技术领域
本发明涉及一种蝉花的固体培养方法，具体涉及一种固定光培养过程中光照时间的人工培养蝉花的方法。
背景技术
中药蝉花为蝉棒束孢Isaria cicadae Miquel(蝉拟青霉Paecilomyces cicadae(Miquel)Samson)寄生在蝉若虫上形成的菌虫复合体，是我国传统著名的中药材之一，其药用比冬虫夏草早800年。蝉花属药食兼用真菌，具有较高的营养价值和特定的功效。蝉花可产生多种在医疗和保健上有重要作用的生理活性物质，包括核苷类、环肽类、多糖类、醇类、甾醇类及有机酸等，在调节免疫、改善肾功能、调节脂类代谢、抗肿瘤、抗疲劳、镇痛、催眠、降压降血糖等方面作用明显。
天然蝉花资源十分有限，再加上野生蝉花因为产地不同、采收时间不一、易被杂菌污染霉变及含重金属等问题，其品质受到质疑。人工培育的蝉花不含重金属，无污染，以及营养成分稳定，因此，越来越受到人们的重视。目前，已经实现了蝉花的工厂化栽培。
人工培育蝉花，是将蝉棒束孢经过斜面种子、摇瓶培养和液体深层发酵获得的液体种子接种到固体基质上先进行暗培养，之后见光培养，最终得到分叉多枝的子实体，经采收干燥即可作食药用原料。原料的产量及活性成分含量对于消费者的感官和品质认同至关重要，而不同的光照时间对于子实体产量和有效活性成分的含量有一定的影响。
目前，人工培养蝉花在光培养阶段所使用的光照时间多为24h，造成了不必要的能源浪费。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种蝉花的固体培养方法，该方法是将蝉花菌种接种到固体培养基上，先后经过暗培养和光培养，并适时采收子实体，即得；其中，光培养阶段采用16-20小时/天的光照。
优选的是，所述蝉花菌种选自扩大培养的蝉花菌种；所述扩大培养包括斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养发酵罐培养等方法中的任意一种或几种。
优选的，所述光培养阶段采用18小时/天的光照。
在一些实施方式中，所述固体培养基为蝉花培养过程中常规的固体培养基，如谷物培养基，可选自小麦、玉米、大米、小米、黄豆粉、荞麦、大麦、燕麦、糙米、粳米中的任意一种或几种；农作物秸杆培养基，如麦秆、玉米杆、棉杆、豆杆、芝麻杆中的任意一种或几种；农作物皮壳培养基，如麸皮、大豆皮、棉籽壳等。优选小麦培养基。
所述接种量为5％～15％；优选为接种量为7％～12％；进一步优选接种量为10％。
所述培养条件为：暗培养阶段培养温度22-24℃，相对湿度为70-85％；光培养阶段培养温度为20-22℃，相对湿度为70-85％。
所述光培养阶段采用复合白光，光照强度为150-250Lx。
本发明的有益效果：本发明在蝉花光培养阶段采用LED白光并进行18h/天的照射，相对于现有技术采用24h全天光照照射而言，取得了如下显著效果：①显著减轻了能源的消耗，延长了灯具及其控制设备的使用寿命；②缩短光照时间不影响子实体外观性状和有效成分含量，其产量还略有增加；③大大减少了产孢量，能明显减少培养过程中粉尘扩散带来的麻烦。
具体实施方式
以下实施例1中所用蝉花菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No 3453(该菌种已在申请号为201110120603.1的发明专利中公开，为已知菌种)。本发明研究表明蝉花菌种类型并不构成影响本发明效果的因素，本发明干燥方法对不同蝉花菌种均能够实现效果。
实施例1蝉花的扩大培养
斜面培养：将菌种接种于斜面试管中，再将接种菌种的斜面试管放入22℃培养箱，培养时间为7天，待菌丝长满试管；
摇瓶培养：在500m1三角瓶中装入200m1液体培养基，在0.11Mpa压力下高压灭菌30分钟，待冷却至室温，将1支斜面试管的菌种接种到500m1三角瓶培养基上，并置于恒温振荡培养箱，温度22±1℃，150转/分钟条件下培养，培养时间为3天；
