卵圆形， 后扁平至近平展， 褐色到黄褐色， 中央色深而向边缘色浅呈黄色， 表面湿时 粘附有暗黄或金黄色块状粉质鳞片 ； 菌肉白色， 近表皮下褐黄色 ； 菌褶白色带黄色， 离 生， 不等长， 较密 ； 菌柄较长， 柱形， 向下渐粗， 长 7-10cm， 粗 0.6-1cm， 淡黄且上部白色带 黄色， 基部呈球形且有环带状金黄色斑纹或粉末状菌托残痕， 内部松软至空心 ； 菌环膜 质， 黄色， 生柄之中上部， 上表面。

11、有细条纹 ； 孢子形状从宽椭圆形至近卵圆形， 光滑， 无色， 7.5-10m5-7.5m， 糊性反应。 本发明以云南武定狮子山自然保护区采集的黄柄鹅膏 菌为材料， 成功分离到了该种的菌丝， 但菌丝生长非常慢， 难以扩繁， 本发明征对此问题进 行了重点突破。 说 明 书 CN 102696404 B 3 2/5 页 4 发明内容 0007 本发明的目的在于， 提供一种简单， 生产成本低， 能促进菌丝快速生长的固体培养 方法。 0008 本发明的技术方案， 其步骤为 ： 0009 （1） 菌丝体诱导 ： 取成熟子实体， 将其从菌盖中部一分为四， 取菌柄与菌盖交接处 的内部组织块， 切成 0.08 。

12、0.16cm2的小块 ； 分别嵌入试管斜面诱导培养基表面， 培养温度 为2122， 暗培养1418天， 菌块周围开始萌发出极少白色菌丝， 5360天， 组织块多 处隆起， 表面长出团状、 稠密的绒毛状白色菌丝， 其所述的诱导培养基为 ： 马铃薯 200.00g/ L、 葡萄糖 20.00g/L、 NH4NO3 0.30 0.40g/L、 谷氨酸 0.28 0.32 g/L、 VB1 0.10mg/L、 麦芽 汁 150 ml/L、 琼脂 11.00 g/L， 控制 PH 值为 5.4 左右 ； 0010 （2） 菌丝体均一性与扩大培养 ： 将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入含诱导培 养基的培养。

13、皿中进行均一性培养， 在同温度下， 经过 38 40 天的暗培养， 培养皿中形成直 径 2.5 3.0cm 的圆形规则菌落， 用直径 1.0 cm 的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌 块进行扩大培养， 每 35 36 天扩大培养一次 ； 0011 （3） 培养基改良及优化 ： 以诱导培养基为基础， 对菌丝体的培养基进行了反复筛 选， 得到了优化的培养基， 使用该培养基， 22 25 天， 菌丝直径为 7.5 8.5cm， 菌丝基本长 满培养皿， 其所述的优化培养基为 ： 马铃薯100.00120.00g/L、 葡萄糖9.0012.00g/L、 过 80 100 目分样筛的滇青冈腐叶干粉 30。

14、.00 50.00g/L、 过 80 100 目分样筛的生境 土干粉60.0080.00g/L、 蛋白胨 3.005.00 g /L、 NH4NO3 0.600.80g/L、 6-BA1.20 1.50mg/L、 麦芽汁 200 230 ml/L、 琼脂 6.00 8.00 g/L， 控制 PH 值为 5.4 左右。 0012 以下的实施例子是对本发明的进一步说明， 不是对本发明的限制。 具体实施方式 0013 实例一 ： 0014 野外采摘生长优良、 无虫害、 未开伞或未完全开伞、 菌柄较粗壮、 菌盖较肥厚的成 熟子实体 ； 0015 将子实体带回实验室， 于超净台上用酒精棉球， 轻擦菌盖表。

15、面及菌柄部位， 除去表 面泥沙或土， 将子实体从菌盖中部一分为四， 用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块， 切成 0.08 0.16cm2的小块 ； 0016 将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面， 培养温度为 21 22， 暗培养 14 天， 菌块周围开始萌发出极少白色菌丝， 60 天， 组织块多处隆起， 表面长出 团状、 稠密的绒毛状白色菌丝， 其所述的诱导培养基为 ： 马铃薯 200.00g/L、 葡萄糖 20.00g/ L、 NH4NO3 0.30g/L、 谷氨酸 0.32 g/L、 VB1 0.10mg/L、 麦芽汁 150 ml/L、 琼脂 11.00 g/L， 控。

