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1、10申请公布号CN104195263A43申请公布日20141210CN104195263A21申请号201410493854822申请日20140924C12Q1/68200601C12Q1/0420060171申请人河北工程大学地址056038河北省邯郸市光明南大街199号72发明人刘彦威刘娜刘利强杜鹃刘建钗张永英朱美霞刘贵巧74专利代理机构石家庄元汇专利代理事务所特殊普通合伙13115代理人刘闻铎54发明名称一种SYBRGREENI荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法57摘要一种SYBRGREENI荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，包括以下步骤1引物合成，2标准阳性样品制备，3待测样。
2、品制备，4SYBRGREENI荧光定量PCR，5绘制标准曲线和溶解曲线，6结果判定。本发明的有益之处在于采用SYBRGREENI荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法整个过程仅需要3小时就能得出准确结果，而且一次可以进行96个样品的检测，较其他方法具有操作简单、检测速度快、灵敏度高、特异性强、通量高等优点，能够为疾病的治疗和疫情的控制提供保障。51INTCL权利要求书1页说明书4页序列表1页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页序列表1页附图2页10申请公布号CN104195263ACN104195263A1/1页21一种SYBRGREENI荧光定量PC。
3、R检测兔须癣毛癣菌的方法，其特征在于，包括以下步骤1引物合成上游引物F5GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG3，下游引物R5GGAGACCATCTGTGAGAGTTG3；2标准阳性样品制备提取标准阳性重组菌的质粒DNA，稀释为不同拷贝数梯度；3待测样品制备按SOLARBIO试剂盒说明书的步骤提取待测样品DNA；4SYBRGREENI荧光定量PCR以标准阳性样品和待测样品分别为模板，F和R为引物进行SYBRGREENI荧光定量PCR反应；5绘制标准曲线和溶解曲线根据标准阳性样品进行SYBRGREENI荧光定量PCR反应结果，绘制标准曲线和溶解曲线；6结果判定当待测样品SYBRGREENI荧光。
4、定量PCR反应曲线呈“S”型，且CT值365、TM值介于86488665之间，判定待测样品中含有须癣毛癣菌；若反应曲线为一条直线，则判断样品中不含须癣毛癣菌。2根据权利要求1所述的一种SYBRGREENI荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，其特征在于，在步骤2中，标准阳性重组菌的质粒DNA的OD260/OD280介于1820之间。3根据权利要求1或2所述的一种SYBRGREENI荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，其特征在于，在步骤2中，拷贝数梯度为101091010拷贝/L的9个梯度。4根据权利要求3所述的一种SYBRGREENI荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，其特征在于，在步骤4。
5、中，SYBRGREENI荧光定量PCR反应体系为2X的SYBRPREMIXEXTAQ125L，10PMOL/L的上游引物F、下游引物R各10L，DNA模板20L，用灭菌超纯水补足至250L。5根据权利要求4所述的一种SYBRGREENI荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，其特征在于，在步骤4中，SYBRGREENI荧光定量PCR反应程序为94预变性60S；94变性30S，54退火30S，72延伸50S，进行40个循环。权利要求书CN104195263A1/4页3一种SYBRGREENI荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法技术领域0001本发明涉及一种兔须癣毛癣菌感染的检测方法，具体涉及一种S。
6、YBRGREENI荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，属于分子生物学领域。背景技术0002须癣毛癣菌是家兔等多种动物皮肤真菌病的最常见病原之一，主要侵害皮肤及其附属物，表现皮屑增多、结痂、脱毛、渗出、毛囊炎及痒感等症状，导致兔营养不良、生长迟缓等，给养兔业带来巨大经济损失。更严重的是，该病还能传染给人，引起人畜共患传染病。所以需要找到一种快速，准确的检测方法，以便及时治疗和控制疫情。0003目前，常见的检测方法包括病料直接显微观察法、病原分离培养法。病料直接显微观察法虽然简单、快速，但却无法鉴别真菌的种类，而且有515的假阴性率；病原分离培养虽然通过菌落、菌丝、孢子的形态，结合生化试验，可以。
