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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810171244.4 (22)申请日 2018.03.01 (83)生物保藏信息 CGMCC No.3502 2009.12.13 (71)申请人 福州大学 地址 350108 福建省福州市闽侯县福州地 区大学新区学园路2号 (72)发明人 张雯 张绍升 倪莉 王芳婷 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (51)Int.Cl. A23K 10/12(2016.01) A23K 50/80(2016.01) A01K 61/10。
2、(2017.01) (54)发明名称 一种活菌保鲜剂及其在养殖鱼类保鲜中的 应用 (57)摘要 本发明提供一种活菌保鲜剂及其在养殖鱼 类保鲜中的应用， 利用枯草芽孢杆菌活菌制剂对 鱼体腐败菌的生长抑制， 从而延长鱼的冷藏货架 期的目的， 所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌 BSh0851， 其优势在于本发明枯草芽孢杆菌保鲜 剂抑制鱼体腐败菌的生长， 从源头上缓解了腐败 菌在鱼肠和鱼鳃上的粘附和滋生， 从而达到延长 保鲜期的目的。 权利要求书1页 说明书4页 CN 108208317 A 2018.06.29 CN 108208317 A 1.一种活菌保鲜剂， 该菌为枯草芽孢杆菌BSh0851， 保。
3、藏日期为2009年12月13日， 保藏 单位是中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCC No.3502。 2.如权利要求1所述的一种活菌保鲜剂的制备方法， 其特征在于： 包括如下步骤： （1） 种子液制备： 将保藏于4冰箱的菌株取出， 挑取一环菌接入100 mL牛肉膏蛋白胨 固体培养基中， 37， 200r/min， 培养1d； 牛肉膏蛋白胨培养基： 牛肉膏2.5g， 氯化钠2.5g， 蛋 白胨5g， 蒸馏水500mL， pH7.07.2； （2） 发酵液培养基制备： 酵母浸膏14g， 无水葡萄糖14g， MgSO41g， 蒸馏水1000mL， pH7.0； （3） 枯。
4、草芽孢杆菌无菌体发酵液的制备： 将种子液以5%的比例接种至步骤 （2） 的发酵培 养基， 三角瓶装液量为100 mL， 37、 150 r/min 培养 48 h， 获得发酵菌液； （3） 离心获得菌体： 采用10000 r/min 15 离心15 min； 将收集到的菌泥用等量无菌 生理盐水洗涤， 再次离心， 重复2次； 用等量无菌的生理盐水重新悬浮菌体， 制成菌悬液； 此 时， 菌悬液浓度为109个/mL； （4） 喷雾干燥： 选用阿拉伯胶作为保护剂， 将阿拉伯胶粉溶解在去离子水中， 质量浓度 15%， 配制成壁材溶液， 均质15 min， 90水浴加热5 min； 将壁材溶液充分溶解均匀。
5、， 放入杀 菌锅杀菌； 室温下， 将菌悬液和壁材料等体积混合， 以500 r/min持续搅拌至混合均匀， 经蠕 动泵均匀进样到喷雾干燥机， 进料速度： 550 mL/h， 入口温度150， 出口温度84 ， 雾化压 力0.1 mpa， 收集产物； 最终活菌保鲜剂菌含量在5108个/g。 3.如权利要求1所述的活菌保鲜剂在鱼类保鲜中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于： 活菌制剂喷洒于饲料表面， 喂食鱼， 饲料按 10g/kg的活菌制剂用量添加到普通颗粒状饲料， 将菌粉溶于无菌水中， 均匀喷洒到普通饲 料上， 在45烘箱里干燥24 h， 封装于4保存。 权 利 要 求 书 1/1。