种子罐培养：在50L气升式发酵罐中装入20L液体培养基，培养基温度大于95℃，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03％，在0.11Mpa压力下，通入蒸汽加热到121℃，并保压30-45分钟；灭菌后，冷却至20℃时，将4瓶上述培养好的500m1摇瓶菌种接入培养基，培养温度为22±1℃，通气量为1：0.5V/V min，保压4.903-7.0845×104Pa，经3天通气培养，达到对数生长期后即可，终培养体积为20L。
发酵罐培养：在500L气升式发酵罐中装入200L液体培养基，培养基温度大于95℃，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03％，在0.11Mpa压力下，通入蒸汽加热到121℃，并保压30-45分钟；灭菌后，冷却至20℃时，将上述培养好的200L种子罐种子全部接入培养，培养温度为22±1℃，通气量为1：0.5V/V min，保压4.903-7.0845×104Pa，经3天通气培养，达到对数生长期后即可。终培养体积为200L。
斜面试管培养基：200g土豆煮汁，20g蔗糖，20g琼脂，余补水至1000ml，pH值为6.5；
摇瓶、种子罐及发酵罐中的液体培养基：30g酵母浸出粉，30g蔗糖，5g大豆水解蛋白，余量补水至1000毫升，pH值为6.5。
实施例2蝉花的固体培养
固体培养基的制备：将小麦清洗控水后，加入适量的水，其重量比为小麦：水为1：1.4，混合均匀；拌匀后装入培养容器中，培养基厚度控制在4cm。将装好培养基的培养容器放置灭菌锅内，121℃下灭菌30-50min；灭菌后，培养容器移置缓冲室内，自然冷却至24℃以下移置接种室内。
接种：接种前培养容器先在超净工作台或百级层流罩内(下)用紫外光照射0.5h；每个培养容器按10％的接种量接种实施例1扩大培养得到的菌种，接种后的容器放入培养室培养。
培养条件：暗培养阶段培养温度为22-24℃，空气相对湿度70-85％；待菌丝体长满培养基时转为光培养，光源采用LED白光，光照强度200Lx，光照时间18小时/天，培养室温度为20-22℃，相对空气湿度70％-85％。培养室要适时通风换气，保持发菌室空气新鲜；至子实体成熟，尚未大量产生孢子(约23～26天)。
实施例3蝉花的固体培养
培养过程与实施例2基本相同，区别在于光照时间为16h。
实施例4蝉花的固体培养
培养过程与实施例2基本相同，区别在于光照时间为20h。
实施例5蝉花的固体培养
培养过程与实施例2基本相同，区别在于光照时间为22h。
实施例6蝉花的固体培养
培养过程与实施例2基本相同，区别在于光照时间为24h。
实施例7采收及干燥
对实施例2～6任一培养的子实体进行采收；采收后的子实体直接进入烘干设备准备烘干。烘干温度60℃，干燥时间4-5h。
光照时间对子实体产量和质量的影响
取实施例2-6培养得到的子实体，按实施例7方法进行采收和干燥，对子实体的产量和质量进行如下评价。
1、光照时间对蝉花子实体外观的影响
10位评分人对每个实施例采收的子实体按照表1的评分标准对其外观颜色进行评分，记录平均值见表2。
表1外观评分标准
颜色 分值 浅黄色-深黄色 15-11 深黄色-暗灰色 10-6 暗灰色-黑色 5-0
表2光照时间对外观颜色的影响
实施例 光培养阶段每天光照时间 平均得分 实施例2 18h/天 13.8 实施例3 16h/天 13.0 实施例4 20h/天 10.4 实施例5 22h/天 12.7 实施例6 24h/天 13.4
结果表明，采用18h进行光培养，子实体颜色为黄色，与其他几种的光照时间组相差不是很大。可见，缩短光照时间至18h/天不影响蝉花子实体的外观形状。
2、光照时间对蝉花产量的影响
计算实施例2～6每1150g固体培养基(干重)子实体产量，结果见表3。
表3光照时间对产量的影响结果(n＝3)
实施例 光培养阶段每天光照时间 产量g/1150g固体培养基 实施例2 18h/天 129.75±8.41 实施例3 16h/天 119.04±6.59 实施例4 20h/天 121.22±6.03 实施例5 22h/天 129.18±9.49 实施例6 24h/天 128.67±9.55