7、明确真菌种类，但耗时长，一般为34周，而且有40的假阴性率。0004随着技术的发展，分子生物学方法检测真菌感染得到了一定的应用，包括染色体DNAGC的含量、总DNA同源性、线粒体DNA限制酶断片长度多态分析、随机引物PCR、随机扩增DNA多态性分析、PCR指纹等。其中，采用核糖体DNA区及RRNA小亚基序列分析，特别是ITSANALYSISOFINTERNALTRANSCRIBEDSPACER区分析比对编码RRNA小亚基18SRRNA基因更适应对皮肤真菌的检测，目前，把核糖体DNA区的ITS区序列分析称为皮肤癣菌鉴定的金标准。此方法主要是利用常规PCR的方法对目的基因进行扩增，然后利用电泳观察。
8、，基因序列测定，序列分析等方法，最终通过同源性差异，对皮肤真菌病原做出诊断。但是此方法存在一定的缺陷，主要表现在常规PCR的灵敏度不是特别高、需要PCR后处理、电泳鉴定需要使用有毒性EB染料等方面。发明内容0005为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测时间短、结果直观、敏感度高、定量准确的SYBRGREENI荧光定量PCR方法用于兔须癣毛癣菌的检测。0006为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案0007一种SYBRGREENI荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，其特征在于，包括以下步骤00081引物合成0009上游引物F5GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG3，0010下。
9、游引物R5GGAGACCATCTGTGAGAGTTG3；00112标准阳性样品制备提取标准阳性重组菌的质粒DNA，稀释为不同拷贝数梯度；00123待测样品制备按SOLARBIO试剂盒说明书的步骤提取待测样品DNA；00134SYBRGREENI荧光定量PCR以标准阳性样品和待测样品分别为模板，F和R说明书CN104195263A2/4页4为引物进行SYBRGREENI荧光定量PCR反应；00145绘制标准曲线和溶解曲线根据标准阳性样品进行SYBRGREENI荧光定量PCR反应结果，绘制标准曲线和溶解曲线；00156结果判定当待测样品SYBRGREENI荧光定量PCR反应曲线呈“S”型，且CT值。
10、365、TM值介于86488665之间，判定待测样品中含有须癣毛癣菌；若反应曲线为一条直线，则判断样品中不含须癣毛癣菌。0016前述的一种SYBRGREENI荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，在步骤2中，标准阳性重组菌的质粒DNA的OD260/OD280介于1820之间。0017前述的一种SYBRGREENI荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，在步骤2中，拷贝数梯度为101091010拷贝/L的9个梯度。0018前述的一种SYBRGREENI荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，在步骤4中，SYBRGREENI荧光定量PCR反应体系为2X的SYBRPREMIXEXTAQ125L，10PM。
11、OL/L的上游引物F、下游引物R各10L，DNA模板20L，用灭菌超纯水补足至250L。0019前述的一种SYBRGREENI荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法，在步骤4中，SYBRGREENI荧光定量PCR反应程序为94预变性60S；94变性30S，54退火30S，72延伸50S，进行40个循环。0020本发明的有益之处在于采用SYBRGREENI荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法整个过程仅需要3小时就能得出准确结果，而且一次可以进行96个样品的检测，较其他方法具有操作简单、检测速度快、灵敏度高、特异性强、通量高等优点，能够为疾病的治疗和疫情的控制提供保障。附图说明0021图1是本发明的。