6、 页 2 CN 108208317 A 2 一种活菌保鲜剂及其在养殖鱼类保鲜中的应用 技术领域 0001 本发明属于微生物制剂领域， 具体涉及一种活菌保鲜剂及其在养殖鱼类保鲜中的 应用。 背景技术 0002 保鲜技术是水产品产业中重要一环， 是保持高价格、 延长货架期、 扩大销售半径以 及延长加工时间的关键， 对水产品的发展具有重要的经济意义。 目前， 应用于水产品的保鲜 技术主要有低温保鲜、 化学保鲜、 气体保鲜、 辐射保鲜和生物保鲜等。 生物保鲜以其安全性 高、 能耗低的优势成为开发新热点。 植物源保鲜剂主要起抗氧化作用； 动物源抑菌剂如鱼精 蛋白； 水产品中常用的微生物源抑菌剂主要有乳酸。
7、菌产生的乳酸菌素、 纳它霉素等。 动/植 物来源的保鲜剂受原料限制， 价格较高； 而目前产业化的微生物源保鲜剂均为微生物代谢 物， 加工成本高， 仅用在高值产品中。 若能借鉴益生菌产品的思路， 开发微生态制剂用于保 鲜， 将能有效降低生产 成本， 扩大生物保鲜剂的应用范围。 一些枯草芽孢杆菌菌株具有抑 制病原菌和微藻的活性， 被允许使用在果蔬、 鱼饲料中。 0003 本发明中利用一株具有显著抑制鱼体腐败菌活性的枯草芽孢杆菌 （保藏号： BSh0851） 创新研制该菌株的活菌保鲜制剂， 以饲料形式投放入养殖池， 通过定植在鱼鳃和 鱼肠部位， 形成菌膜和抑菌物质， 改变菌群结构， 减少鱼肠道、 鱼。
8、鳃和鱼皮附着的腐败菌， 延 长保鲜期。 该制剂的使用对于提高鱼的品质和食品安全性， 降低保鲜成本。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种活菌保鲜剂及其在养殖鱼类保鲜中的应用。 0005 为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案： 本发明中所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtulis） BSh0851， 保藏日期 为2009年12月13日， 保藏单位是中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地 址是北京市朝阳区北辰西路1号， 中国科学院微生物研究所， 保藏号为CGMCC No.3502。 该菌 株能显著抑制鱼源腐败菌， 包括希瓦氏和假单胞菌， 如表1所示。
9、。 0006 所述枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 为革兰氏阳性菌， 芽孢椭圆到柱状， 位于 菌体中央或稍偏， 芽孢形成后菌体不膨大， 菌落表面粗糙不透明， 污白色或微黄色， 常形成 皱醭； 需氧菌， 可利用蛋白质、 多种糖及淀粉， V-P阳性。 表1 枯草芽孢杆菌BSh0851对部分细菌的生长抑制作用 注：“+” 越多代表抑菌效果越明显 本发明含枯草芽孢杆菌的活菌保鲜剂制作具体包括以下步骤： （1） 种子液制备： 将保藏于4冰箱的菌株取出， 挑取一环菌接入100 mL牛肉膏蛋白胨 说 明 书 1/4 页 3 CN 108208317 A 3 固体培养基中， 37， 200。
10、r/min， 培养1d； 牛肉膏蛋白胨培养基： 牛肉膏2.5g， 氯化钠2.5g， 蛋 白胨5g， 蒸馏水500mL， pH7.07.2； （2） 发酵液培养基制备： 酵母浸膏14g， 无水葡萄糖14g， MgSO41g， 蒸馏水1000mL， pH7.0； （3） 枯草芽孢杆菌无菌体发酵液的制备： 将种子液以5%的比例接种至步骤 （2） 的发酵培 养基， 三角瓶装液量为100 mL， 37、 150 r/min 培养 48 h， 获得发酵菌液； （3） 离心获得菌体： 采用10000 r/min 15 离心15 min； 将收集到的菌泥用等量无菌 生理盐水洗涤， 再次离心， 重复2次； 用等。