16、 制 PH 值为 5.4 左右 ； 0017 将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入含诱导培养基的培养皿中进行均一性培 养， 在温度为2122下， 经过40天的暗培养， 培养皿中形成直径3.0cm的圆形规则菌落， 用直径 1.0 cm 的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养， 每 35 天扩大培 养一次 ； 0018 以诱导培养基为基础， 对菌丝体的培养基进行了反复筛选， 得到了优化的培养基， 说 明 书 CN 102696404 B 4 3/5 页 5 使用该培养基， 25 天， 菌丝直径为 8.5cm， 菌丝基本长满培养皿， 其所述的优化培养基为 ： 马 铃薯 100.00g/L、。

17、 葡萄糖 10.00g/L、 过 80 目分样筛的滇青冈腐叶干粉 30.00g/L、 过 80 目 分样筛的生境土干粉 70.00g/L、 蛋白胨 3.00g /L、 NH4NO3 0.80g/L、 6-BA1.50mg/L、 麦芽汁 200ml/L、 琼脂 6.00 g/L， 控制 PH 值为 5.4 左右。 0019 实例二 ： 0020 野外采摘生长优良、 无虫害、 未开伞或未完全开伞、 菌柄较粗壮、 菌盖较肥厚的成 熟子实体 ； 0021 将子实体带回实验室， 于超净台上用酒精棉球， 轻擦菌盖表面及菌柄部位， 除去表 面泥沙或土， 将子实体从菌盖中部一分为四， 用解剖刀取菌柄与菌盖交接。

18、处的内部组织块， 切成 0.08 0.16cm2的小块 ； 0022 将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面， 培养温度为 21 22， 暗培养 16 天， 菌块周围开始萌发出极少白色菌丝， 55 天， 组织块多处隆起， 表面长出 团状、 稠密的绒毛状白色菌丝， 其所述的诱导培养基为 ： 马铃薯 200.00g/L、 葡萄糖 20.00g/ L、 NH4NO3 0.40g/L、 谷氨酸 0.28g/L、 VB1 0.10mg/L、 麦芽汁 150 ml/L、 琼脂11.00 g/L， 控制 PH 值为 5.4 左右 ； 0023 将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入含诱导培养基的培养。

19、皿中进行均一性培 养， 在温度为2122下， 经过39天的暗培养， 培养皿中形成直径2.8cm的圆形规则菌落， 用直径 1.0 cm 的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养， 每 36 天扩大培 养一次 ； 0024 以诱导培养基为基础， 对菌丝体的培养基进行了反复筛选， 得到了优化的培养基， 使用该培养基， 23 天， 菌丝直径为 8.0cm， 菌丝基本长满培养皿， 其所述的优化培养基为 ： 马 铃薯 120.00g/L、 葡萄糖 12.00g/L、 过 100 目分样筛的滇青冈腐叶干粉 40.00g/L、 过 100 目 分样筛的生境土干粉60.00g/L、 蛋白胨 5.00g。

20、/L、 NH4NO30.60g/L、 6-BA1.30mg/L、 麦芽汁230 ml/L、 琼脂 7.00g/L， 控制 PH 值为 5.4 左右。 0025 实例三 ： 0026 野外采摘生长优良、 无虫害、 未开伞或未完全开伞、 菌柄较粗壮、 菌盖较肥厚的成 熟子实体 ； 0027 将子实体带回实验室， 于超净台上用酒精棉球， 轻擦菌盖表面及菌柄部位， 除去表 面泥沙或土， 将子实体从菌盖中部一分为四， 用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块， 切成 0.08 0.16cm2的小块 ； 0028 将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面， 培养温度为 21 22， 暗培养 18 。

21、天， 菌块周围开始萌发出极少白色菌丝， 53 天， 组织块多处隆起， 表面长出 团状、 稠密的绒毛状白色菌丝， 其所述的诱导培养基为 ： 马铃薯 200.00g/L、 葡萄糖 20.00g/ L、 NH4NO3 0.35g/L、 谷氨酸 0.30 g/L、 VB1 0.10mg/L、 麦芽汁 150 ml/L、 琼脂 11.00 g/L， 控 制 PH 值为 5.4 左右 ； 0029 将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入含诱导培养基的培养皿中进行均一性培 养， 在温度为2122下， 经过40天的暗培养， 培养皿中形成直径2.5cm的圆形规则菌落， 用直径 1.0 cm 的圆形打孔器取菌落边缘同。