12、一个具体实施例中获得的SYBRGREENI荧光定量PCR标准曲线；0022图2是本发明的一个具体实施例中获得的SYBRGREENI荧光定量PCR溶解曲线；0023图3是本发明的一个具体实施例中获得的一组SYBRGREENI荧光定量PCR检测结果。具体实施方式00241引物合成0025参照GENBANK已发表的须癣毛癣菌基因序列，设计一对特异性引物0026上游引物F5GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG3，0027下游引物R5GGAGACCATCTGTGAGAGTTG3。0028预期扩增片段大小288BP。00292标准阳性样品制备00301准菌株DNA提取0031将须癣毛癣菌标准株接种在土。
13、豆葡萄糖液体培养基，28摇床培养72H，离心收集菌丝，冰箱冷冻保存备用。将菌丝解冻，用液氮研磨，然后按SOLARBIO试剂盒说明书的步骤提取DNA。00322标准阳性重组菌的构建说明书CN104195263A3/4页50033以提取的标准菌株DNA为模板，F和R为引物进行PCR扩增。PCR反应体系为MIX25L，引物各10L，模板DNA40L，加DDH2O补足25L。反应程序为94预变性3MIN；94变性30S，54退火30S，72延伸50S，共35个循环；72再延伸10MIN，于4终止反应，保存备用。0034取5LPCR产物于1琼脂糖凝胶上电泳，在288BP出观察到条带，然后由上海生工生物工。
14、程技术服务公司序列测定正确。0035将PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化后，与PMD18T载体连接，转化大肠杆菌，得到重组菌。0036将重组菌经双酶切和PCR鉴定为阳性，得到标准阳性重组菌。00373提取标准阳性重组的质粒DNA，稀释为不同拷贝数梯度0038按SOLARBIO试剂盒说明书的步骤提取标准阳性重组菌的DNA，测定OD260值和OD280值，OD260/OD280值介于1820的准阳性重组的质粒DNA可用于后续实验。0039根据OD260值计算质粒浓度，并换算成拷贝数，然后以10倍梯度稀释成101091010拷贝/L的9个梯度。拷贝数浓度阿伏加德罗常数/一个碱基对的平均分子量总长度。以稀。
15、释的不同拷贝数的标准阳性样品为模板进行SYBRGREENI荧光定量PCR。00403待测样品制备0041将临床分离的待测菌株接种在土豆葡萄糖液体培养基，28摇床培养72H，离心收集菌丝，冰箱冷冻保存备用。将菌丝解冻，用液氮研磨，然后按SOLARBIO试剂盒说明书的步骤提取DNA，作为待测样品组模板进行SYBRGREENI荧光定量PCR。00424SYBRGREENI荧光定量PCR0043以标准阳性样品待测样品分别为模板，F和R为引物，进行SYBRGREENI荧光定量PCR反应。SYBRGREENI荧光定量PCR反应体系为2X的SYBRPREMIXEXTAQ125L，10PMOL/L的上游引物F。
16、、下游引物R各10L，DNA模板20L，用灭菌超纯水补足至250L；反应程序为94预变性60S；94变性30S，54退火30S，72延伸50S，进行40个循环。00445绘制标准曲线和溶解曲线0045根据标准阳性样品进行SYBRGREENI荧光定量PCR反应结果，采用软件自动分析绘制标准曲线见图1和溶解曲线见图2。00466结果判定0047待测样品SYBRGREENI荧光定量PCR反应曲线呈“S”型见图3，而且结合标准曲线和溶解曲线得出CT值365，且TM值介于为86488665之间，所以判定待测样品中含有须癣毛癣菌。00487SYBRGREENI荧光定量PCR的敏感性和特异性验证实验0049。
17、1敏感性试验0050分别取稀释的101091010拷贝/L的9个梯度标准阳性样品1L为模板进行SYBRGREENI荧光定量PCR和普通PCR，测定SYBRGREENI荧光定量PCR的敏感性，并与普通PCR进行对比。结果发现该方法能检出10拷贝/L的标准阳性样品，而常规PCR只能检出103拷贝/L的标准阳性样品，即SYBRGREENI荧光定量PCR的敏感性是常说明书CN104195263A4/4页6规PCR的100倍。00512特异性实验0052用兔须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌、红毛癣菌、白色念珠菌分离菌株和兔须癣毛癣菌的临床样品的DNA做为模板进行SYBRGREENI荧光定量PCR。结果显示兔须癣毛癣菌的分离株和兔须癣毛癣菌的临床样品的反应曲线呈“S”型，CT值为1825之间；而犬小孢子菌、絮状表皮癣菌、红毛癣菌、白色念珠菌的分离菌株的反应曲线为一条直线，为阴性结果见图3。重复实验CT值变异系数小于5，表明SYBRGREENI荧光定量PCR的特异性强。说明书CN104195263A1/1页70001序列表CN104195263A1/2页8图1图2说明书附图CN104195263A2/2页9图3说明书附图CN104195263A。