11、量无菌的生理盐水重新悬浮菌体， 制成菌悬液； 此 时， 菌悬液浓度为109个/mL； （4） 喷雾干燥： 选用阿拉伯胶作为保护剂， 将阿拉伯胶粉溶解在去离子水中， 质量浓度 15%， 配制成壁材溶液， 均质15 min， 90水浴加热5 min； 将壁材溶液充分溶解均匀， 放入杀 菌锅杀菌； 室温下， 将菌悬液和壁材料等体积混合， 以500 r/min持续搅拌至混合均匀， 经蠕 动泵均匀进样到喷雾干燥机， 进料速度： 550 mL/h， 入口温度150， 出口温度84 ， 雾化压 力0.1 mpa， 收集产物； 最终活菌保鲜剂菌含量在5108个/g。 0007 所述的活菌保鲜剂在鱼类保鲜中的应。
12、用， 将活菌制剂喷洒于饲料表面， 通过鱼捕 食进入鱼肠道， 抑制肠道内腐败菌的生长， 降低鱼冷藏时期腐败菌初始浓度， 从而延长保鲜 期。 按10g/kg的菌量将枯草芽孢杆菌BSh0851菌粉添加到普通颗粒状饲料。 将菌粉溶于无菌 水中， 均匀喷洒到普通饲料上， 在45烘箱里干燥24 h， 封装后4保存。 0008 在鱼捕捞前一周， 每天喂养一次该饲料。 该活菌保鲜剂能有效延长鱼在冷藏和冰 鲜时的保鲜期。 0009 本发明的有益效果如下： 本发明中利用一株具有显著抑制鱼体腐败菌活性的枯草芽孢杆菌 （保藏号： BSh0851） 创新研制该菌株的活菌保鲜制剂， 以饲料形式投放入养殖池， 通过定植在鱼。
13、鳃和鱼肠部位， 形成菌膜和抑菌物质， 改变菌群结构， 减少鱼肠道、 鱼鳃和鱼皮附着的腐败菌， 延长保鲜期。 该制剂的使用对于提高鱼的品质和食品安全性， 降低保鲜成本。 具体实施方式 0010 实施例1 本发明含枯草芽孢杆菌的活菌保鲜剂制作具体包括以下步骤： （1） 种子液制备： 将保藏于4冰箱的菌株取出， 挑取一环菌接入100 mL牛肉膏蛋白胨 固体培养基中， 37， 200r/min， 培养1d； 牛肉膏蛋白胨培养基： 牛肉膏2.5g， 氯化钠2.5g， 蛋 白胨5g， 蒸馏水500mL， pH7.07.2； （2） 发酵液培养基制备： 酵母浸膏14g， 无水葡萄糖14g， MgSO41g，。
14、 蒸馏水1000mL， pH7.0； （3） 枯草芽孢杆菌无菌体发酵液的制备： 将种子液以5%的比例接种至步骤 （2） 的发酵培 养基， 三角瓶装液量为100 mL， 37、 150 r/min 培养 48 h， 获得发酵菌液； （3） 离心获得菌体： 采用10000 r/min 15 离心15 min； 将收集到的菌泥用等量无菌 生理盐水洗涤， 再次离心， 重复2次； 用等量无菌的生理盐水重新悬浮菌体， 制成菌悬液； 此 时， 菌悬液浓度为109个/mL； （4） 喷雾干燥： 选用阿拉伯胶作为保护剂， 将阿拉伯胶粉溶解在去离子水中， 质量浓度 15%， 配制成壁材溶液， 均质15 min， 。
15、90水浴加热5 min； 将壁材溶液充分溶解均匀， 放入杀 说 明 书 2/4 页 4 CN 108208317 A 4 菌锅杀菌； 室温下， 将菌悬液和壁材料等体积混合， 以500 r/min持续搅拌至混合均匀， 经蠕 动泵均匀进样到喷雾干燥机， 进料速度： 550 mL/h， 入口温度150， 出口温度84 ， 雾化压 力0.1 mpa， 收集产物； 最终活菌保鲜剂菌含量在5108个/g。 0011 实施例2 （1） 罗非鱼的喂养。 130只20-30g罗非幼鱼根据以下4组饲喂方式养殖。 每组约3035只 罗非鱼幼鱼， 平均分配饲养在两个约75L的箱子。 每箱水温控制在281， 每日换二分。
16、之一 水。 按每日1%的体重比例喂养饲料， 在用正常饲料经过一周适应期后， 开始根据以下处理组 分组喂养7d。 0012 处理组1： 正常水体中， 普通饲料喂养组。 按每日1%的体重比例喂养饲料。 0013 处理组2： 正常水体中， 益生菌饲料喂养组。 按每日1%的体重比例喂养枯草芽孢杆 菌饲料。 0014 处理组3： 腐败水体中， 添加普通饲料喂养组。 腐败水体中， 喂养第1d添加108个/mL 腐败菌希瓦氏菌和假单胞菌各5ml， 按每日1%的体重比例喂养饲料。 0015 处理组4： 腐败水体中， 添加益生菌饲料喂养组。 腐败水体中， 喂养第1d添加108个/ mL腐败菌希瓦氏菌和假单胞菌各。