22、一生长期的菌块进行扩大培养， 每 35 天扩大培 养一次 ； 说 明 书 CN 102696404 B 5 4/5 页 6 0030 以诱导培养基为基础， 对菌丝体的培养基进行了反复筛选， 得到了优化的培养基， 使用该培养基， 22 天， 菌丝直径为 7.5cm， 菌丝基本长满培养皿， 其所述的优化培养基为 ： 马 铃薯 110.00g/L、 葡萄糖 9.00g/L、 过 80 目分样筛的滇青冈腐叶干粉 50.00g/L、 过 80 目分 样筛的生境土干粉 60.00g/L、 蛋白胨 4.00 g /L、 NH4NO3 0.70g/L、 6-BA1.20mg/L、 麦芽汁 210ml/L、 琼。

23、脂 8.00 g/L， 控制 PH 值为 5.4 左右。 0031 实例四 ： 0032 野外采摘生长优良、 无虫害、 未开伞或未完全开伞、 菌柄较粗壮、 菌盖较肥厚的成 熟子实体 ； 0033 将子实体带回实验室， 于超净台上用酒精棉球， 轻擦菌盖表面及菌柄部位， 除去表 面泥沙或土， 将子实体从菌盖中部一分为四， 用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块， 切成 0.08 0.16cm2的小块 ； 0034 将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面， 培养温度为 21 22， 暗培养 15 天， 菌块周围开始萌发出极少白色菌丝， 58 天， 组织块多处隆起， 表面长出 团状、 稠密。

24、的绒毛状白色菌丝， 其所述的诱导培养基为 ： 马铃薯 200.00g/L、 葡萄糖 20.00g/ L、 NH4NO3 0.38g/L、 谷氨酸 0.28 g/L、 VB1 0.10mg/L、 麦芽汁 150 ml/L、 琼脂 11.00 g/L， 控 制 PH 值为 5.4 左右 ； 0035 将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入含诱导培养基的培养皿中进行均一性培 养， 在温度为2122下， 经过38天的暗培养， 培养皿中形成直径2.8cm的圆形规则菌落， 用直径 1.0 cm 的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养， 每 35 天扩大培 养一次 ； 0036 以诱导培养基为基础，。

25、 对菌丝体的培养基进行了反复筛选， 得到了优化的培养基， 使用该培养基， 24 天， 菌丝直径为 8.2cm， 菌丝基本长满培养皿， 其所述的优化培养基为 ： 马 铃薯 105.00g/L、 葡萄糖 11.00g/L、 过 100 目分样筛的滇青冈腐叶干粉 35.00g/L、 过 100 目 分样筛的生境土干粉 75.00g/L、 蛋白胨 3.50g/L、 NH4NO3 0.80g/L、 6-BA1.50mg/L、 麦芽汁 220 ml/L、 琼脂 6.00g/L， 控制 PH 值为 5.4 左右。 0037 实例五 ： 0038 野外采摘生长优良、 无虫害、 未开伞或未完全开伞、 菌柄较粗壮。

26、、 菌盖较肥厚的成 熟子实体 ； 0039 将子实体带回实验室， 于超净台上用酒精棉球， 轻擦菌盖表面及菌柄等位， 除去表 面泥沙或土， 将子实体从菌盖中部一分为四， 用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块， 切成 0.08 0.16cm2的小块 ； 0040 将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面， 培养温度为 21 22， 暗培养 17 天， 菌块周围开始萌发出极少白色菌丝， 56 天， 组织块多处隆起， 表面长出 团状、 稠密的绒毛状白色菌丝， 其所述的诱导培养基为 ： 马铃薯 200.00g/L、 葡萄糖 20.00g/ L、 NH4NO3 0.32g/L、 谷氨酸 0.3。

27、1 g/L、 VB1 0.10mg/L、 麦芽汁 150 ml/L、 琼脂 11.00 g/L， 控 制 PH 值为 5.4 左右 ； 0041 将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入含诱导培养基的培养皿中进行均一性培 养， 在温度为2122下， 经过39天的暗培养， 培养皿中形成直径2.9cm的圆形规则菌落， 用直径 1.0 cm 的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养， 每 36 天扩大培 说 明 书 CN 102696404 B 6 5/5 页 7 养一次 ； 0042 以诱导培养基为基础， 对菌丝体的培养基进行了反复筛选， 得到了优化的培养基， 使用该培养基， 23 天， 菌丝直径为 7.8cm， 菌丝基本长满培养皿， 其所述的优化培养基为 ： 马 铃薯 115.00g/L、 葡萄糖 10.00g/L、 过 80 目分样筛的滇青冈腐叶干粉 45.00g/L、 过 80 目分 样筛的生境土干粉80.00g/L、 蛋白胨 4.50g /L、 NH4NO3 0.65g/L、 6-BA1.30mg/L、 麦芽汁200 ml/L、 琼脂 6.00g/L， 控制 PH 值为 5.4 左右。 说 明 书 CN 102696404 B 7 。