从表3可以看出，给予每天24h光照，子实体产量为128.67g/1150g固体培养基，随着光照时间的缩短，子实体产量逐渐减小，当光照时间为20h/天时，子实体产量仅为121.22g/1150g固体培养基，减少了6％；但是，当给予每天18h光照，子实体产量反而提高，为129.75g/1150g固体培养基，与24h/天光照条件相当。可见，将光培养阶段的光照时间缩短至18h/天，不会引起子实体产量的减少。
此外，本发明意外的发现采用光照18h/天进行培养还能显著降低产孢量，本发明研究表明采用其他几种光照时间进行培养其产孢量在1.2～1.4g/1150g固体培养基，而采用光照18h进行培养，产孢量在0.5～0.8g/1150g固体培养基，这样能明显减少培养过程中粉尘扩散带来的麻烦。
3、光照时间对有效成分含量的影响
分别取实施例2-6培养的蝉花子实体，测定其有效成分腺苷、HEA(即N6-(2-羟乙基腺苷))、多糖含量。
3.1检测方法
3.1.1腺苷和HEA的测定采用高效液相色谱法：
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：Symmetry C18(Waters，4.6mm×250mm，5μm，L.N.0264313291)；流动相：乙腈-0.04mol/L磷酸二氢钾(5:95)；流速：1.0mL/min；检测波长：260nm；柱温：35℃；进样量：10μL。理论塔板数按腺苷峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：取腺苷及HEA对照品适量，精密称定，加50％甲醇水溶液制成25μg/mL的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取0.2g蝉花子实体粉末，精密称定，置20mL具塞试管，精密加入5mL蒸馏水，超声(40KHz)处理30分钟，取出，立即精密加入5mL甲醇，混匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进样时间为20min，测定，在此波长下记录对照品及供试品对应的峰面积，根据浓度换算结果进行计算，即得。
3.1.2多糖的测定按照《保健食品功效成分检测方法》(白鸿主编)的方法。
3.1.3甘露醇采用紫外-可见分光光度法检测
样品提取液的制备：精密称取0.1g蝉花子实体粉末，加入100mL 70％乙醇水溶液，85-90℃水浴回流提取，溶液沸腾5min后，取出，过滤，取滤液，待滤液冷却至室温，用70％乙醇水溶液定容至100mL，摇匀，即为待测样品溶液。
样品甘露醇含量测定：精密移取样品提取液1mL，置15mL具塞试管中，精密加入1mL高碘酸钾溶液，混匀，室温放置10min，再加0.1％L-鼠李糖溶液2mL以除去过多的高碘酸盐，振荡混匀，最后加4mL新鲜配制的Nash试剂，53℃水浴加热15min使其显色，快速冷却至室温。照紫外-可见分光光度法(中华人民共和国药典一部附录VA)，在412nm波长处测定吸光值，带入标准曲线，求出样品甘露醇浓度(mg/mL)，再根据公式计算样品甘露醇含量(mg/g)。
计算公式：
3.2测定结果
结果见表4。
表4光照时间对有效成分含量的影响(n＝3)
固体培养方法 腺苷(％) HEA(％) 多糖(％) 甘露醇(％) 实施例2 0.107±0.004 0.088±0.007 7.27±0.462 5.14±0.387 实施例3 0.111±0.007 0.103±0.009 7.16±0.538 5.21±0.297 实施例4 0.100±0.005 0.094±0.007 7.21±0.665 5.17±0.384 实施例5 0.102±0.008 0.096±0.006 7.13±0.945 5.02±0.257 实施例6 0.097±0.004 0.093±0.021 7.58±0.970 5.18±0.265
结果表明，采用18h进行光培养，其子实体有效成分含量与其他光照时间相比无显著变化，表明采用18h光照射不影响产品内在质量。