17、5ml， 按每日1%的体重比例喂养枯草芽孢杆菌饲料。 0016 益生菌为实施例1中制备获得的含枯草芽孢杆菌的活菌保鲜剂， 按10g/kg的保鲜 剂将菌粉添加到普通颗粒状饲料。 0017 （2） 样品鲜度测定。 7d喂养后， 将各组鱼捕捞起， 立即碎冰急冻后置于冰箱4冷 藏。 取2448h后的样品进行鲜度检测。 0018 挥发性盐基氮 （TVB-N） 的测定。 本实验采用的是 GB5009.228-2016自动凯氏定氮 仪法测定挥发性盐基氮 （TVB-N） ， 根据GB2733-2015 食品安全国家标准鲜、 冻动物性 水产品 规定的挥发性盐基氮指标判断鲜度， 挥发性盐基氮小于30mg/100g。
18、。 0019 鲜度K值测定。 称取研磨均匀的鱼肉样品约1 g， 放入50 mL离心管内， 添加10%高氯 酸溶液10 mL， 旋涡振荡1 min， 于4下8000 r/min离心10 min， 取出上清液。 再用5%高氯酸 5 mL提取沉淀物中的待测物， 在4下8000 r/min离心10 min。 重复上述操作一次， 合并上 清液。 用10 mol/L氢氧化钠溶液调上清液pH在4.0左右， 再用1 mol/L氢氧化钠溶液调pH至 6.0-6.4。 将此溶液转入预冷的25 mL容量瓶中， 4 去离子水定容， 于4 下8000 r/min离 心10 min， 0.22 um滤膜过滤， 滤液保存于。
19、4 冰箱中待测。 高效液相色谱法检测， 流动相A 为20 mmol/L磷酸二氢钾和20 mmol/L磷酸氢二钾 （1:1） 溶液， 用磷酸调pH至5.8， B为纯甲醇 溶液； 柱温:30； 进样量:10 L； 检测波长:254 nm； 流速:1.0 mL/min； K 值是ATP 的分解产物HxR与Hx 总量占ATP关联物总量的百分比, K值越低， 说明HxR 与Hx占全部分解产物的比例越低， 说明鱼的新鲜度越好。 用公式表示为： 式中: MATP、 MADP、 MAMP、 MIMP、 MHxR、 MHx为样品中ATP、 AMP、 ADP、 IMP、 Hx、 HxR 的含量, 单位均为微摩尔每。
20、克( mol/g)。 （3） 不同处理组鲜度变化。 0020 罗非鱼在冷藏过程中挥发性盐基氮 TVB-N 值变化如表2所示。 四组鱼肉样品TVB- 说 明 书 3/4 页 5 CN 108208317 A 5 N值随着冷藏时间均出现不同程度的增长。 4冷藏24h后， 不同处理组之间产TVB-N的能力 具有显著性差异 （p处理组1处理组4处 理组2。 加入腐败菌的水体最容易让鱼腐败 （处理组3） ， 通过益生菌饲料的喂养， 鱼抗腐败的 能力显著提高， 无论是在腐败水体中的鱼 （处理组4） 或是正常水体的鱼 （处理组2） ， 其腐败 程度都比未添加益生菌饲料时 （处理组1和3） 显著得到了减缓。 。
21、4冷藏48h后， 处理组3接近 腐败的终点 （30mg/100g） ， 腐败程度从高到低依然为处理组3处理组1处理组4处理组2。 经过益生菌饲料喂养的鱼腐败显著缓慢， 其腐败程度与冷藏24h时的正常水体组鱼没有显 著差异。 0021 表2 四组处理鱼肉冷藏过程中TVB-N值变化(mg/100g) 表3 四组罗非鱼鱼肉样品K值测定 四组罗非鱼鱼肉的K值在储藏后的48h均达到了最大值， 说明鲜度明显变差 （表3） 。 24h 时， 4种处理方式的鱼鲜度没有显著差异； 48h后， 正常水体和腐败水体中的鱼鲜度显著变 差； 添加益生菌饲料喂养的鱼在贮藏48h后， 虽然鲜度有比24h有显著损失， 但比未经过益生 菌饲养的鱼， 鲜度损失有显著的缓解 （p0.05） 。 0022 本发明可延缓鱼体在低温环境下的腐败， 应用在以希瓦氏菌和假单胞菌为优势腐 败菌的养殖淡水或海水鱼的冷藏或冰鲜的保鲜过程中。 申请专利范围所做的均等变化与修 饰， 皆应属本发明的涵盖范围。 说 明 书 4/4 页 6 CN 108208317 A 6 。